楊瑞娟 王橋美 彭文書 龔婉瑩 趙苗苗 嚴亮

摘? 要：為了探究景邁山普洱茶區(qū)不同生境茶園根際土壤微生物群落結構多樣性和差異性，對景邁山普洱茶區(qū)的微生物進行溯源，更好地保證景邁山原產(chǎn)地生產(chǎn)的普洱茶微生物的一致性。采用平板涂布分離技術，對從3個有機臺地茶園（TS-A、TS-B、TS-C）和景邁山古茶園（GS-D）采集的根際土壤微生物進行培養(yǎng)，并利用分子生物學技術鑒定其種類。在茶園根際土壤微生物中經(jīng)分離純化共得到417株細菌和143株真菌，分別歸類于27個細菌屬和18個真菌屬，4個茶園根際微生物多樣性不同，細菌多樣性和真菌多樣性的排序分別為：GS-D>TS-A>TS-C>TS-B和TS-A>TS-B>TS-C>GS-D。4個茶園的微生物群落均含有節(jié)細菌屬（Arthrobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、桿菌屬（Lysinibacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、曲霉屬（Aspergillus）和青霉菌屬（Penicillium），其中芽孢桿菌屬（Bacillus）和青霉菌屬（Penicillium）為優(yōu)勢菌屬。結果表明，景邁山不同生境下的根際土壤微生物群落組成有差異性，3個有機臺地茶園的細菌多樣性低于古茶園，但真菌多樣性高于古茶園。3個有機臺地茶園的規(guī)律如下：茶樹品種一樣，套種品種多的茶園的細菌和真菌多樣性都高于套種品種少的茶園，套種品種相似的茶園，茶樹品種越多，細菌的多樣性更高，而真菌多樣性更低。

關鍵詞：景邁山;茶園;根際微生物

中圖分類號：S571.1? ? ? 文獻標識碼：A

A Preliminary Study on the Distribution Diversity of Rhizosphere Soil Microbial Community in Tea Plantations with Different Habitats of Jingmai Mountain， Yunnan， China

YANG Ruijuan1，2，3， WANG Qiaomei2，3，4， PENG Wenshu2，3， GONG Wanying2，3， ZHAO Miaomiao2，3，

YAN Liang2，3*

1. College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China; 2. College of Tea （Puer）， West Yunnan University of Applied Sciences， Puer， Yunnan 665000， China; 3. Puer Institute of Pu-erh Tea， Puer， Yunnan 665000， China; 4. College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China

Abstract： To explore the diversity and difference of rizosphere soil microbial community structure in tea gardens of different habitats in Pu-erh tea area of Jingmai Mountain， so as to better ensure the consistency of microorganisms in Pu-erh tea production in the original place of Jingmai Mountain， the plate coating separation technology was used to culture the microorganisms collected from three organic terraced tea gardens （TS-A， TS-B， TS-C） and Jingmai Mountain ancient tea garden （GS-D）， and the molecular biology technology was used to identify the species. A total of 417 strains of bacteria and 143 strains of fungi were isolated and purified， respectively distributed in 27 bacterial genera and 18 fungal genera. The rizosphere microbial diversity of the four tea gardens was different， the order of bacterial diversity and fungal diversity was GS-D>TS-A>TS-C>TS-B and TS-A>TS-B>TS-C>GS-D， respectively. The soil rizosphere microbial communities of the four tea gardens all contained Arthrobacter， Bacillus， Lysinibacillus， Paenibacillus， Aspergillus and Penicillium， Bacillus and Penicillium were the dominant genera. The results showed that the composition of the rizosphere soil microbial community in different habitats of Jingmai Mountain was different. The bacterial diversity of the three terraced tea gardens was lower than that of the ancient tea garden， but the fungal diversity was higher than that of the ancient tea garden. More intercropped plants would result in higher bacterial diversity and fungal diversity in organic terraced tea gardens. More varieties of tea trees would lead to higher bacterial diversity and lower fungal diversity in terraced tea gardens.

Keywords： Jingmai Mountain; tea garden; rhizosphere microorganism

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.039

景邁山位于中國云南省的西南邊陲，坐落于普洱市瀾滄拉祜族自治縣惠民鄉(xiāng)，地處北緯221205.8，東經(jīng)1000202.5，以普洱茶盛名，是有名的幾大普洱茶山之一，有成片的現(xiàn)代有機茶園，也有占地面積1867 hm2的古茶園。在世界物質文化遺產(chǎn)申報的版圖上，景邁山是唯一以古茶林為主體申遺的茶山，這里山高谷深、云霧彌漫、氣候溫和濕潤、土壤肥沃、植被豐富，極適合大葉茶樹的自然生長[1]。

土壤中有機質的分解、土壤元素的循環(huán)、土壤的礦化等都離不開土壤微生物的作用，土壤微生物維持著農(nóng)業(yè)土壤的健康和生產(chǎn)力[2-4]。根際土壤微生物對植物的生長有很重要的作用，如Walters等[5]發(fā)現(xiàn)細菌分泌的激素可提高植物的適應性。根際微生物與根系之間存在適應性協(xié)同進化關系，并形成植物-微生物之間的互惠關系[6-7]。茶樹根際土壤微生物的群落結構及生態(tài)分布對茶葉的生長與質量的影響至關重要，茶樹的不同栽培環(huán)境和不同的人為管理活動可能造成微生物群落的特殊性，進而影響茶樹的生長[7]。近幾年來，部分研究者采用稀釋平板涂布法、Biolog微平板分析法、微生物定量測定法、磷脂脂肪酸分析法[8-10]，對不同海拔、不同生長年限的茶樹根際土壤微生物群落展開研究[11-12]，初步探索了真菌、細菌、放線菌等微生物大類群與土壤性狀、茶樹樹齡、茶樹品種的關系。

目前，植物根際微生物的研究很多，但是茶樹根際微生物群落的組成及具體分布的研究比較少。本研究選取景邁山3個不同的有機臺地茶園和景邁山古茶園為對象，應用純培養(yǎng)和測序技術對景邁山普洱茶區(qū)的土壤根際微生物群落結構特征進行初探，為進一步研究土壤微生物的功能和開發(fā)利用提供理論依據(jù)和菌株資源。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣品? 土壤樣品來自4個茶園。茶園A：茶樹品種為傳統(tǒng)的普洱茶種，茶園套種20多種不同植物（香樟樹、旱冬瓜、西南樺、燈臺、金雞納、金絲楠、海南黃花梨、橡膠、印度紫檀、柚木櫻桃、荔枝、桃子、芒果、小葉紫薇等）;茶園B：茶樹品種為傳統(tǒng)的普洱茶種，套種近10種不同植物（香樟樹、旱冬瓜、西南樺、燈臺、芒果、桃子、小葉紫薇等）;茶園C：茶樹品種比較多（傳統(tǒng)的普洱茶種、‘雪芽100號‘云抗10號‘矮豐‘烏龍‘長葉白毫等），套種品種與茶園B相似。茶園D：景邁山萬畝古茶園，為當?shù)夭祭首?、傣族先民所馴化、栽培，基本為上千年的茶樹，是名副其實的千年萬畝古茶園。

1.1.2? 試劑? ExTaq（TaKaRa，大連），KOD-fx（TOYOBO，日本），PCR引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2? 方法

1.2.1? 根際土壤樣品的采集? 采樣時間分別為2018年4月2—8日，2018年8月8—14日，2018年10月25—31日和2019年1月24—30日。在茶園內隨機選擇健康的茶樹植株，以茶樹莖為中心，從橫向半徑20 cm，深度30 cm的土壤中將茶樹的部分須根拔出，輕輕搖動去除松散的土壤，采集緊密附著在根表面的土壤即獲得1份根際土壤樣品。每3份土樣混合成1個土壤混合樣（1 kg左右），每個茶園采集10個土壤混合樣備用。茶園A、B、C均為景邁山的有機臺地茶園，采集的根際土壤樣品標記為TS-A、TS-B、TS-C;茶園D為古樹茶園，采集的根際土壤樣品標記為GS-D。

1.2.2? 微生物菌株的分離? 先制備以下4種培養(yǎng)基。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂18 g/L。

YEPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂18 g/L。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯300 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L。

高氏培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，氯化鈉0.5 g/L，硝酸鉀1 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，瓊脂15～20 g/L。

將所采土壤樣品置于滅菌的培養(yǎng)皿中自然風干7 d，取10 g于90 mL的無菌水中，振蕩20 min，使其中微生物充分分散，得到10?1倍樣品稀釋液。用無菌移液槍吸取10?1菌懸液1 mL，加入裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，振蕩混勻，配制10?2、10?3、10?4、10?5梯度菌懸液，把10?3、10?5兩個梯度的土懸液各取100 μL分別均勻涂于LB、YEPD、PDA和高氏培養(yǎng)基平板中，28、37 ℃倒置恒溫培養(yǎng)72 h，挑取培養(yǎng)性狀不同的微生物單菌落進行純化培養(yǎng)，備用。

1.2.3? 微生物菌株的分子鑒定? 將純化的細菌制成菌懸液，細菌PCR體系為[13]：10×PCR buffer for ExTaq 5 ?L、2 mm dNTP mixture 4 ?L、ExTaq（5.0 U/?L）0.5 ?L、上游引物27F（20 ?mol/L）1 ?L、下游引物1492R（20 ?mol/L）1 ?L（使用的引物見表1）、菌懸液1 ?L、水37.5 ?L。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;96 ℃變性30 s，52 ℃復性（退火）30 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)34次;72 ℃ 10 min。4 ℃保溫。

將純化的真菌制成菌懸液，真菌PCR體系為[14]：2×PCR buffer for KOD FX 25 ?L、2 mm dNTP mixture 10 ?L、KOD-fx（1.0 U/?L）1?L、上游引物ITS1（20 ?mol/L）0.75 ?L、下游引物ITS4（20 ?mol/L）0.75 ?L（使用的引物見表1）、菌懸液2.5 ?L、水10 ?L。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;98 ℃變性10 s，50 ℃復性（退火）30 s，68 ℃延伸2 min，循環(huán)45次。4 ℃保溫。

將擴增成功的樣品送至北京睿博興科生物技術有限公司測序。根據(jù)測序結果，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，篩選出同源性最高的參考菌株序列，進行分子鑒定。

用多序列對比軟件Clustal X 1.81進行同源性比較并匹配排序，然后用系統(tǒng)發(fā)育分析MEGA5.1軟件包分析，構建鄰接（Neighbor-joining，NJ）樹進行系統(tǒng)發(fā)育分析。NJ樹構建采用HKY85距離矩陣，啟發(fā)式搜索，Bootstrap（1 000次重復）檢驗，制作系統(tǒng)樹[15]。

2? 結果與分析

2.1? 基于16S rRNA基因系統(tǒng)進化的細菌群落組成分析

對純化得到的417株細菌菌株進行16S rRNA基因測序、比對，挑取代表序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。茶園土壤中的根際細菌可歸類到無色桿菌屬（Achromobacter）、節(jié)細菌屬（Arthrobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、短桿菌屬（Brevibacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、桿菌屬（Lysinibacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、嗜冷芽孢桿菌屬（Psychrobacillus）、土壤芽孢桿菌屬（Solibacillus）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）等屬中。

2.2? 基于ITS基因系統(tǒng)進化的真菌群落組成分析

對純化得到的143株真菌菌株進行ITS基因測序、比對，挑取代表序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。茶園土壤中的根際真菌可以歸類到Apiotrichum、Aseptatum、曲霉屬（Aspergillus）、Blastobotrys、Buckleyzyma、毛殼菌屬（Chaetomium）、Chloridium、Hamigera、馬拉色氏霉菌屬（Malassezia）、Meyerozyma、毛霉屬（Mucor）、Paramyrothecium、青霉菌屬（Penicillium）TSX、GSX分別代表有機臺地茶園和古茶園的根際土壤細菌。TSX、GSX represent the rhizosphere soil bacteria of the organic terraced tea garden and the ancient tea garden， respectively.

2.3? 不同生境茶園根際土壤細菌群落的屬間特征

由表2可知，TS-A、TS-B、TS-C、GS-D 4個生境下的細菌群落均含有芽孢桿菌屬（Bacillus）、節(jié)細菌屬（Arthrobacter）、桿菌屬（Lysinibacillus）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。以芽孢桿菌屬為優(yōu)勢類群，其相對分離頻率分別為45.83%、27.00%、43.75%、38.61%;其次是節(jié)細菌屬，其相對分離頻率分別為10.83%、6.00%、13.54%、8.91%;再次是桿菌屬（Lysinibacillus），其相對分離頻率分別為6.67%、8.00%、8.33%、8.91%。4個生境下的類芽孢桿菌屬含量差異比較大，其相對分離頻率分別為5.00%、16.00%、6.25%、5.94%。

除去3個共有的細菌屬，TS-A茶樹根際土壤生境以鏈霉菌屬（Streptomyces）（10.83%）、土壤芽孢桿菌屬（Solibacillus）（4.17%）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）（4.17%）為主要類群;TS-B茶樹根際土壤生境以短桿菌屬（Brevibacterium）（14.00%）、鏈霉菌屬（Streptomyces）（12.00%）、無色桿菌屬（Achromobacter）（5.00%）、Sphingobacterium（5.00%）為主要類群;TS-C茶樹根際土壤生境以不動桿菌屬（Acinetobacter）（7.29%）、Sinomonas（6.25%）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）（5.21%）、Sphingobacterium（5.21%）為主要類群;GS-D茶樹根際土壤生境以鏈霉菌屬（Streptomyces）（7.92%）、產(chǎn)堿桿菌屬（Advenella）（6.93%）、無色桿菌屬（Achromobacter）（4.95%）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）（4.95%）、類節(jié)桿菌屬（Paenarthrobacter）（3.96%）為主要類群。

TS-A分離得到細菌120株，TS-B分離得到細菌100株，TS-C分離得到細菌96株，GS-D分離得到細菌101株，從細菌的分離數(shù)量來說，TS-A>GS-D>TS-B>TS-C。TS-A分離得到細菌15個屬，TS-B分離得到細菌10個屬，TS-C分離得到細菌11個屬，GS-D分離得到細菌16個屬，從細菌的屬的多樣性來說，GS-D>TS-A>TS-C> TS-B。由此可知，茶樹品種一致，套種植物種類多的TS-A的細菌多樣性和細菌數(shù)量均大于套種植物種類少的TS-B，套種植物種類相似，茶樹品種多的TS-C的細菌多樣性大于茶樹品種單一的TS-B，但是分離得到的細菌數(shù)量上更少一些。古茶園GS-D細菌多樣性大于有機臺地茶園TS-A、TS-B和TS-C。

2.4? 不同生境茶園根際土壤真菌群落的屬間特征

由表3可知，TS-A、TS-B、TS-C、GS-D 4個生境下的真菌群落均含有青霉菌屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）。以青霉

菌屬為優(yōu)勢類群，其相對分離頻率分別為45.45%、10.71%、34.62%、23.53%，其次是曲霉屬，其相對分離頻率分別為4.55%、7.14%、7.69%、35.29%。除去兩個共有的真菌屬，TS-A茶樹根際土壤生境以木霉屬（Trichoderma）（20.45%）、Paramyrothecium（6.82%）、Blastobotrys（4.55%）、Meyerozyma（4.55%）為主要類群;TS-B茶樹根際土壤生境以木霉屬（Trichoderma）（32.14%）、毛殼菌屬（Chaetomium）（16.07%）、毛霉屬（Mucor）（14.29%）、Meyerozyma（10.71%）為主要類群;TS-C茶樹根際土壤生境以籃狀菌屬（Talaromyces）（19.23%）、Meyerozyma（11.54%）、Purpureocillium（11.54%）、擬青霉屬（Paecilomyces）（7.69%）為主要類群;GS-D茶樹根際土壤生境種類比較單一，除了與其他3個生境共有的真菌屬，只剩下Blastobotrys（29.41%）和毛孢子菌屬（Trichosporon）（11.76%）兩個屬。

TS-A分離得到真菌44株，TS-B分離得到真菌56株，TS-C分離得到真菌26株，GS-D分離得到真菌17株，從真菌的分離數(shù)量來說，TS-B>TS-A>TS-C>GS-D。TS-A分離得到真菌12個屬，TS-B分離得到真菌9個屬，TS-C分離得到真菌8個屬，GS-D分離得到真菌4個屬，從真菌的屬的多樣性來說，TS-A>TS-B>TS-C>GS-D。由此可知，有機臺地茶園TS-A、TS-B、TS-C的真菌數(shù)量和多樣性都要高于古茶園GS-D。

3? 討論

研究表明，由于不同茶園種植模式的不同，茶園間的茶樹根際微生物種群產(chǎn)生了較大的差異。景邁古茶園的古樹茶樹齡古老，沒有經(jīng)過人工矮化，大部分生長在原始叢林之中，在綠水青山、藍天白云和清新空氣的滋潤下，全靠自然肥力生長，遠離了農(nóng)藥化肥的污染，其土壤細菌種群多樣性高于3個有機臺地茶園。盧開陽等[7]也研究發(fā)現(xiàn)南糯山古茶山的細菌多樣性高于臺地茶，與本研究結論一致。本研究還發(fā)現(xiàn)3個有機臺地茶園的真菌多樣性要高于古茶園，這說明人為干預對茶樹根際土壤微生物種群的組成起到了一定的選擇作用。對3個有機臺地茶園的研究結果表明，不同茶樹品種不同套種植物的茶園土壤微生物多樣性的差異較大，這說明植物套種對土壤微生物有顯著影響[16]，賀國強等[17]在對煙草套種的研究中也得出相似的結論。

TS-A、TS-B、TS-C 3個有機臺地茶園含有鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、Meyerozyma、Purpureocillium、木霉屬（Trichoderma），而古茶園GS-D沒有。產(chǎn)堿桿菌屬（Advenella）、博代氏桿菌屬（Bordetella）、棒狀桿菌屬（Coryneb act erium）、魯梅爾芽胞桿菌屬（Rummeliibacillus）、單胞菌屬（Stenotrophomonas）、Tetrathiobacter、綠芽孢桿菌屬（Viridibacillus）、毛孢子菌屬（Trichosporon）是古茶園GS-D獨有的，TS-A、TS-B、TS-C 3個有機臺地茶園中沒有。TS-A、TS-B、TS-C、GS-D 4個生境下的微生物群落均含有節(jié)細菌屬（Arthrobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、桿菌屬（Lysinibacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、曲霉屬（Aspergillus）和青霉菌屬（Penicillium），其中芽孢桿菌屬（Bacillus）里的蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）可產(chǎn)生特異性殺蟲蛋白，對多種農(nóng)業(yè)害蟲具有特異的殺蟲活性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中極具開發(fā)潛力[18]，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）對引起黑斑病病原菌有很好的拮抗作用，抑制率達到66.67%[19]，具有一定的肥效功能，可用于促生菌劑的研制[20]，本研究獲得了一批潛在的生防微生物菌株，為下一步的篩選利用提供了菌株資源。

本研究利用平板稀釋涂布分離，獲取純的培養(yǎng)物（微生物菌株），再通過分子生物學技術及分類鑒定等手段進行鑒定，進而分析確定純培養(yǎng)物歸屬。在研究得到4個不同生境微生物群落組成和差異的同時，保存了大量微生物菌種資源，這與免培養(yǎng)方法相比具有極大優(yōu)勢。后續(xù)研究將通過檢索相關微生物資源信息及應用，進一步探究人為干預與無干預古樹茶生境下具有特定功能的微生物變化對茶樹生長及品質的影響。如曲霉屬（Aspergillus）是普洱茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物，對普洱茶品質的影響很關鍵[21-22]，且黑曲霉（Aspergillus niger）可以促進茶多糖的高效產(chǎn)出[23]，研究過程中在4個不同生境茶園中都分離得到了曲霉屬菌株，這些菌株是否參與普洱茶的發(fā)酵作用并對品質有重要影響，也將是下一步的研究要點。

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責任編輯：沈德發(fā)