閆靈芝

（運城學院生命科學系，山西運城 044000）

食品安全是指食品無毒、無害，符合應當有的營養(yǎng)要求，對人體健康不造成任何急性、亞急性或者慢性危害。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，不法商販為了謀取更大的利潤，向食品中添加非法添加物，與此同時由食源性致病菌造成的食品污染事件頻頻爆發(fā)，農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥、獸藥殘留超標問題屢禁不止。國內外的食品安全惡性事件接連不斷的發(fā)生，食品安全問題已經(jīng)成為全球性的大問題。因此，發(fā)展食品安全快速檢測技術對于有害物質的分析尤為重要。

ICTS結合免疫技術和色譜層析技術，作為食品安全快速檢測傳感器的一種，具有操作簡單，檢測快速，成本低廉等特點，這些優(yōu)點也使得試紙條技術對于致病菌[1]、激素殘留[2]、細菌毒素[3]、重金屬[4]以及農(nóng)獸藥殘留[5]等有毒有害物質的檢測越來越廣泛。傳統(tǒng)的免疫層析試紙條主要以膠體金作為標記物，通過金顆粒在檢測線處的聚集對待檢目標物進行定性或者半定量檢測，這種檢測方法檢測靈敏度較低，同時最早的試紙條只能用來檢測單種目標物。為了提升傳統(tǒng)試紙條的檢測性能，眾多研究者做了巨大的努力。本論文主要對近年來試紙條的檢測新技術進行綜述，以期為試紙條的進一步開發(fā)利用提供借鑒。

1 傳統(tǒng)的免疫層析試紙條的檢測原理

傳統(tǒng)的免疫層析試紙條主要由樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊以及聚氯乙烯（Polyvinylchloride，PVC）襯板五部分組成，其相互交疊順序如圖1所示。 同時在硝酸纖維素膜上包被兩條線，檢測線（test line，T線）和質控線（control line，C線）。根據(jù)待檢測物質分子量的大小可以分為雙抗體夾心法和競爭抑制法。

1.1 雙抗體夾心法

雙抗體夾心法主要用來檢測具有多個抗原表位的大分子物質和顆粒性抗原（細菌、病毒和蛋白質等），當樣品溶液滴加到樣品墊時，樣品通過毛細管虹吸作用和金標墊處的金標抗體結合形成待檢抗原-金標抗體復合物，隨著免疫層析的繼續(xù)進行，該復合物會和T線處的捕獲抗體結合，形成捕獲抗體-待檢抗原-金標抗體復合物的夾心結構。未結合的金標抗體和待檢抗原-金標抗體復合物會和C線處的羊抗鼠IgG結合。在雙抗體夾心法中T線處的信號顏色會隨著待檢物的增多而增強。

圖1 免疫層析試紙條示意圖Fig.1 Schematic diagram of ICTS

1.2 競爭抑制法

競爭抑制法主要用來檢測小分子物質（細菌毒素、農(nóng)獸藥殘留以及激素等），這種方法在T線處包被的是捕獲抗原，當把帶有小分子的待檢溶液滴加到樣品墊時，待檢小分子隨著層析的作用會和金標抗體結合形成待檢小分子-金標抗體復合物，該復合物層析到檢測線處時，待檢小分子和捕獲抗原對于金標抗體的特異性位點存在競爭作用，使得只有沒和待檢小分子結合的金標抗體才可以和T線處的捕獲抗原結合，形成捕獲抗原-金標抗體復合物。所以競爭法中小分子濃度越高，檢測線處的信號強度越弱，并且抗體使用量越少，檢測靈敏度也會越高。

2 免疫層析試紙條檢測技術發(fā)展方向

2.1 開發(fā)新型納米標記材料

納米材料是指三維空間尺寸至少有一維尺寸在1～100 nm范圍內的超微粒子，由于其較大的表面積、獨特的光學特性、表面帶電性以及較好的生物相容性，作為免疫層析試紙條的標記物得到了廣泛的應用?；谀z體金試紙條的眾多檢測弊端，為了提升試紙條的檢測性能，近年來研究人員對試紙條的納米標記材料進行了不斷的探索。目前應用于試紙條的納米材料如表1所示。

在免疫層析技術中，單個納米材料表現(xiàn)出的信號強度有限，為了增強試紙條的靈敏度，研究者試圖將單個納米材料富集起來，材料信號的富集提高了試紙條標記信號的發(fā)光強度[30]。Xu等[31]以硅納米棒作為載體，將納米金顆粒修飾到硅納米棒上，納米金顆粒在硅納米棒上的富集增強了試紙條的信號強度，這種方法的檢測靈敏度比常規(guī)膠體金免疫層析試紙條高50倍。Huang等[32]使用四氧化三鐵作為核，二氧化硅為殼的核殼納米材料作為富集量子點的載體進而合成Fe3O4@SiO2@QDs納米材料（圖2），用這種方法檢測豬尿中的鹽酸克倫特羅，檢測靈敏度為0.22 ng·mL?1，比常規(guī)膠體金免疫層析試紙條靈敏度高4倍。Zhang等[33]開發(fā)了以硅納米材料為核量子點為殼的納米材料，該材料以帶正點的聚乙烯亞胺作為中間層，使得許多羧基功能化的量子點富集到硅納米材料表面，使其具有較好的發(fā)光性能。用該納米材料檢測鼠傷寒沙門氏菌，檢測限為5×102cfu· mL?1。也有研究者將菌體作為納米材料的信號富集載體，例如Huang等[34]將納米金顆粒富集在細菌上，以此作為試紙條的信號標簽來檢測食品中的克倫特羅，對克倫特羅的檢測限為0.1 ng mL?1，靈敏度與傳統(tǒng)的膠體金試紙條相比提高了20倍。Bu等[35]利用微生物構建了一種新型的試紙條信號載體，利用納米金顆粒功能化酵母菌和乳酸桿菌，實現(xiàn)富集金納米顆粒的作用進而放大檢測信號（圖3），用該試紙條檢測食品中的赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA），檢測限為0.1 ng·mL?1，與傳統(tǒng)的膠體金試紙條相比靈敏度可以提高8倍。大量的納米材料聚集在一起提高了試紙條的檢測靈敏度，靈敏度的提高降低了試紙條對有毒有害物質檢測的檢測限，對食品安全檢測的意義尤為重要。

2.2 納米材料標記羊抗鼠抗體法

傳統(tǒng)的試紙條是利用納米材料標記單克隆抗體，羊抗鼠抗體只作為質控線上的抗體用來判定試紙條的有效性。但是近年來研究者開始探索將納米材料標記羊抗鼠抗體來提高試紙條的檢測靈敏度。

Yao等[36]使用羧基化的磁性納米粒子標記羊抗鼠抗體（magnetic nanoparticles-goat anti mouse antibody，MNPs-GAMA），并將其和未標記的單克隆抗體一并加入待檢溶液中，用于檢測食品中的β-雌二醇（17β-estradiol，E2），當檢測體系中不存在E2時，檢測溶液中會形成單克隆抗體-GAMA-MNPs復合物，該復合物會隨著免疫層析的作用和檢測線處E2-BSA相結合，形成E2-BSA-單克隆抗體-GAMAMNPs復合物，使得檢測線處呈現(xiàn)MNPs的黃顏色。當檢測體系中存在E2時，E2和E2-BSA對于單克隆抗體的競爭作用，使得檢測線處顏色變淺。用該試紙條檢測食品中的E2，研究發(fā)現(xiàn)和用納米材料標記單克隆抗體的傳統(tǒng)方法相比，檢測靈敏度提高了5倍。同樣的原理，Majdinasab等[37]利用熒光銪納米粒子標記羊抗鼠抗體，用未標記的單克隆抗體捕獲待檢溶液中的OTA，這種方法對于OTA的檢測限可以低至0.4 pg·mL?1，檢測限降低了100倍。

表1 在免疫層析試紙條技術中應用的納米顆粒Table 1 Application of nanoparticles in ICTS

圖2 Fe3O4@SiO2@QDs的結構模型圖[32]Fig.2 Structural model of Fe3O4@SiO2@QDs[32]

圖3 免疫層析技術中利用金納米顆粒功能化微生物[35]Fig.3 Gold nanoparticles-functionalized microorganisms in ICTS[35]

這種方法引起靈敏度提高的原因為如下兩個方面：第一，由于一個單克隆抗體可以捕獲多個MNPs-GAMA，磁性納米粒子的聚集致使信號強度增強；第二，由于在溶液中未標記的單克隆抗體可以和目標分析物更充分的結合，使得單克隆抗體的用量減少，對于檢測小分子的競爭法試紙條來說，單克隆抗體的減少會引發(fā)待檢小分子和小分子-BSA之間對于單抗更激烈的競爭進而提高試紙條檢測的靈敏度。

2.3 待檢目標物攜帶信號法

傳統(tǒng)的免疫層析試紙條是用納米材料標記單克隆抗體，用標記有信號的抗體檢測待檢物質。而近年來，有研究者報道了將待檢測的物質結合上信號而不標記單克隆抗體。

Wang等[38]開發(fā)了一種表面帶正電的富氮碳納米材料（positively charged nitrogen-rich carbon，pNC），以這種材料吸附沙門氏菌，同時也將其作為一種顯色的信號標簽，將單克隆抗體包被在檢測線上。當待檢體系中有沙門氏菌時，將pNC和待檢溶液混合，pNC在靜電作用和氫鍵的作用下捕獲目標菌，最后在免疫層析的作用下被檢測線上的特異性單克隆抗體捕獲，形成pNC-沙門氏菌-抗體的夾心結構。該試紙條對沙門氏菌的檢測限為102cfu·mL?1。Bu等[39]將廣譜的抗生素氨芐青霉素（ampicillin, Amp）引入了免疫層析試紙條技術中，將Amp作為抗體的替代物和目標菌結合，利用羧基化的磁性納米顆粒（magnetite nanoparticles，MNPs）標記Amp，使得形成的MNPs-Amp復合物，該復合物在待檢溶液中具有結合，分離和富集目標菌的能力。同時MNPs自帶的黃色可以作為一種試紙條的識別信號。該方法的特異性由包被在檢測線上的特異性單克隆抗體識別。試紙條對食品中腸炎沙門氏菌的檢測范圍可以達到102～103cfu·mL?1。同時Bu等[40]將革蘭氏染色的方法和免疫層析試紙條技術相結合，當待檢溶液中存在目標菌時，目標菌可以通過一步染色法和結晶紫結合，結晶紫的紫色也可以作為試紙條的識別信號。包被于檢測線上的高特異性的單克隆抗體可以保證對目標菌檢測的特異性。這種方法可以在11 min內完成對沙門氏菌的檢測，檢測限可以達到80 cfu mL?1。Wang等[41]利用甘露糖和細菌鞭毛中的FimH蛋白特異性的識別機制，把甘露糖組裝到普魯士藍納米顆粒上用來檢測大腸桿菌O157:H7，當樣品中存在大腸桿菌時，普魯士藍納米顆粒上的甘露糖會和大腸桿菌相結合，隨著免疫層析的進行，大腸桿菌-普魯士藍納米顆粒復合物會和T線處的單克隆抗體結合。這種方法對于大腸桿菌的定量檢測范圍為102～108cfu·mL?1。對于致病菌的檢測，傳統(tǒng)的試紙條通常采用雙抗體夾心方法，需要可以和致病菌不同位點結合的一對特異性抗體，而該方法僅需要一種抗體包被于檢測線，用于目標菌的特異性識別，最終使得檢測成本大大降低。

2.4 染色法

傳統(tǒng)的試紙條信號強度較弱，為了提高試紙條的檢測信號，研究者試圖通過染色的方法使得檢測信號進一步增強。Huang等[42]開發(fā)了一種鉑染色的方法，這種方法首先利用膠體金試紙條對待檢目標物進行識別和捕獲進而實現(xiàn)定性和半定量檢測，緊接著把檢測區(qū)域剪下來進行染色，在硝酸銀和對苯二酚存在的情況下，會在檢測區(qū)域的納米金上包裹銀殼（Au@AgNPs），接著在H2PtCl6和抗壞血酸溶液中，檢測區(qū)域的Au@AgNPs上包裹鉑殼最終會形成Au@AgPtNPs。經(jīng)過一系列的染色，試紙條的檢測靈敏度大幅提高。銀染色法是在銀鹽溶液和對苯二酚存在的條件下，銀離子被膠體金試紙條上的金納米顆粒催化成金屬銀，進而沉積在納米金顆粒表面，不僅使得粒子尺寸變大，也會形成更容易區(qū)分的黑色檢測區(qū)，最終也提高檢測靈敏度[43?44]。Yu等[45]用銀染色法對玉米樣品中的伏馬毒素B1（fumonisin B1,FB1）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）進行檢測，在最優(yōu)條件下對它們的檢測限分別為2.0和40 ng mL?1。和傳統(tǒng)的膠體金試紙條相比，靈敏度最少提高2倍。金染色法是以氯金酸（HAuCl4）和鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）作為增強試劑，在膠體金試紙條檢測完畢后，通過滴加該增強試劑，膠體金試紙條上的金納米顆粒會催化HAuCl4和NH2OH·HCl形成新的金顆粒，并覆蓋到原始的納米金顆粒上使得檢測區(qū)域顏色變深，進而提高了檢測靈敏度[46]。Bu等[47]利用金染色法對牛奶中的腸炎沙門氏菌進行檢測，檢測限為104cfu·mL?1，相比于傳統(tǒng)的膠體金試紙條，檢測靈敏度提高了100倍。

上述方法中需要額外的步驟對試紙條進行染色，最終使得檢測時間延長。Kim等[48]在試紙條中引入核-殼納米纖維，該納米纖維的殼由水溶性的聚合物組成，核心分別由銀鹽溶液試劑和對苯二酚組成，這些納米纖維通過靜電紡絲技術而直接沉積到硝酸纖維素膜T線的前端。隨著樣品的加入，可溶性的納米纖維中的銀鹽溶液試劑和對苯二酚會隨著免疫層析的進行而溶解出來，進而在檢測線處的金納米顆粒上沉積上銀顆粒，最終使得T線處的顏色變黑。用該種方法可使得檢測限提高10倍，同時不會增加檢測的時間（圖4）。

圖4 核殼納米纖維沉積試紙條的原理圖[48]Fig.4 Schematic of a core-shell nanofiber-deposited test strip[48]

2.5 雙結合墊法

傳統(tǒng)的試紙條使用單個結合墊，結合墊上結合的是納米材料標記的抗待檢目標物的單克隆抗體（納米材料-Ab1），這種方法表現(xiàn)出的信號強度較弱，為了提高試紙條的檢測性能，研究者開始突破試紙條傳統(tǒng)結構的限制，開發(fā)了帶有雙結合墊的免疫層析試紙條。在雙結合墊方法中，一種方法是在第二個結合墊上結合納米材料標記的抗牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）的單克隆抗體（納米材料-Ab2），由于在納米材料標記單克隆抗體的過程中，會用到BSA來封閉納米材料表面的剩余位點，所以納米材料-Ab2會和納米材料-Ab1上的BSA結合，形成納米材料-Ab2-納米材料-Ab1復合物，進而實現(xiàn)了納米材料的聚集，提高了信號強度[49?50]。

第二種方法是在第二個結合墊上結合納米材料標記的羊抗鼠抗體（納米材料-GAMA），利用GAMA可以和待檢目標物的單克隆抗體結合的原理，隨著免疫層析的進行會形成納米材料-GAMA-Ab1-納米材料復合物，納米材料的聚集也提高了檢測信號的強度[51]。

第三種方法是引入生物素（biotin）-鏈霉親和素（streptavidin）系統(tǒng)，在第一個結合墊上結合納米材料標記生物素化的單克隆抗體（納米材料-BAb），第二個結合墊上結合納米材料標記的鏈霉親和素（納米材料-Sa），隨著免疫層析的進行會形成納米材料-BAb-Sa-納米材料復合物，也實現(xiàn)了納米材料的聚集進而提高了檢測的靈敏度[52]。

2.6 多元檢測法

傳統(tǒng)的免疫層析試紙條主要用來檢測單一的目標物，為了提高試紙條的檢測效率，研究人員設計了可以同時檢測多種目標物質的試紙條。

為了實現(xiàn)多元檢測，一種方法是利用單一的納米顆粒標記多種抗待檢目標物質的抗體，同時在試紙條上面設計多條檢測線[53]。Kong等[54]開發(fā)了基于金納米顆粒的免疫層析試紙條用來檢測谷類食物樣品中的20多種霉菌毒素，屬于玉米赤霉烯酮類、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇類、T-2毒素類、黃曲霉毒素類和伏馬毒素類五個大類。整個檢測過程共耗時20 min，大大提高了檢測速度。第二種方法是采用多種顏色的納米材料對多種目標物質進行檢測，每種目標物質對應的檢測線的顏色均不同，便于更好地區(qū)分待檢物質[55]。Wu等[56]合成四種顏色的金納米材料（圖5），分別為紅色的金納米球（gold nanospheres，AuNSs），紫色的金納米仙人掌（gold nanocacti，AuNCs），藍色的金納米花（gold nanoflowers，AuNFs）和黑色的分枝金等離子體黑體（hyperbranched Au plasmonic blackbodies，AuPBs），用這四種金納米材料分別對FB1，玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN），OTA，和黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1, AFB1）進行同時檢測，檢測限分別為3.27、0.70、0.10和0.06 ng·mL?1。Taranova等[57]利用在625、585和525 nm波長處具有最大發(fā)射峰而呈現(xiàn)出紅色、黃色和綠色的多色量子點開發(fā)了一種“交通信號燈”的免疫層析試紙條，利用該試紙條對牛奶中氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、氯霉素（chloramphenicol，CAP）和鏈霉素（streptomycin，STM）三種抗生素同時進行檢測。對這三種目標物質的檢測限為0.3, 0.12和0.2 ng mL?1。在使用相同抗體的條件下，檢測限比酶聯(lián)免疫吸附方法低80～200倍。

圖5 基于多色金納米材料的免疫層析試紙條傳感器示意圖[56]Fig.5 Schematic illustration of multicolor AuNP-based multiplex ICTS nanosensor[56]

2.7 物理阻礙作用法

在免疫層析技術中通過減小紙張的空隙和減慢液體流動的速度可以提高試紙條的檢測性能。Quesada-González等[58]將纖維素納米纖維（cellulose nanofbers，CNF）噴涂到免疫層析試紙條的檢測區(qū)域，CNF浸入到硝酸纖維素膜的空隙內部，進而減小了檢測區(qū)域膜的孔徑。這種修飾使得檢測區(qū)的抗體更接近試紙條表面，最終使得試紙條表面金納米顆粒的結合數(shù)量增多，使得檢測靈敏度提高了36.6%（圖6）。Wu等[59]在試紙條下面放置磁鐵以提供外加磁場，該磁場會和試紙條上的磁性納米標記材料Fe3O4@Au相互作用，減慢了免疫試劑的流動速度同時增加了試劑之間的相互作用時間，最終使得檢測靈敏度提高。Choi等[60]通過在試紙條上增加玻璃纖維分流墊以及在試紙條上設置聚二甲基硅氧烷障礙點來減慢免疫試劑在試紙條上的流動速度，同時也增加了試劑之間的反應時間，用該方法檢測乙型肝炎病毒，使得檢測靈敏度提高了10倍。

圖6 檢測線處沒有修飾（上）和修飾纖維素納米纖維（下）的原理圖[58]Fig.6 Schematic representation of TL not modified (up) and modified with cellulose nanofibers dispensed (down)[58]

2.8 淬滅熒光法

Morales-Narváez等[61]使用量子點代替?zhèn)鹘y(tǒng)試紙條質控線上的羊抗鼠抗體，在檢測線處包被量子點標記的檢測抗體（Ab-QDs），同時結合氧化石墨烯對于量子點的淬滅能力對大腸桿菌進行檢測。在有目標檢測菌大腸桿菌存在的情況下，大腸桿菌可以和檢測線處的Ab-QDs結合形成Ab-QDs-大腸桿菌復合物，緊接著在試紙條上滴加氧化石墨烯，大腸桿菌的存在阻礙了量子點和石墨烯之間的能量轉移，此時石墨烯不能淬滅量子點的熒光。而在沒有目標菌存在的情況下，檢測線處Ab-QDs的熒光可以被石墨烯淬滅。這種方法對瓶裝水和牛奶中的大腸桿菌的檢測限為100 cfu·mL?1。Hassan等[62]用該種方法對牛肉餡和河水中的大腸桿菌O157:H7進行檢測，對牛肉 餡 的 檢 測 限 為178 cfu·g?1，河 水 的 檢 測 限 為133 cfu·mL?1。檢測靈敏度相比傳統(tǒng)的試紙條提高了1000倍，同時量子點代替羊抗鼠抗體也使得檢測成本降低了60%。

2.9 多種模式讀取信號法

傳統(tǒng)的膠體金試紙條主要是根據(jù)試紙條上納米標記材料的顏色進行比色來判斷結果，近年來，研究者開發(fā)出了既能肉眼比色檢測也能使得試紙條可以通過一定的化學反應進行定量分析結果的試紙條。

Ouyang等[63?64]通過使用魯米諾還原氯金酸制備出了魯米諾還原的金納米粒子（Luminol-reduced gold nanoparticles，LuReGNPs），該方法以LuReGNPs在試紙條上的紅顏色作為定性和半定量的判定結果，在免疫層析過程完成后，將檢測區(qū)域剪下來放入微孔板的孔內，在孔內加入辣根過氧化物酶（HRP）和過氧化氫，最終可收集到另外的化學發(fā)光信號，此信號可以作為定量檢測的依據(jù)。用該方法檢測農(nóng)藥殘留，對甲基對硫磷和甲氰菊酯的檢測限分別為0.17 ng·mL?1和0.10 ng·mL?1。同時Ouyang等[27]以MnO2納米花作為試紙條的信號標簽，檢測線處表現(xiàn)出MnO2納米花的棕色可以作為定性和半定量的檢測信號，同時MnO2納米花對魯米諾-H2O2化學發(fā)光體系具有顯著的影響，也可以通過剪下檢測區(qū)域來收集化學發(fā)光信號，用該方法對毒死蜱的檢測限為0.033 ng·mL?1。同理Ouyang等[22]也開發(fā)了g-C3N4/BiFeO3納米符合材料，通過雙信號讀出對毒死蜱和西維因進行檢測，對它們的檢測限為0.033 ng·mL?1。Wang等[41]使用普魯士藍納米顆粒開發(fā)了三種讀出模式的試紙條，分別為肉眼定性檢測，軟件分析檢測線信號強度進行定量檢測，以及利用普魯士藍納米顆粒的過氧化物酶活性催化四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色的比色信號進行定量檢測。

3 結語

ICTS經(jīng)過多年的發(fā)展已經(jīng)較為成熟，在眾多領域已經(jīng)實現(xiàn)商品化應用。本文簡要總結了近年來該技術相比于傳統(tǒng)的膠體金試紙條的改進方向，盡管ICTS性能有很大的提升，但在實際應用方面仍然存在很多的問題。目前，主要面臨的問題及發(fā)展的趨勢簡述如下：（1）試紙條技術中對于有害物質的特異性分析依賴于單克隆抗體，但是單克隆抗體制備速度較慢，需要消耗大量的人力物力，快速地開發(fā)廉價、高親和力的單克隆抗體仍然是目前的一大挑戰(zhàn)，隨著納米抗體在免疫分析中的應用越來越廣泛，未來可以考慮將納米抗體應用于ICTS[65?66]。（2）有些納米標記材料的合成需要嚴苛的化學反應條件，同時合成時間較長，開發(fā)可以在溫和條件下快速合成的納米材料對ICTS具有重要的作用。（3）檢測樣品的復雜成分會影響試紙條的檢測靈敏度，降低檢測基質對于試紙條的檢測性能的影響對檢測性能的提高具有重要的意義。（4）ICTS準確的檢測信號讀出依賴于信號讀出設備，開發(fā)簡易便攜便宜的小型儀器也是未來的發(fā)展趨勢。