郭 超童希洋＃秦偉偉梁榮耀巫興東王 真相 婷譚寧華*

（1.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥制藥系，江蘇 南京211198； 2.揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司，北京102206）

哮喘是一類由氣道慢性炎癥引發(fā)的常見呼吸道疾病，其發(fā)病受到遺傳因素及環(huán)境因素的雙重作用［1］，始動(dòng)環(huán)節(jié)是炎癥引起氣道上皮細(xì)胞損傷，IL?4、IL?5 等炎癥因子在病情發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用［2］。氣道重塑是呼吸道中炎性細(xì)胞對(duì)氣道的浸潤(rùn)及損傷氣道上皮細(xì)胞進(jìn)而釋放趨化因子、生長(zhǎng)因子等導(dǎo)致氣道的代償性修復(fù)［3］，其長(zhǎng)期持續(xù)時(shí)會(huì)超過(guò)機(jī)體的代償能力，將引發(fā)氣道結(jié)構(gòu)的病理改變，重要特征之一是支氣管平滑肌異常增殖所導(dǎo)致的增生［4］。JAK／STAT 信號(hào)通路廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，對(duì)機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，也與多種細(xì)胞功能及生理病理過(guò)程密切相關(guān)，它可調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制支氣管平滑肌細(xì)胞增殖，最終緩解氣道重塑［5?6］，故闡明其參與哮喘相關(guān)疾病的研究具有重要意義。

蘇黃止咳膠囊是由國(guó)醫(yī)大師晁恩祥教授根據(jù)多年臨床實(shí)踐總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，并于2008 年2 月由國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，是目前臨床上唯一治療感冒后咳嗽和咳嗽變異型哮喘的中成藥［7］，該制劑由蜜炙麻黃、紫蘇葉、地龍、蟬蛻、炒牛蒡子、五味子、前胡、蜜炙枇杷葉、炒紫蘇子9 味中藥按一定比例及工藝加工制成，具有止咳、抗炎、平喘、祛痰、免疫調(diào)節(jié)的功效［8］，課題組前期對(duì)其揮發(fā)性成分、非揮發(fā)性成分、HPLC 指紋圖譜進(jìn)行了研究［9?11］。目前，關(guān)于蘇黃止咳膠囊的文獻(xiàn)報(bào)道大多集中在其臨床療效及藥理活性［12?13］；課題組前期發(fā)現(xiàn)，該制劑可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)NLRP3 炎癥小體活化來(lái)減輕氣道炎癥，進(jìn)而達(dá)到改善咳嗽變異型哮喘的癥狀［14］，其祛痰機(jī)制是促進(jìn)結(jié)腸內(nèi)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）產(chǎn)生，進(jìn)而經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至肺部，并通過(guò)EGFR?MUC5AC 信號(hào)通路來(lái)改善肺部炎癥，從而促進(jìn)痰液排出［15］；本實(shí)驗(yàn)旨在從調(diào)節(jié)JAK／STAT 信號(hào)通路探討它緩解哮喘氣道重塑的作用機(jī)制，以期為闡明其平喘機(jī)制及臨床使用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性健康普通級(jí)豚鼠36 只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自江蘇省南京市青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2017?0011，在清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，每天光照12 h，保持溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度40%～70%，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 細(xì)胞株 大鼠支氣管平滑肌細(xì)胞（RBSMCs），購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。

1.3 試劑與藥物 蘇黃止咳膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字YBZ00172008），購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕有限公司；硫酸沙丁胺醇片（批號(hào)E170403），購(gòu)自江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司。卵清蛋白（OVA，批號(hào)90065913），購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；Al（OH）3（批號(hào)20161031），購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；MTT（批號(hào)ST315），購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；豚鼠白介素?4（IL?4）、豚鼠白介素?5（IL?5）、豚鼠組胺酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Kejian 公 司；氨茶堿（批號(hào)G170103），購(gòu)自南通飛宇生物科技有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基及胎牛血清，購(gòu)自以色列BI 公司；兔 抗Cyclin D1、CDK4、E2F、Rb1、ERK、Phospho?ERK、p27、STAT3、PCNA、Akt 抗體，購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；兔抗p21 抗體，購(gòu)自美國(guó)EPIT Mics 公司；兔抗Cyclin A、Phospho?Rb、Phospho?STAT3、Phospho?JAK2、JAK2 抗體，購(gòu)自美國(guó)Affbiotech公司；兔抗 Phospho?Akt抗體、GAPDH 抗體、兔二抗，購(gòu)自美國(guó)CST 公司。

1.4 儀器 DMi8 型倒置顯微鏡、DMi1 型熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；M491 型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；Tanon 2600 型凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（美國(guó)Bio?Rad公司）；電子分析天平［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

2.1.1 分組 36 只豚鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，蘇黃止咳膠囊低、中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組（沙丁胺醇，抑制肥大細(xì)胞等致敏細(xì)胞釋放過(guò)敏介質(zhì)而達(dá)到平喘目的），每組6 只。

2.1.2 造模 除正常組外，其余各組豚鼠均腹腔注射1 mg／mL OVA 和10 mg／mL Al（OH）3混懸液1 mL，正常組豚鼠腹腔注射等量生理鹽水，1 周后相同方法處理各組豚鼠進(jìn)行加強(qiáng)致敏，并于每天給藥1 h 后進(jìn)行霧化刺激。具體方法為將豚鼠置于大玻璃燒杯中，杯口用保鮮膜罩住，留有一口與超聲霧化器連接，將1%OVA 溶液倒入霧化器槽內(nèi)，打開開關(guān)進(jìn)行霧化刺激，時(shí)間90 s，每隔1 d 進(jìn)行1 次，共7 次。

2.1.3 給藥 第3 周對(duì)豚鼠進(jìn)行灌胃給藥，每天于同一時(shí)間進(jìn)行1 次，連續(xù)2 周，其中蘇黃止咳膠囊（每粒相當(dāng)于4.5 g 生藥）用生理鹽水制成適宜質(zhì)量濃度的溶液。各組給藥劑量及體積分別為蘇黃止咳膠囊低、中、高劑量組1.5、3、6 g／kg，陽(yáng)性對(duì)照組5 mg／kg，正常組、模型組豚鼠灌胃給予等體積生理鹽水。

2.2 咳喘潛伏期測(cè)定 于末次給藥1 h 后，用1%OVA 霧化刺激引喘豚鼠，記錄各組咳喘潛伏期。

2.3 氣管病理變化觀察 處死豚鼠，立即分離出氣管，10%福爾馬林固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其平滑肌增生情況，通過(guò)Image pro?plus 軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，分別選取2 個(gè)最大直徑的氣管壁進(jìn)行測(cè)定，其氣管平滑肌厚度分別設(shè)為T1、T2，取2 個(gè)氣管面管腔內(nèi)周長(zhǎng)（PI）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以［（T1＋T2）／PI］ ×100%表示。

2.4 肺組織病理變化觀察 處死豚鼠，立即分離出肺組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切出厚度為4 μm 的組織切片，HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化，并對(duì)圖像結(jié)果進(jìn)行分析。

2.5 肺組織IL?4、IL?5、組胺水平檢測(cè) 取豚鼠肺組織適量，加入預(yù)冷含PMSF 的PBS 緩沖液充分勻漿，離心后取上清，采用BCA 法測(cè)定總蛋白表達(dá)，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)IL?4、IL?5、組胺水平與相應(yīng)總蛋白表達(dá)的比值，即為三者相對(duì)值。

2.6 肺組織ERK 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。取豚鼠肺組織適量，加入預(yù)冷含PMSF 的RIPA 裂解液充分勻漿，離心后取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白表達(dá)，樣品經(jīng)SDS?PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯影等過(guò)程后得到目的蛋白條帶，通 過(guò)Image pro?plus軟件處理?xiàng)l帶，得到p?ERK、ERK 灰度值，兩者比值即為ERK 相對(duì)值。

2.7 豚鼠離體氣管舒張率測(cè)定 處死健康豚鼠，剝離出頸部氣管，制成適宜長(zhǎng)度的螺旋條，轉(zhuǎn)移至恒溫灌流槽內(nèi)，槽中有K?H 液，預(yù)先通入95% O2和CO2混合氣體，調(diào)節(jié)恒溫裝置維持灌流槽內(nèi)溫度37 ℃，予以1.5 g 起始張力，待其平衡穩(wěn)定后，將灌流裝置與BL?420 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)采集系統(tǒng)相連接，記錄一段正?；顒?dòng)曲線，每15 min 換液1 次，共3 次，加入10 mL K＋溶液，孵育10 min 以引發(fā)收縮，10 mL K?H 液洗去K＋溶液，每15 min 1 次，共3 次，末次換液時(shí)灌流槽中加入10 mL K?H 液，隨即滴加100 μL 組胺工作液使其終濃度為0.3 mmol／L，觀察張力曲線，待氣管收縮張力達(dá)峰值時(shí)并穩(wěn)定5 min 后，分別加入125、250、500 μg／mL蘇黃止咳膠囊及50 μg／mL 陽(yáng)性藥氨茶堿（抑制Ca2＋變化達(dá)到松弛平滑肌，改善平滑肌細(xì)胞增殖），以給予組胺后的張力曲線為陰性對(duì)照組，記錄灌流槽中氣管條張力，計(jì)算舒張率，公式為舒張率＝［（加入組胺后張力－加入藥物后張力）／加入組胺后張力］ ×100%。

2.8 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用MTT 法。用含10%胎牛血清的RPMI?1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)RBSMCs，取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，以0.3 mmol／L 組胺誘導(dǎo)后加藥處理48 h，其中蘇黃止咳膠囊低、中、高劑量組劑量分別為125、250、500 μg／mL，氨茶堿組劑量為50 μg／mL。在96 孔板中加入20 μL MTT（終張力質(zhì)量濃度0.5 mg／mL），37 ℃下孵育4 h，棄去液體，加入150 μL DMSO 至充分溶解為藍(lán)紫色溶液，采用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞各孔光密度（OD），重復(fù)3 次，取平均值，觀察RBSMCs 增殖情況。

2.9 PCNA 熒光強(qiáng)度檢測(cè) 采用免疫熒光法。RB?SMCs 細(xì)胞接種在24 孔板上，待細(xì)胞生長(zhǎng)到適宜的濃度后用50 μmol／L 組胺和藥物處理24 h，其中蘇黃止咳膠囊低、中、高劑量組分別為125、250、500 μg／mL，氨茶堿組為50 μg／mL。取處理后的24 孔板，冷PBS 緩沖液浸洗24 孔板3 次，每次3 min，0.4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X?100 室溫通透，BSA 溶液封閉，PCNA 一抗孵育4 ℃過(guò)夜，PBS 緩沖液浸洗3 次，每次5 min，吸掉孔板內(nèi)緩沖液，在避光條件下滴加熒光二抗工作液，孵育30 min，PBS 緩沖液浸洗3 次，每次5 min，每孔加入80 μL DAPI 避光孵育10 min，在熒光顯微鏡下觀察圖像。

2.10 Ca2＋熒光強(qiáng)度檢測(cè) 取處理后的細(xì)胞，往24孔板中加入150 μL Fluo?4／AM 工作液，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖像，通過(guò)Image pro?plus 軟件處理圖片。

2.11 細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。取處理后的細(xì)胞，加入預(yù)冷RIPA 裂解液和PMSF 制備蛋白樣品，經(jīng)SDS?PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體、顯影等過(guò)程，通過(guò)Image?ProPlus 軟件得到相應(yīng)蛋白灰度值，計(jì)算磷酸化蛋白與其對(duì)應(yīng)灰度值或內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值來(lái)反映上述目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)GraphPad Prism 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蘇黃止咳膠囊對(duì)OVA 誘導(dǎo)哮喘豚鼠潛伏期的影響 如圖1 所示，模型組豚鼠引喘潛伏期相較于正常組豚鼠降低（P＜0.01）；蘇黃止咳膠囊各劑量相對(duì)于模型組，豚鼠咳喘潛伏期延長(zhǎng)，并呈劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01）；陽(yáng)性對(duì)照組也有明顯作用（P＜0.01）。

圖1 蘇黃止咳膠囊對(duì)OVA 誘導(dǎo)哮喘豚鼠咳喘潛伏期的影響Fig.1 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on cough latency in OVA?induced guinea pigs

3.2 蘇黃止咳膠囊對(duì)OVA 誘導(dǎo)哮喘豚鼠氣管的病理變化的影響 如圖2 所示，與正常組比較，模型組豚鼠氣管平滑肌層結(jié)構(gòu)模糊，出現(xiàn)增厚現(xiàn)象（P＜0.05）；相較于模型組，蘇黃止咳膠囊中、高劑量組改善氣管平滑肌層結(jié)構(gòu)（P＜0.05，P＜0.01），陽(yáng)性對(duì)照組亦然（P＜0.01）。

圖2 蘇黃止咳膠囊對(duì)OVA 誘導(dǎo)哮喘豚鼠氣管病理變化的影響Fig.2 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the trachea pathological changes of OVA?induced guinea pigs

3.3 蘇黃止咳膠囊對(duì)OVA 誘導(dǎo)哮喘豚鼠肺組織病理改變的影響 如圖3 所示，與正常組比較，模型組豚鼠肺泡隔增厚，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織結(jié)構(gòu)模糊，管腔內(nèi)出現(xiàn)大量滲出物（P＜0.01）；與模型組比較，蘇黃止咳膠囊各劑量組、沙丁胺醇組均改善肺部病理情況（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 蘇黃止咳膠囊對(duì)OVA 誘導(dǎo)哮喘豚鼠肺組織病理改變的影響Fig.3 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the lung tissue pathological changes of OVA?induced guinea pigs

3.4 蘇黃止咳膠囊對(duì)OVA 誘導(dǎo)哮喘豚鼠肺組織中IL?4、IL?5 和組胺水平的影響 如圖4 所示，模型組豚鼠IL?4、IL?5、組胺水平較正常組升高（P＜0.01）；與模型組比較，蘇黃止咳膠囊中、高劑量組及沙丁胺醇組抑制三者產(chǎn)生（P＜0.01）。

圖4 蘇黃止咳膠囊對(duì)OVA 誘導(dǎo)哮喘豚鼠肺組織中IL?4、IL?5、組胺水平的影響Fig.4 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the levels of IL?4，IL?5 and histamine in the lung tissue of OVA?induced guinea pigs

3.5 蘇黃止咳膠囊對(duì)OVA 誘導(dǎo)哮喘豚鼠肺組織中ERK 蛋白表達(dá)的影響 如圖5 所示，與正常組比較，模型組豚鼠肺組織中ERK 蛋白磷酸化增加（P＜0.05）；相較于模型組，蘇黃止咳膠囊中、高劑量組及沙丁胺醇組抑制ERK 蛋白磷酸化（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 蘇黃止咳膠囊對(duì)OVA 誘導(dǎo)哮喘豚鼠肺組織中ERK 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the protein expression of ERK in the lung tissue of OVA?induced guinea pigs

3.6 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)豚鼠離體氣管舒張率的影響 如表1 所示，蘇黃止咳膠囊呈劑量依賴性地增加組胺誘導(dǎo)豚鼠離體氣管的舒張率（P＜0.05，P＜0.01），氨茶堿組亦然（P＜0.01）。

表1 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)豚鼠離體氣管舒張率的影響（， n＝6）Tab.1 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the re?laxation rate of histamine?induced isolated trachea in guinea pigs（， n＝6）

表1 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)豚鼠離體氣管舒張率的影響（， n＝6）Tab.1 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the re?laxation rate of histamine?induced isolated trachea in guinea pigs（， n＝6）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.7 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 增殖的影響 如圖6 所示，與正常組比較，模型組OD值升高（P＜0.01）；相對(duì)于模型組，蘇黃止咳膠囊高劑量組、氨茶堿組OD值降低（P＜0.05）。

圖6 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 增殖的影響Fig.6 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the cell proliferation of histamine?induced RBSMCs

3.8 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 中PCNA蛋白表達(dá)的影響 如圖7 所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中PCNA 蛋白熒光強(qiáng)度增加（P＜0.01）；與模型組比較，蘇黃止咳膠囊中、高劑量組及氨茶堿組PCNA 蛋白熒光強(qiáng)度降低（P＜0.01）。

圖7 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 中PCNA 蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the protein expression of PCNA in histamine?induced RBSMCs

3.9 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 中Ca2＋濃度的影響 如圖8 所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中Ca2＋濃度升高（P＜0.01）；與模型組比較，蘇黃止咳膠囊中、高劑量組及氨茶堿組細(xì)胞中Ca2＋濃度降低（P＜0.01）。

圖8 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 中Ca2＋濃度的影響Fig.8 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on Ca2＋concentration in histamine?induced RBSMCs

3.10 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 中JAK2、STAT3、Akt 蛋白表達(dá)的影響 如圖9 所示，與正常組比較，模型組p?JAK2、p?STAT3、p?Akt 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，蘇黃止咳膠囊中、高劑量組及氨茶堿組p?JAK2、p?STAT3、p?Akt 蛋白下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖9 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 中JAK2、STAT3、Akt 蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the protein expressions of JAK2，STAT3 and Akt in histamine?induced RBSMCs

3.11 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響 如圖10 所示，與正常組比較，模型組Cyclin D1、CDK4、p?Rb、E2F 蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；與模型組比較，蘇黃止咳膠囊中、高劑量組及氨茶堿組Cyclin D1、CDK4、p?Rb、E2F 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖10 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 中Cyclin D1、CDK4、Rb、E2F 蛋白表達(dá)的影響Fig.10 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the protein expressions of Cyclin D1，CDK4，Rb and E2F in histamine?induced RBSMCs

3.12 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 細(xì)胞周期抑制蛋白p21、p27 表達(dá)的影響 如圖11 所示，蘇黃止咳膠囊劑量依賴性地增加p21、p27 蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），氨茶堿組亦然（P＜0.01）。

圖11 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 中p21、p27 蛋白表達(dá)的影響Fig.11 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the protein expressions of p21 and p27 in histamine?induced RBSMCs

3.13 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 中ERK蛋白表達(dá)的影響 如圖12 所示，與正常組比較，模型組p?ERK 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；相較于模型組，蘇黃止咳膠囊中、高劑量組及氨茶堿組p?ERK 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。

圖12 蘇黃止咳膠囊對(duì)組胺誘導(dǎo)RBSMCs 中ERK 蛋白表達(dá)的影響Fig.12 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the pro?tein expression of ERK in histamine?induced RBSMCs

4 討論

氣道重塑是慢性頑固性哮喘的病理基礎(chǔ)［3］，通常會(huì)引起哮喘患者的氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，引起哮喘反復(fù)發(fā)作及氣道高反應(yīng)，加重病情。哮喘早期階段是由氣道炎癥引起的［16］，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)損傷氣道上皮，刺激機(jī)體的代償性修復(fù)［17］。本實(shí)驗(yàn)采用OVA 誘導(dǎo)豚鼠構(gòu)建哮喘模型來(lái)研究蘇黃止咳膠囊改善哮喘的體內(nèi)藥效與機(jī)制。

目前臨床上治療哮喘的主要藥物是糖皮質(zhì)激素，其通過(guò)緩解氣道炎癥，而針對(duì)改善氣道重塑并沒有特效的藥物，本研究正是立足于此探討中成藥蘇黃止咳膠囊改善氣道重塑的作用及機(jī)制。氣道重塑發(fā)生時(shí)的一個(gè)重要的氣道生理結(jié)構(gòu)病變是炎癥誘導(dǎo)支氣管平滑肌增生［18］。其中組胺在氣道炎癥、支氣管平滑肌增生等一系列組織病理變化過(guò)程中起了重要作用，本研究通過(guò)組胺誘導(dǎo)豚鼠支氣管收縮來(lái)考察蘇黃止咳膠囊對(duì)離體狀態(tài)下支氣管平滑肌舒張率的影響，以及建立組胺刺激RBSMCs 細(xì)胞體外模型來(lái)探究蘇黃止咳膠囊緩解氣道重塑相關(guān)的哮喘作用機(jī)制。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal?regulated kinase，ERK）通路是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生理過(guò)程［19］。哮喘的主要病理特征包括慢性氣道炎癥和氣道重構(gòu)等，研究表明ERK 信號(hào)通路與氣道炎癥和氣道重構(gòu)關(guān)系密切［20］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘇黃止咳膠囊干預(yù)后，豚鼠肺組織及RBSMCs 中的ERK 蛋白活化明顯下降，表明蘇黃止咳膠囊改善氣道重塑與調(diào)節(jié)ERK 信號(hào)通路有關(guān)。

JAK／STAT 信號(hào)通路是眾多細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過(guò)程［21］。研究表明在調(diào)節(jié)支氣管平滑肌細(xì)胞增殖過(guò)程中JAK／STAT 信號(hào)通路發(fā)揮了重要的作用［22］。JAK／STAT 信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27 的表達(dá)，影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂與增殖［23］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘇黃止咳膠囊能逆轉(zhuǎn)JAK／STAT 信號(hào)通路上相關(guān)周期蛋白的表達(dá)，表明蘇黃止咳膠囊能夠調(diào)控JAK／STAT 信號(hào)通路，抑制RBSMCs 增殖，從而發(fā)揮改善氣道重塑的作用。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過(guò)程，指從細(xì)胞分裂結(jié)束開始，到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束為止的過(guò)程，DNA 合成和細(xì)胞分裂是細(xì)胞周期的2 個(gè)主要事件［24］。周期蛋白在細(xì)胞分裂及增殖的進(jìn)程中起著非常重要的調(diào)控作用［25］，周期蛋白（Cyclins）和與之相對(duì)應(yīng)的周期蛋白依賴性激酶（CDKs），兩者通過(guò)共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物來(lái)發(fā)揮作用［26］。Nishi等發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 與CDK4 形成的復(fù)合物可以有效的作用于細(xì)胞周期調(diào)控限制點(diǎn)G1／S，影響細(xì)胞周期G1 期進(jìn)入S 期，從而影響細(xì)胞增殖過(guò)程［27］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)蘇黃止咳膠囊干預(yù)后，RBSMCs 中CyclinD1、CDK4 的表達(dá)顯著下降，表明蘇黃止咳膠囊可以減緩細(xì)胞由細(xì)胞周期G1 期進(jìn)入S 期這一進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，蘇黃止咳膠囊通過(guò)調(diào)節(jié)JAK／STAT信號(hào)通路，影響支氣管平滑肌細(xì)胞分裂周期，緩解支氣管平滑肌的增生，改善氣道重塑的發(fā)生過(guò)程，從而發(fā)揮較好的平喘作用。