李偉強 李 陽 王麗麗 郁有健 朱祝軍

（浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院，浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江杭州 311300）

芥藍（Brassica albograbraL.H.Bailey）是十字花科蕓薹屬一年生或二年生草本植物，以帶葉的菜薹為食用部位，是我國的特產蔬菜之一，其營養(yǎng)豐富，尤其是硫代葡萄糖苷含量較高。硫代葡萄糖苷（glucosinolates，簡稱硫苷）是一類在植物體內合成的含硫、含氮次生代謝產物，主要存在于十字花科植物中，它們的降解產物使得植物具有香、苦、辛辣等味道，是十字花科蔬菜風味和氣味形成的主要前體物質（Bones &Rossiter，2006）。目前鑒定出來的硫苷種類已經(jīng)超過200 種，研究表明大多數(shù)硫苷降解產物具有抗菌、抗蟲以及抗癌等功能（Masahiko et al.，2014；何玲莉 等，2018）。硫苷在癌癥的預防等方面能夠發(fā)揮極大的作用，其被攝入人體后通過腸道的酶解作用分解為異硫氰酸酯，而異硫氰酸酯與致癌物代謝激活的抑制作用有關（Keum et al.，2004）。硫苷合成與調控受多種因素的影響，在硫苷合成的不同階段受到眾多基因調控，同時也受到外部多種因素影響，如外源非生物和生物脅迫以及各種植物激素等（程坤 等，2010；王軍偉，2019）。陳微（2017）在研究外源激素對蘿卜肉質根硫苷含量的影響中發(fā)現(xiàn)，外源茉莉酸甲酯可以增加蘿卜肉質根硫苷的累積，而外源脫落酸處理則抑制蘿卜肉質根硫苷的累積。Jasper 等（2020）在研究溫度對芝麻菜硫苷含量的影響中發(fā)現(xiàn)，高溫能夠增加芝麻菜硫苷的累積，但植株生長和生物量顯著降低。

硒（selenium，Se）是一種重要的稀有元素，對于植物的正常生長發(fā)育及人體和動物維持機體健康、抗癌等方面具有重要作用（李頌 等，2014；許月明 等，2018）。適量的硒元素能夠促進植株在逆境下的生長發(fā)育，增強植物的抗性。研究表明，適宜濃度的硒可以促進番茄、葉用萵苣、菠菜、普通白菜等蔬菜作物的生長、提高產量、改善品質，且能提高植株的抗逆性，但過量的硒對植株卻有毒害作用（Yu &Gu，2007；韓亞文 等，2014；Pezzaressa et al.，2017）。李樂等（2020）研究表明，適宜濃度的硒處理可以增加番茄可溶性固形物含量，改善果實品質，提高產量和礦物質元素含量。Rouhollah 等（2020）研究表明，葉面噴施適量硒溶液可以提高葡萄葉片礦質元素含量，改善植株營養(yǎng)平衡和抗氧化能力，提高耐鹽性。本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）對不同濃度亞硒酸鈉處理的芥藍植株中硫苷組分及含量進行測定和分析，旨在探索硒對芥藍硫苷含量與組分的影響，以期為育種和栽培實踐中高品質芥藍的培育和改良提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

供試芥藍品種為大筍遲花（汕頭市利農種業(yè)有限公司），硒試劑為亞硒酸鈉（Na2SeO3）。試驗于2019 年11 月在浙江農林大學進行，芥藍種子播于人工氣候室的培養(yǎng)蛭石中，生長至3～4 片真葉時挑選長勢一致的幼苗，移栽到10 L 的塑料箱中，每箱定植6 株；采用Hoagland 營養(yǎng)液在人工氣候室中進行培養(yǎng)，光周期為16 h/8 h（晝/夜，下同），溫度為26 ℃/24 ℃，每周更換2 次營養(yǎng)液，培養(yǎng)4周后進行不同濃度硒處理。設置亞硒酸鈉濃度分別為0（CK）、0.5、5、50 μmol · L-1，每處理3 次重復，每重復1 箱。培養(yǎng)48 h 后取樣進行硫苷含量測定，分別采收地上部和根部，迅速用液氮冷凍，真空冷凍干燥后粉碎，超低溫（-80 ℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 硫苷提取及測定方法

硫苷的提取及測定參照Krumbein 等（2005）的方法，并經(jīng)過Zhu 等（2015）改良。稱取0.25 g 凍干樣品，加入70%甲醇溶液4 mL，同時加入5 mmol · L-1的金蓮葡糖硫苷（applichem，USA）200 μL 作為內標。75 ℃水浴鍋水浴10 min，然后5 800 r · min-1離心10 min，收集上清液；剩余沉淀繼續(xù)用70%甲醇提取2 次，合并上清液，定容至10 mL。取5 mL 粗提液，用DEAE Sephadex A25（Amersham Biosciences，Sweden）固相萃取柱進行萃取，待提取液全部流出小柱后加入200 μL 硫酸酯酶（Sigma-Aldrich，USA），室溫反應12 h，然后用5 mL 超純水洗脫，洗脫液用0.45 mm 濾膜過濾。

采用高效液相色譜法（HPLC）測定樣品的硫苷組分與含量。進樣量為20 μL；色譜柱為C-18 反相柱（250 mm × 4 mm，5 μm，Bischoff，Germany），柱溫30 ℃。流動相A（Milli-Q 超純水）和B（乙腈，Tedia 公司）呈梯度變化：0 min，乙腈0；45 min，乙腈20%；46 min，乙腈100%。檢測波長為229 nm，流速1 mL · min-1。根據(jù)液相色譜圖對硫苷各組分進行鑒定，硫苷含量根據(jù)內標的值和響應因子進行計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 芥藍地上部和根中硫苷組分分析

芥藍0 μmol · L-1亞硒酸鈉處理的HPLC 測定結果及詳細信息見圖1 和表1。由圖1 和表1 可知，芥藍地上部和根中分別檢測到9 種和8 種硫苷組分，其中IBE、PRO、SIN、RAA 和NAP 為脂肪族硫苷，4OH、GBC、4ME 和NEO 為吲哚族硫苷；地上部和根中均未檢測到芳香族硫苷。

表1 芥藍地上部和根中的硫苷組分

2.2 不同濃度硒處理對芥藍總硫苷含量的影響

由表2 可知，不同濃度亞硒酸鈉處理對芥藍植株不同部位總硫苷含量的影響不同。與對照相比，5 μmol · L-1亞硒酸鈉處理的芥藍地上部和根部總硫苷含量均顯著增加；0.5 μmol · L-1和50 μmol · L-1亞硒酸鈉處理的地上部總硫苷含量顯著高于對照，而根部總硫苷含量顯著低于對照。

不同濃度亞硒酸鈉處理對芥藍植株不同部位的脂肪族硫苷和吲哚族硫苷含量影響也不同（表2）。3 種濃度亞硒酸鈉處理芥藍地上部脂肪族硫苷含量均顯著高于對照，而吲哚族硫苷含量均與對照無顯著差異。5 μmol · L-1亞硒酸鈉處理芥藍根部吲哚族硫苷含量顯著高于對照，而0.5 μmol · L-1和50 μmol · L-1亞硒酸鈉處理顯著低于對照；3 種濃度亞硒酸鈉處理的芥藍根部脂肪族硫苷含量與對照均無顯著差異。

表2 不同濃度硒處理對芥藍地上部和根中總硫苷、脂肪族硫苷、吲哚族硫苷含量的影響 μmol · g-1（DW）

2.3 不同濃度硒處理對芥藍中各硫苷組分含量的影響

由表3 可知，不同濃度亞硒酸鈉處理對芥藍不同部位硫苷組分含量有重要影響。地上部的IBE、PRO、SIN、4ME、NEO 等5 種硫苷含量均隨著亞硒酸鈉濃度的提高呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢，其中IBE、SIN 和4ME 在5 μmol · L-1亞硒酸鈉處理時含量達到最高值，分別是對照的2.86、4.77 倍和1.68 倍；RAA 在3 個亞硒酸鈉濃度處理下均檢測不到。根部不同濃度亞硒酸鈉處理對各硫苷組分含量的影響程度均小于對地上部的影響，其中3 種濃度亞硒酸鈉處理的PRO、SIN、NAP、GBC 含量均與對照無顯著差異。

表3 不同濃度硒處理對芥藍中各硫苷組分含量的影響

3 結論與討論

本試驗采用高效液相色譜法在芥藍地上部和根中分別檢測到9 種和8 種硫苷組分，其中IBE、PRO、SIN、RAA 和NAP 為脂肪族硫苷，4OH、GBC、4ME 和NEO 為吲哚族硫苷，沒有檢測到芳香族硫苷。此前，何洪巨等（2002）在芥藍中共檢測到7 種硫苷，分別屬于脂肪族硫苷和吲哚族硫苷兩大類；陳新娟（2006）在芥藍葉和薹中共檢測到10 種硫苷，未檢測到芳香族硫苷；司雨等（2009）在不同品種芥藍中共檢測到9 種硫苷，也未檢測到芳香族硫苷。研究表明，不同十字花科蔬菜所含硫苷組分和含量有所不同，甚至同一亞種的不同品種之間硫苷組分與含量也有較大差異（Farnham et al.，2004；Sun et al.，2011）。本試驗中檢測到的9 種硫苷包括了何洪巨等（2002）檢測到的7 種硫苷，但未檢測到陳新娟（2006）檢測到的5-甲基亞硫酰丁基硫苷，且與司雨等（2009）檢測到的硫苷組分也有所不同，這可能是由于試驗所用的芥藍品種不同而導致的。

本試驗結果表明，5 μmol · L-1亞硒酸鈉處理的芥藍地上部和根中總硫苷含量均顯著高于對照，但對不同部位各硫苷組分含量的調控具有不同作用，地上部IBE、SIN、NAP、4OH 和4ME 的含量比對照顯著增加，而根部僅IBE 和4ME 含量顯著增加。研究表明，外源葡萄糖和茉莉酸甲酯處理能顯著提升芥藍硫苷及抗氧化活性物質的累積（苗慧瑩 等，2018）；25 μmol · L-1外源硒處理能夠提高青花菜幼苗中硫苷的含量，并促進其化學防御物質的累積（Avila et al.，2013）。本試驗發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的外源硒處理能夠顯著提高芥藍植株不同組織器官中的硫苷含量，推測其化學防御體系和抗氧化能力也會受到一定影響。此外，十字花科蔬菜的苦味來源于PRO、SIN、GBC、4ME 和NAP，其中SIN是導致十字花科蔬菜具有特殊辛辣味的主要物質（Schonhof et al.，2010；Bell et al.，2018）。本試驗中，芥藍植株地上部PRO、NEO 含量在50 μmol · L-1亞硒酸鈉處理時有所下降，而IBE、SIN、4ME 含量各濃度亞硒酸鈉處理均增加，推測硒處理能夠通過影響芥藍中不同硫苷組分的含量進而使芥藍的風味得以改變，需要進一步深入研究來揭示其具體會產生何種變化。

此前對十字花科作物中硫苷的抗癌性已有較多研究，SIN、RAA 和4OH 等被證明具有防癌及抗癌作用，其中4OH 的降解產物吲哚-3-甲醇具有抑制癌細胞增殖和誘導癌細胞凋亡的作用（Jie et al.，2014；Tripathi et al.，2015；Asuncion et al.，2018）。Almuhayawi 等（2020）研究表明，高CO2濃度處理可以提高青花菜硫苷水平從而使其累積的抗癌活性物質含量升高。本試驗中，芥藍地上部只在對照中檢測到RAA，根部未檢測到RAA；地上部及根部的4OH 含量均在5 μmol · L-1亞硒酸鈉處理時達到最高值。表明適宜濃度的外源硒處理能明顯增加芥藍中4OH 的含量，但不能提升RAA 的含量。研究結果能夠為今后生產實踐中培育具有較高抗癌活性物質的芥藍等十字花科蔬菜作物提供一定的參考。