姚 芳,張 偉,徐海祥,王海藍,管 澎

(江蘇農牧科技職業(yè)學院食品科技學院,江蘇泰州 225300)

銀杏果藥食兼用,營養(yǎng)豐富,除含淀粉(60%)、蛋白質類(13%)、糖類(7%)、脂肪類(4%)外,還含有銀杏黃酮、銀杏酚、銀杏內酯、銀杏酸等特有的活性成分[1],在抗氧化、益智健腦、提高免疫力、抗衰老、抗菌[2-5]等方面具有一定的療效,在功能食品領域具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

銀杏蛋白是銀杏果中重要的功能成分,據(jù)研究銀杏果的抗氧化性與其水溶性蛋白含量有著密切關系[6-7],利用微生物與銀杏果共發(fā)酵,提高活性成分含量是近年來研究的熱點。研究表明[8-11]微生物可利用和代謝銀杏中的成分,增加可溶蛋白、黃酮和內酯的含量。植物乳桿菌和釀酒酵母是發(fā)酵食品中常用的微生物,二者之間存在共生與互補關系[12-13]。已有采用發(fā)酵技術改變銀杏葉中銀杏酸含量[10-11]、蛋白含量[14]、提高免疫活性[15]和抗氧化活性[9]等的研究,但有關銀杏果發(fā)酵技術的研究較少。

本研究以泰州大佛指銀杏果為原料,采用響應面優(yōu)化銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝,以期得到一種高抗氧化活性的銀杏發(fā)酵粉,為銀杏果的精深加工奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏果 大佛指,江蘇中藥科技園;中溫α淀粉酶 4000 U/g、糖化酶 100 U/mg、蘆丁標準品純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;植物乳桿菌 Dy-1,江蘇大學食品與生物工程學院實驗室提供;釀酒酵母 凍干粉,江南大學生物發(fā)酵與分離研究室提供;DPPH 純度≥98%,sigma公司;牛血清白蛋白 分析純,生工生物工程(上海)股份有限公司;Tris 分析純,美國amresco;MRS肉湯培養(yǎng)基 優(yōu)級純,北京陸橋技術股份有限公司;銀杏酸標準品 純度≥99%,北京中科質檢生物技術有限公司;考馬斯亮藍G250、鹽酸、甲醇、正己烷、乙腈、ABTS等試劑 分析純,國藥集團。

T6-紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;高速萬能粉碎機 天津市華鑫儀器廠;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;Labconco FreeZone 6 L臺式冷凍干燥機 美國LABCONCO公司;Thermo 702超低溫冰箱 美國賽默飛世爾科技公司;DHG-9101-2S電熱恒溫鼓風干燥箱 上海三發(fā)科學儀器有限公司;JM-L80實驗室膠體磨 溫州昊星機械設備制造有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面垂直凈化工作臺 吳江市亞泰凈化設備有限公司;MaxQ 4000恒溫培養(yǎng)搖床 賽默飛世爾科技公司;RE-52D旋轉蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠;回流提取裝置 上海申玻儀器公司;SPX-250S·Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學儀器有限公司;PRIMOR型高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多集團;安捷倫1260高效液相色譜儀(配紫外檢測器) 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏果的加工工藝

1.2.1.1 干燥粉碎(G) 鮮銀杏果預煮1 h后去殼、去芯,搗碎,60 ℃干燥4 h,80 ℃干燥1 h、100 ℃干燥1 h、120 ℃干燥0.5 h,粉碎制成小于200目的銀杏粉(G)。

1.2.1.2 單酶解(M) 在干燥粉碎樣的基礎上,取100 g樣加質量比為1∶6的水,用膠體磨研磨3 min。置于沸水浴中加熱攪拌20 min,取出冷卻至60 ℃。添加銀杏果重量0.3 g/100 g的糖化酶和α淀粉酶復合酶制劑,在60 ℃下攪拌酶解2 h,100 ℃下滅酶15 min,取出冷卻至35 ℃,冷凍干燥。

1.2.1.3 單乳酸菌發(fā)酵(R) 在干燥粉碎樣的基礎上,取100 g樣加質量比為1∶6的水,用膠體磨研磨3 min。置于沸水浴中加熱攪拌20 min,取出冷卻至35 ℃。加入3 g/100 g植物乳桿菌,32 ℃的恒溫搖床發(fā)酵12 h,取出將全部料液倒入多個平皿中,先在-78 ℃冰箱中預凍2 h,然后放到凍干機中冷凍干燥。

1.2.1.4 乳酸菌+酵母菌聯(lián)合發(fā)酵(R+J) 在干燥粉碎樣的基礎上,取100 g樣加質量比為1∶6的水,用膠體磨研磨3 min。置于沸水浴中加熱攪拌20 min,取出冷卻至35 ℃。分別加入1.5 g/100 g植物乳桿菌和釀酒酵母,32 ℃的恒溫搖床發(fā)酵12 h,冷凍干燥。

1.2.1.5 酶解+乳酸菌聯(lián)合處理(M+R) 在單酶解的基礎上,加入3 g/100 g植物乳桿菌,32 ℃的恒溫搖床發(fā)酵12 h,冷凍干燥。

1.2.1.6 酶解+乳酸菌+酵母菌聯(lián)合處理(M+R+J) 即為菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝,在單酶解的基礎上,分別加入1.5 g/100 g植物乳桿菌和釀酒酵母,32 ℃的恒溫搖床發(fā)酵12 h,冷凍干燥,從而獲得銀杏果發(fā)酵粉(GFP)。

1.2.2 單因素實驗 設定1∶6 g/mL的料液比,復合酶制劑添加總量0.3 g/100 g,糖化酶和α淀粉酶添加質量比2∶1,酶解時間2 h,混合發(fā)酵劑添加總量3 g/100 g,植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比1∶1,發(fā)酵時間12 h,為固定水平。以可溶性蛋白含量和DPPH自由基清除率為指標,分別考察料液比(1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9 g/mL)、復合酶制劑添加總量(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/100 g)、糖化酶和α淀粉酶添加質量比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、酶解時間(1、1.5、2、2.5、3 h)、混合發(fā)酵劑添加總量(1.5、2.25、3、3.75、4.5 g/100 g)、植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、發(fā)酵時間(6、12、18、24、30 h)對銀杏果發(fā)酵粉可溶性蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Analytical factors and levels for response surface method

1.2.3 響應面試驗 根據(jù)單因素試驗結果,以銀杏果發(fā)酵液對DPPH自由基清除率為響應值,選取料液比、糖化酶和α淀粉酶添加質量比、混合發(fā)酵劑添加總量、植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比4個因素設計四因素三水平試驗,進而優(yōu)化銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵的最適條件,因素水平見表1。

1.2.4 銀杏果發(fā)酵粉可溶性蛋白質的測定 采用考馬斯亮藍法[16]測定:取0.2 g銀杏果發(fā)酵粉,加入25 mL的0.15 mol/L Tris-HCL緩沖液(pH8.5),磁力攪拌提取0.5 h,后于4 ℃、7000 r/min離心15 min,取適量上清液和5 mL考馬斯亮藍染液,混勻,室溫靜置5 min后在595 nm處測定其吸光度。以牛血清白蛋白為標樣,制得標準曲線方程為:y=0.006x+0.0194(R2=0.995)。

1.2.5 銀杏果發(fā)酵粉抗氧化活性的測定 以DPPH自由基清除能力作為衡量銀杏果發(fā)酵粉抗氧化能力的指標,參照王希[17]的方法進行測定。將2 mL銀杏果發(fā)酵液和2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混勻,暗處靜置30 min,于517 nm處測得樣品的吸光度A1;用2 mL甲醇代替DPPH測得本底吸光度A2;用2 mL甲醇加2 mL DPPH溶液測得空白對照吸光度A0,試驗設置2個重復。清除率S(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

1.2.6 銀杏果銀杏酸含量的測定

1.2.6.1 樣品預處理 稱取銀杏果發(fā)酵粉10 g溶于200 mL無水甲醇,70 ℃水浴回流3 h,搖勻后過濾,將濾液濃縮,用正己烷萃取3次,每次20 mL,合并萃取液于40 ℃旋轉蒸發(fā)至干,用甲醇定容至10 mL,0.45 μm濾膜過濾,得樣品分析液。

1.2.6.2 HPLC法色譜條件 參照王蕎薇等[18]的方法采用HPLC法測定銀杏酸含量,用無水甲醇配制0.5 mg/mL的銀杏酸標準品溶液。色譜柱:安捷倫XDB-C18毛細管柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(94+6);時間40 min;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長310 nm;進樣量20 μL。

1.2.7 銀杏果發(fā)酵粉主要成分含量的測定

1.2.7.1 粗蛋白的測定 凱氏定氮法,參照GB 5009.5-2016。

1.2.7.2 脂肪的測定 索氏抽提法,參照GB 5009.6-2016。

1.2.7.3 淀粉的測定 酸水解法,參照GB 5009.9-2016。

1.2.7.4 還原糖的測定 直接滴定法,參照GB 5009.7-2016。

1.2.7.5 總酸的測定 酸堿滴定法,參照GB/T 12456-2008。

1.2.7.6 黃酮的測定 將樣品用料液比1∶10的70%乙醇70 ℃回流提取2 h,離心取上清液,低溫濃縮,用硝酸鋁比色法[19]測定。以蘆丁為標樣,制得標準曲線方程為:y=10.677x-0.0034(R2=0.9996)。

1.2.7.7 多酚的測定 將樣品用料液比1∶50的60%乙醇60 ℃回流浸提2 h,離心取上清液,低溫濃縮,用福林酚法[20]測定。以沒食子酸為標樣,制得標準曲線方程為:y=9.7809x+0.0135(R2=0.9995)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個數(shù)據(jù)重復測定3次,采用Design-Expert 8.05b軟件對響應面數(shù)據(jù)進行分析,利用F檢驗進行方差分析以評價模型的統(tǒng)計意義。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 銀杏果不同加工方式的選擇 采用單酶解(M)、單乳酸菌(R)、乳酸菌+酵母菌(R+J)、酶解+乳酸菌(M+R)、酶解+乳酸菌+酵母菌(M+R+J)5種不同加工方式,研究其對銀杏果樣品可溶性蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響,以銀杏粉樣(G)為對比,確定銀杏果的最適加工方式,見圖1。

圖1 不同加工方式對銀杏果樣品可溶性蛋白含量 和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of different processing methods on soluble protein content and DPPH radical scavenging capacity of ginkgo seeds注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。

由圖1可知,與未經(jīng)加工處理的銀杏粉樣(G)相比,采用5種不同加工方式處理后的銀杏果樣品,其可溶性蛋白含量均增加,對DPPH自由基的清除率均增加,但增加的程度不一致,其中采用酶解+乳酸菌+酵母菌(M+R+J)處理后的銀杏果樣品,其可溶性蛋白含量最高,對DPPH自由基的清除率最大,且與其他加工方式處理后的銀杏果樣品相比有顯著差異。說明先采用復合酶制劑(糖化酶和淀粉酶)酶解后,再通過發(fā)酵劑(植物乳桿菌和釀酒酵母)進行發(fā)酵的方式處理銀杏果,制備的發(fā)酵銀杏粉中可溶性蛋白含量最多,抗氧化活性最強,與未處理的銀杏粉(G)相比,可溶性蛋白含量增加了400.1%,DPPH自由基清除率增加了203.6%。馬琦媛[21]亦發(fā)現(xiàn)采用乳酸桿菌和釀酒酵母發(fā)酵小米,有效改善了小米中植酸含量、氨基酸組成。因此后續(xù)試驗采用酶解+乳酸菌+酵母菌(M+R+J)即菌酶協(xié)同發(fā)酵法處理銀杏果樣品。

2.1.2 料液比對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同料液比對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖2。隨料液比增加,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率均呈先增大后緩慢減小的趨勢,料液比為1∶6 g/mL時,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白的含量最多,DPPH自由基清除率最大,且與其他處理樣品相比有顯著差異。這可能是因為生化反應時含水量少不利于銀杏果的充分發(fā)酵,含水量太多會導致銀杏發(fā)酵粉中的可溶性蛋白等抗氧化物質的相對含量減少,從而減弱了抗氧化效果。故較佳的料液比為1∶6 g/mL。

圖2 料液比對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on GFP

2.1.3 復合酶制劑添加總量對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同復合酶制劑添加量對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖3。隨復合酶制劑添加量的增加,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率均呈先增大后緩慢減小的趨勢,復合酶制劑添加總量為0.3 g/100 g時,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白的含量最多,DPPH自由基清除率最大,且與其他處理樣品相比有顯著差異。這可能是因為復合酶制劑添加總量低時,酶解出的可溶性糖類物質較少,植物乳桿菌和釀酒酵母的生長較緩慢,水解出的可溶性蛋白、黃酮、多酚[22]等抗氧化物質較少,抗氧化活性較低。添加總量高時,酶解出的可溶性糖類物質較多,植物乳桿菌和釀酒酵母的生長較快,消耗的蛋白增多,可溶性蛋白含量減少,雖然銀杏黃酮、多酚含量增加,但總抗氧化活性緩慢下降。故較佳的復合酶制劑添加量為0.3 g/100 g。

圖3 復合酶制劑添加總量對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.3 Effects of total amount of compound enzyme on GFP

2.1.4 糖化酶和α淀粉酶添加質量比對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同糖化酶和α淀粉酶添加質量比對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖4。糖化酶和α淀粉酶添加質量比對銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率影響較大,酶添加量和酶解時間一定時,糖化酶比例低,酶解出的可溶性糖類物質較少,植物乳桿菌和釀酒酵母的生長較緩慢,水解出的可溶性蛋白、多酚等抗氧化物質較少,抗氧化活性較低。糖化酶比例高,酶解出的可溶性糖類物質較多,植物乳桿菌和釀酒酵母的生長較快,消耗的蛋白增多,可溶性蛋白含量減少,雖然多酚含量增加,但總抗氧化活性下降。故較佳的糖化酶和α淀粉酶添加質量比為2∶1。

圖4 糖化酶和α淀粉酶添加質量比對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.4 Effects of mass ratio of glucoamylase and α-amylase on GFP

2.1.5 酶解時間對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同酶解時間對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖5。隨著酶解的延長,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量先增加后基本不變,酶解3 h后減少,可能是因為酶解時間長,得到的可溶性糖類多,植物乳桿菌和釀酒酵母的生長較快,可溶性蛋白含量減少。隨著酶解的延長,銀杏發(fā)酵粉對DPPH自由基的清除率先增加,2 h后基本保持不變,可能是因為糖化酶和α淀粉酶能打斷糖苷鍵,增加多酚類物質的釋放[23],但可溶性蛋白含量減少,故抗氧化活性基本不變。較佳的酶解時間為2 h。

圖5 酶解時間對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.5 Effects of enzymolysis time on GFP

2.1.6 混合發(fā)酵劑添加總量對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同混合發(fā)酵劑添加總量對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖6。

圖6 混合發(fā)酵劑添加總量對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.6 Effects of total amount of mixed fermentation agent on GFP

由圖6可知,隨混合發(fā)酵劑添加總量的增加,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率均呈先增大后減小的趨勢,混合發(fā)酵劑添加總量為3 g/100 g時,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白的含量最多,DPPH自由基清除率最大,且與其他處理樣品相比有顯著差異。發(fā)酵劑添加量的多少與活性成分的含量密切相關,熊濤等[24]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌主要利用菌體分泌的酶水解基質中的蛋白為多肽和氨基酸來提供氮源。酵母菌生長繁殖所需的能量主要來自糖類的分解代謝。發(fā)酵劑添加量在1.5～3.0 g/100 g時,發(fā)酵劑水解銀杏果中大分子蛋白為可溶性蛋白的量持續(xù)增加,銀杏果結合態(tài)多酚在植物乳桿菌的作用下被釋放出來或轉化成了新的多酚,銀杏果的抗氧化活性持續(xù)增加。當發(fā)酵劑添加量超過3.0 g/100 g時,銀杏果中的營養(yǎng)物質不能滿足大量發(fā)酵劑的生長,消耗的蛋白增多,同時也消耗酚類物質[25],抗氧化活性下降。故較佳的發(fā)酵劑添加量為3.0 g/100 g。

2.1.7 植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖7。植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比對銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響較大,植物乳桿菌在生長時,會分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等水解酶和有機酸[26],這些酶將淀粉、蛋白質、纖維素、脂肪等大分子物質轉化成小分子物質,同時酸性環(huán)境激活了銀杏果中各種內源酶。釀酒酵母含豐富的蛋白質和酶,主要分解代謝糖類,在酸性環(huán)境中生長較慢。發(fā)酵劑添加量和發(fā)酵時間一定時,植物乳桿菌比例低,水解出的可溶性蛋白、多酚等抗氧化物質較少,抗氧化活性較低。植物乳桿菌比例高,自身代謝所需要的蛋白增多,可溶性蛋白含量減少,抗氧化活性下降。故較佳的植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比為1∶1。

圖7 植物乳桿菌和釀酒酵母 添加質量比對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.7 Effects of mass ratio of lactobacillus plantarum and saccharomyces cerevisiae on GFP

2.1.8 發(fā)酵時間對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同發(fā)酵時間對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖8。隨著發(fā)酵時間延長,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量先增加后緩慢下降,可能是因為植物乳桿菌和釀酒酵母生長過程中能分泌很多胞外酶,發(fā)酵時間短,酶量不充足,生成的活性物質少,可溶性蛋白含量低,抗氧化活性也低;而發(fā)酵時間太長,蛋白進一步水解為氨基酸或被代謝利用,可溶性蛋白含量減少。隨著發(fā)酵時間延長,DPPH自由基清除率先增加,12 h后基本保持不變,可能是酚酸類物質經(jīng)發(fā)酵后,由結合態(tài)轉化為游離態(tài),多酚含量增加,但可溶性蛋白含量減少,故抗氧化活性基本不變。較佳的發(fā)酵時間為12 h。

圖8 發(fā)酵時間對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.8 Effects of fermentation time on GFP

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface method

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2 銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝的響應面試驗分析

2.2.1 響應面分析方案及結果 銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝條件的響應面分析試驗根據(jù)Box-Behnken設計進行了29組試驗,結果見表2,回歸模型的方差分析見表3。

2.2.2 響應面因素間的交互作用分析 料液比、糖化酶和α淀粉酶添加質量比、混合發(fā)酵劑添加總量、植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比4個因素在銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵過程中的兩兩交互作用見圖9。

曲面圖的形狀是各因素影響DPPH自由基清除率大小最直觀的展示,曲面越陡峭,說明影響越顯著[27]。由圖9可看出c、e、f三圖中曲面較為陡峭,且等高線密度分布不均勻,呈橢圓形,說明植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比與混合發(fā)酵劑添加總量、糖化酶和α淀粉酶添加質量比、料液比的交互作用較強,對DPPH自由基清除率的影響較顯著,各因素對銀杏發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響順序為植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比>混合發(fā)酵劑添加總量>糖化酶和α淀粉酶添加質量比>料液比,與表3中方差分析結果一致。

2.3 驗證試驗

根據(jù)響應面試驗所得的銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝參數(shù)結果和二次多項回歸方程,利用Design Expert 8.05b軟件中的“Optimization”模塊分析得出優(yōu)化結果,即獲得較好DPPH自由基清除效果的工藝參數(shù)為料液比1∶63 g/mL,糖化酶和α淀粉酶添加質量比2.1∶1,混合發(fā)酵劑添加總量3.12 g/100 g,植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比1.06∶1,銀杏發(fā)酵粉對DPPH自由基清除率預測可達到69.72%?？紤]實際操作便利,將銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝參數(shù)修正為料液比1∶6,糖化酶和α淀粉酶添加質量比2∶1,混合發(fā)酵劑添加總量3.12 g/100 g,植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比1∶1,采用修正后的工藝參數(shù)進行3次平行驗證試驗,結果測得DPPH自由基清除率為69.7±1.1%,可見該模型能較好地預測具有抗氧化活性的銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝參數(shù)。由最佳工藝制得的銀杏發(fā)酵粉(GFP)與未處理的銀杏粉(G)相比,DPPH自由基清除率增加了257.4%。

2.4 銀杏發(fā)酵粉品質的檢測

2.4.1 銀杏發(fā)酵粉銀杏酸含量的檢測 銀杏酸標準品、銀杏粉(G)、銀杏發(fā)酵粉(GFP)中銀杏酸的高效液相色譜圖分別如圖10所示。

由圖10可知,通過與圖10A各標準品的色譜峰保留時間相對比,銀杏果經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后,銀杏酸的的含量發(fā)生了顯著的變化,其中銀杏新酸(C13∶0)的含量略微下降,銀杏酸(C15∶1)和十七烷一烯銀杏酸(C17∶1)含量顯著下降(P<0.05),十七烷二烯銀杏酸(C17∶2)含量幾乎下降為零。銀杏發(fā)酵粉中銀杏酸含量2.96 μg/g,低于2015版《中國藥典》規(guī)定的限量標準10 μg/g,與干燥粉碎的銀杏粉(G)相比,銀杏酸脫除率達85.4%,說明銀杏果經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后,對銀杏酸的脫毒效果非常顯著,達到了減毒的目的,提高了銀杏果的食用安全性?？赡苁且驗樵趦?yōu)勢植物乳桿菌和釀酒酵母菌的發(fā)酵作用下,銀杏酸發(fā)生了轉化,降低了含量[10,28]。

表4 銀杏發(fā)酵粉的主要活性成分Table 4 The main active components of ginkgo fermentation powder

圖10 各試樣HPLC圖譜Fig.10 HPLC chromatogram of different samples注:A. 銀杏酸標準品的的HPLC圖譜; B. 銀杏粉中銀杏酸的HPLC圖譜; C. 銀杏發(fā)酵粉中銀杏酸的HPLC圖譜。

2.4.2 銀杏發(fā)酵粉主要活性成分分析 銀杏發(fā)酵粉的主要活性成分含量見表4。

由表4可知,銀杏果經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后,與普通的銀杏粉相比,銀杏發(fā)酵粉的粗蛋白、脂肪、總酸、可溶性蛋白、還原糖、黃酮和多酚含量顯著增加(P<0.05),淀粉和銀杏酸含量顯著降低(P<0.05)。說明經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后,銀杏果中大分子物質生化轉化為可溶性小分子物質,同時消耗了糖,可溶性蛋白、黃酮、多酚等活性成分含量顯著增加,銀杏酸毒性成分含量顯著降低。

在發(fā)酵的過程中,糖化酶、淀粉酶將銀杏果中的淀粉酶解成葡萄糖等小分子糖類,為植物乳桿菌和釀酒酵母的生長代謝提供碳源,并減弱了其與蛋白的相互作用力,使得蛋白的溶解性增大[29]。植物乳桿菌將銀杏果蛋白水解成小分子的可溶性蛋白、多肽和氨基酸[30],同時發(fā)酵后基質的pH下降,啟動了銀杏果內源性蛋白酶,將大分子蛋白降解,提高了銀杏發(fā)酵粉中可溶性蛋白含量。黃酮類物質是銀杏果中的主要活性成分,常與糖結合,以黃酮苷的形式存在[31]。糖化酶和淀粉酶可水解銀杏果中的淀粉,打斷糖苷鍵,釋放出黃酮物質,黃酮的含量增加。酚酸類物質經(jīng)發(fā)酵后,由結合態(tài)轉化為游離態(tài),多酚含量增加。

3 結論

在單因素試驗基礎上,以DPPH自由基清除率為響應值,通過響應面分析對銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化,經(jīng)方差分析和響應面圖得知,各因素對銀杏發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響順序為植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比>混合發(fā)酵劑添加總量>糖化酶和α淀粉酶添加質量比>料液比。在復合酶制劑添加總量0.3 g/100 g,酶解2 h,發(fā)酵12 h的基礎上,確定銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵最佳工藝為:料液比1∶6,糖化酶和α淀粉酶添加質量比2∶1,混合發(fā)酵劑添加總量3.12 g/100 g,植物乳桿菌和釀酒酵母添加質量比1∶1,測得DPPH自由基清除率為69.7±1.1%,與模型預測值基本一致。銀杏果經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后,與未處理的銀杏粉(G)相比,銀杏發(fā)酵粉(GFP)中DPPH自由基清除率增加了257.4%;可溶蛋白含量4.47±0.13 g/100 g,增加了330%;黃酮含量0.15±0.01 mg/g,增加了50%;多酚含量2.49±0.04 mg/g,增加了118%;銀杏酸含量2.96±0.32 μg/g,脫除率達85.4%。說明酶菌協(xié)同發(fā)酵能顯著提高銀杏果的抗氧化活性,制得的銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白、黃酮、多酚等抗氧化成分含量顯著增加、有毒成分銀杏酸含量顯著降低,為銀杏果的精深加工提供物質基礎,為銀杏果的高效利用開創(chuàng)了新的途徑。