劉學(xué)成,王文亮,弓志青,崔文甲,宋莎莎,張 劍,賈鳳娟

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所,農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點實驗室, 山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室,山東濟南 250100)

膳食纖維(dietary fiber,DF)是一種多糖,被稱為“第七大營養(yǎng)素”,主要存在于粗糧、蔬菜、水果以及菌菇中,它既不能被消化,也不能為人體提供能量,按照其是否溶于水可分為可溶性膳食纖維(SDF)和不可溶性膳食纖維(IDF)[1]?？扇苄陨攀忱w維包括水果蔬菜中的果膠,海藻中的藻膠以及魔芋中葡甘聚糖,它能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu),減少腸道對葡萄糖和脂類吸收,降低血液的血糖、血脂、膽固醇指標(biāo),減少心腦血管病、糖尿病和某些癌癥的發(fā)病風(fēng)險[2-4]。不溶性膳食纖維包括纖維素、木質(zhì)素、半纖維素等,主要存在于谷物中,能夠增加餐后飽腹感,吸收水分并促進胃腸蠕動,預(yù)防便秘并能起到減肥的功效[5]。茶樹菇(Agrocybeaegerita),學(xué)名為柱狀田頭菇,是一種食藥兩用的真菌,屬擔(dān)子菌綱傘菌目田頭菇屬,其主要分布在亞熱帶和溫帶地區(qū)。茶樹菇具有糖高脂低、熱量低和鹽量少等特點,是少有的“一高三低”的保健食品,因而有“中華神菇”之稱[6]。茶樹菇中的膳食纖維含量豐富,以β-葡聚糖為主,具有很強的保健功能,因此提取茶樹菇的膳食纖維具有非常重要的意義。

胡曉倩等[7]采用熱水浸提法提取茶樹菇多糖,觀察料液比、提取時間、pH等因素對茶樹菇多糖提取率的影響。發(fā)現(xiàn)在高溫弱堿性的條件下茶樹菇多糖的提取率較高,達到30.56%。付桂明等[8]通過分離純化得到5種茶樹菇的可溶性多糖,并分析其中含量最大的多糖AP2的物理化學(xué)構(gòu)成。發(fā)現(xiàn)AP2分子量高達122 460 Da,其結(jié)構(gòu)是由D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖和D-半乳糖組成的D型多糖。

目前僅對于茶樹菇多糖有所研究,但對茶樹菇膳食纖維研究較少,本實驗以提取的茶樹菇DF為原料(其中SDF含量為1.2%),對茶樹菇DF進行改性,提高SDF的含量,改善膳食纖維的理化性質(zhì),為茶樹菇的產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶樹菇DF粉 實驗提取獲得,具體參數(shù):茶樹菇烘干粉碎→料液比1∶30溶解→調(diào)節(jié)pH為7→控溫超聲處理→加入復(fù)合蛋白酶→恒溫水浴振蕩酶解→高溫滅酶→加入α-淀粉酶→恒溫水浴振蕩酶解→高溫滅酶→加入4倍體積乙醇醇沉→沉淀用丙酮洗滌→抽濾冷凍干燥→茶樹菇DF;纖維素酶(比活力50000 U/g) 上海源葉生物科技有限公司;壓榨玉米油 山東魯花集團有限公司;鹽酸 分析純,煙臺萊陽市精細(xì)化工廠;氯化鈉 分析純,天津市申泰化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;膽固醇、鄰苯二甲醛 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;95%乙醇 分析純,天津富宇精細(xì)化工有限公司;丙酮 分析純,煙臺遠東精細(xì)化工有限公司;無水葡萄糖 食品級,山東西王藥業(yè)有限公司。

LDZ-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;HH-S6恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司;SHZ-A恒溫水浴振蕩器 上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;天平 OHAUS公司;ZN-20L小型粉碎機 北京興時利和科技發(fā)展有限公司;高速冷凍離心機 CR22DIII 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 改性茶樹菇膳食纖維的制備

1.2.1.1 纖維素酶改性茶樹菇膳食纖維 纖維素酶法改性:取干燥的茶樹菇DF粉2.0 g于錐形瓶中,按照一定的料液比加水混勻,加入一定量的纖維素酶,55 ℃水浴振蕩一定時間,95 ℃高溫滅酶5 min,冷卻后5000 r/min離心15 min,保留上清液加入4倍體積的95%乙醇醇沉,將白色絮狀物抽濾,并用丙酮洗滌,冷凍干燥得SDF產(chǎn)品[9]。

1.2.1.2 高溫高壓法改性茶樹菇膳食纖維 取干燥的茶樹菇DF粉2.0 g于錐形瓶中,按照一定的料液比加水混勻,放入高壓滅菌鍋(壓力值0.1 MPa)中在一定溫度下滅菌一段時間,冷卻后5000 r/min離心15 min,保留上清液加入四倍體積的乙醇醇沉,將白色絮狀物抽濾,并用丙酮洗滌,冷凍干燥得SDF產(chǎn)品[10]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 纖維素酶法改性單因素設(shè)計 準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品,保持固定參數(shù)不變,料液比1∶35、纖維素酶用量1.5%、纖維素酶解時間2 h,分別探究料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL)、纖維素酶用量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、纖維素酶酶解時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對茶樹菇SDF得率的影響。

1.2.2.2 高溫高壓法改性單因素設(shè)計 準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品,壓力 0.1 MPa,保持固定參數(shù)不變,料液比1∶35、高溫高壓時間30 min、高溫高壓溫度115 ℃分別探究料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL)、高溫高壓溫度(105、110、115、120、125 ℃)、高溫高壓時間(20、30、40、50、60 min)對茶樹菇SDF得率的影響。

1.2.3 正交試驗 采用L9(34)正交實驗優(yōu)化茶樹菇DF改性工藝條件,以可溶性膳食纖維(SDF)得率為評價指標(biāo),分別探究纖維素酶和高溫高壓兩種方法對DF改性效果得影響,確定兩種方法改性的最佳工藝參數(shù),實驗因素與水平設(shè)計見表1和表2。

表1 纖維素酶改性茶樹菇膳食纖維正交試驗因素與水平Table 1 Orthogonal experimental factors of DF modified by cellulase

表2 高溫高壓改性茶樹菇 膳食纖維正交試驗因素與水平Table 2 Orthogonal experimental factors of DF modified by high temperature-high pressure

1.2.4 分析與測定方法

1.2.4.1 持水力測定 取2.0 g干燥樣品,記為質(zhì)量m,置于50 mL離心管中,稱量質(zhì)量為m0,加入40 mL蒸餾水,室溫下振蕩30 min,靜置12 h,5000 r/min離心10 min,棄掉上清液,稱量質(zhì)量為m1,持水力公式如下[11]:

1.2.4.2 膨脹力測定 取1.0 g干燥樣品(m),置于20 mL刻度試管中,記錄樣品體積V0,準(zhǔn)確加入10 mL蒸餾水,室溫下振蕩搖勻,靜置12 h,記錄其膨脹后體積V1,膨脹力計算公式如下[12]:

1.2.4.3 持油力測定 取2.0 g干燥樣品,記為質(zhì)量m,置于50 mL離心管中m0,加入玉米胚芽油40 mL混合均勻,室溫靜置12 h,5000 r/min離心10 min,棄掉上清液,稱量質(zhì)量m1,持油力計算公式如下[13]:

1.2.4.4 陽離子交換能力測定 取1.0 g干燥樣品(m),將樣品浸泡在0.1 mol/L的鹽酸溶液中24 h,之后除去過量的酸,用蒸餾水多次洗滌殘渣,保證溶液pH>4,用10% AgNO3滴定除去溶液中Cl-并將樣品干燥,將殘渣懸浮于50 mL氯化鈉溶液(0.3 mol/L)中,同時用蒸餾水做一個空白試驗,再連續(xù)攪拌24 h,離心(5000 r/min,10 min),上清液用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液滴定,直至pH等于7為止,測定消耗的氫氧化鈉的量[14]。

1.2.4.5 葡萄糖吸附力測定 將1.0 g(m)樣品加入濃度為100 mmol/L的100 mL葡萄糖溶液中(原始溶液葡萄糖物質(zhì)的量記為n1),37 ℃水浴振蕩6 h,5000 r/min離心15 min,取上清液,采用比色法在540 nm測定上清液中葡萄糖含量(n2),葡萄糖吸附力按下式計算[15]。

1.2.4.6 膽固醇吸附能力測定 取市售鮮雞蛋蛋黃,加入9倍質(zhì)量的蒸餾水?dāng)嚧虺扇橐簞驖{,利用鄰苯二甲醛法測定并記錄乳液中膽固醇含量,記為W1。準(zhǔn)確稱量1.0 g茶樹菇膳食纖維樣品,記為m,按料液比1∶25 (g/mL)加入上述稀釋后蛋黃液,攪打均勻,室溫振蕩搖勻4 h,5000 r/min離心15 min,取上清液,記錄上清液中膽固醇含量,記為W2,吸附力計算公式如下[16]:

1.2.4.7 掃描電子顯微 將茶樹菇DF粉過60目篩,取少量DF粉,將樣品緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上,放入離子濺射儀樣品臺上噴金30 s,使用掃描電子顯微鏡觀察采圖[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗重復(fù)次數(shù)為2次,采用SPSS 24和Origin 9.5軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖,正交數(shù)據(jù)采用正交軟件助手2.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 纖維素酶料液比對茶樹菇SDF得率的影響 在纖維素酶用量1.5%、酶解時間2 h的條件下,考察料液比對茶樹菇SDF得率的影響,結(jié)果如圖1所示。從圖1可知,隨著料液比的增加,SDF得率呈現(xiàn)先增加后緩慢減少的趨勢。當(dāng)料液比在1∶30時,茶樹菇SDF得率最高為4.5%。當(dāng)料液比過低時,溶質(zhì)不能充分溶解在水中導(dǎo)致結(jié)果測量不準(zhǔn)確。綜合考慮選取料液比1∶25、1∶30、1∶35三個水平作為正交試驗水平。

圖1 料液比對茶樹菇SDF得率的影響Fig.1 Effect of material and liquid ratio on yield of SDF

2.1.2 纖維素酶用量對茶樹菇SDF得率的影響 在料液比1∶30、酶解時間2 h的條件下,考察纖維素酶用量對茶樹菇SDF得率的影響,結(jié)果如圖2所示。從圖2可知,隨著纖維素酶用量的增加,茶樹菇SDF提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)纖維素酶用量在1.0%時,茶樹菇SDF得率最高為4.4%。當(dāng)纖維素酶量過量,部分SDF也會被分解。綜合考慮選取纖維素酶用量0.5%、1.0%、1.5%三個水平作為正交試驗水平。

圖2 纖維素酶添加量對茶樹菇SDF得率的影響Fig.2 Effect of cellulose dosage on yield of SDF

2.1.3 纖維素酶酶解時間對茶樹菇SDF得率的影響 在料液比1∶30、纖維素酶用量1.5%條件下,考察料液比對茶樹菇SDF得率的影響,結(jié)果如圖3所示。從圖3可知,隨著纖維素酶酶解時間的增加,茶樹菇SDF提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)纖維素酶酶解時間在1.5 h時,茶樹菇SDF得率最高為4.5%。當(dāng)酶解時間繼續(xù)增加時,會造成纖維素酶的過度酶解,導(dǎo)致SDF得率減少。綜合考慮選取酶解時間1.0、1.5、2.0 h三個水平作為正交試驗水平。

圖3 纖維素酶酶解時間對茶樹菇SDF得率的影響Fig.3 Effect of cellulose hydrolysis time on yield of SDF

2.1.4 高壓料液比對茶樹菇SDF得率的影響 在高壓溫度120 ℃、高壓時間40 min的條件下,考察料液比對茶樹菇SDF得率的影響,結(jié)果如圖4所示。從圖4可知,隨著料液比的增加,茶樹菇SDF得率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)料液比在1∶30時,茶樹菇SDF得率最高為6.3%。當(dāng)料液比過低(預(yù)實驗結(jié)果證明,當(dāng)料液比低于1∶25)時,同樣會因為溶質(zhì)不能充分溶解導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生偏差。綜合考慮選取料液比1∶25、1∶30、1∶35三個水平作為正交試驗水平。

圖4 料液比對茶樹菇SDF得率影響Fig.4 Effect of material and liquid ratio on yield of SDF

2.1.5 高壓溫度對茶樹菇SDF得率的影響 在料液比1∶30、高壓時間40 min的條件下,考察高壓溫度對茶樹菇SDF得率的影響,結(jié)果如圖5所示。從圖5可知,隨著高壓溫度的增加,茶樹菇SDF得率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,當(dāng)高壓溫度在120 ℃時,茶樹菇SDF得率最高為6.4%。當(dāng)高壓溫度低于120 ℃時,高溫破壞DF分子內(nèi)氫鍵,部分結(jié)晶區(qū)遭到破壞,促使部分IDF轉(zhuǎn)變?yōu)镾DF,當(dāng)高壓溫度高于120 ℃時,SDF得率開始降低[18]。綜合考慮選取高壓溫度115、120、125 ℃三個水平作為正交試驗水平。

圖5 高壓溫度對茶樹菇SDF得率的影響Fig.5 Effect of modified temperature on yield of SDF

2.1.6 高壓時間對茶樹菇SDF得率的影響 在料液比1∶30、高壓溫度120 ℃條件下,考察高壓時間對茶樹菇SDF得率的影響,結(jié)果如圖6所示。從圖6可知,隨著蒸煮時間的增加,SDF得率呈現(xiàn)先增加后持平的趨勢,當(dāng)蒸煮時間在40 min時,茶樹菇SDF得率最高為6.5%。當(dāng)蒸煮時間小于40 min時,隨著時間的增長,降低了部分DF分子量和聚合度,促使部分IDF轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿拥腟DF,當(dāng)蒸煮時間大于40 min時,SDF得率保持持平[19]。綜合考慮選取蒸煮時間30、40、50 min三個水平作為正交試驗水平。

圖6 高壓時間對茶樹菇SDF得率的影響Fig.6 Effect of modified time on yield of SDF

2.2 工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 纖維素酶改性工藝參數(shù)優(yōu)化 表3為纖維素酶改性正交試驗設(shè)計與結(jié)果,表4為高溫高壓改性正交試驗設(shè)計與結(jié)果。從表3中的極差(R)分析得出各因素對茶樹菇改性SDF得率影響的主次順序是B>A>C,即纖維素酶用量>料液比>酶解時間。最佳工藝組合是A2B2C3,即料液比1∶30,纖維素酶用量1.5%,酶解時間2.0 h。按照最佳水平組合進行驗證性實驗,茶樹菇SDF得率為4.9%。從表4中的極差(R)分析得出各因素對茶樹菇改性SDF得率影響的主次順序是C>B>A,即改性時間>改性溫度>料液比。最佳工藝組合是A2B3C3,即料液比1∶30,改性溫度125 ℃,改性時間50 min。按照最佳水平組合進行驗證性實驗,茶樹菇SDF得率為6.8%,高溫高壓改性效果要優(yōu)于纖維素酶改性效果。

表3 纖維素酶改性正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results of cellulase modification

表4 高溫高壓改性正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Orthogonal experimental design and results of high temperature-high pressure modification

2.3 改性方法對茶樹菇DF理化性質(zhì)的影響

持水力、膨脹性、持油力是膳食纖維理化性質(zhì)重要的衡量標(biāo)準(zhǔn),三種物理性質(zhì)指數(shù)越大,說明膳食纖維的生理活性越好[20],高持水力和持油力的膳食纖維對糖尿病的預(yù)防和治療起到非常重要的作用[21]。圖7～圖12為改性方法對茶樹菇DF持水能力、膨脹能力、持油能力、陽離子交換能力、葡萄糖吸收能力和膽固醇吸附能力的影響。

圖7 改性方法對茶樹菇DF持水能力的影響Fig.7 Comparison of modification methods of DF water holding capacity

圖8 改性方法對茶樹菇DF膨脹力的影響Fig.8 Comparison of modification methods of DF swelling power

圖9 改性方法對茶樹菇DF持油力的影響Fig.9 Comparison of modification methods of DF oil holding capacity

從圖7可以看出,未改性的茶樹菇DF持水力為5.4 g/g,兩種改性方法使得茶樹菇DF的持水力分別提高到7.7和8.8 g/g。因此高溫高壓改性的DF持水能力要高于纖維素酶改性的持水能力。從圖8可以看出,未改性的茶樹菇DF膨脹力為2.7 mL/g,兩種改性方法使得茶樹菇DF膨脹力分別提高到3.3和3.6 mL/g。因此高溫高壓改性的DF膨脹力要稍高于纖維素酶改性的膨脹力。從圖9可以看出,未改性的茶樹菇DF持油能力為3.7 g/g,兩種改性方法使得茶樹菇DF的持油能力分別提高到5.4和5.1 g/g。因此纖維素酶改性的DF持油力要稍高于高溫高壓改性的持油能力。

膳食纖維可以與陽離子進行可逆交換,這種性質(zhì)取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中的一些羧基和羥基側(cè)鏈基團[22]。從圖10可以看出,在NaOH溶液消耗量為0～1 mL時,未改性與改性茶樹菇DF溶液pH上升都較慢;在NaOH消耗量為1～3 mL時,未改性與改性茶樹菇DF溶液pH上升較快,其中高溫高壓改性溶液pH上升最快,pH為7時消耗NaOH溶液為1.6 mL;纖維素酶改性溶液在pH為7時,消耗NaOH溶液為1.7 mL;未改性茶樹菇DF溶液在pH為7時,消耗NaOH溶液為2 mL。在NaOH消耗量超過3 mL時,未改性與改性茶樹菇DF溶液的pH上升緩慢,直至接近pH=11。在相同pH條件下,消耗的NaOH體積越小則陽離子交換能力越高。經(jīng)過顯著性差異分析,高溫高壓改性效果和纖維素酶改性優(yōu)于未改性,但二者無顯著性差異。

圖10 改性方法對茶樹菇DF陽離子交換能力的影響Fig.10 Comparison of two modification methods of DF cation exchange power

從圖11中我們可以看出,兩種改性方法都能顯著提高膳食纖維的葡萄糖吸收力,葡萄糖吸附力從12.5 mmol/g分別提高到17.8和18.3 mmol/g,但纖維素改性和高壓改性之間無顯著性差異。葡萄糖吸收力主要受可溶性膳食纖維含量的影響,改性使茶樹菇可溶性膳食纖維含量提高,通過改性使膳食纖維結(jié)構(gòu)表面積增大,表面疏松多孔,對葡萄糖吸收力產(chǎn)生積極作用,產(chǎn)生良好的水合作用[23],與測得的持水力相對應(yīng)。

圖11 改性方法對茶樹菇DF葡萄糖吸收能力的影響Fig.11 Comparison of two modification methods of DF glucose absorption

圖12 改性方法對茶樹菇DF膽固醇吸附能力的影響Fig.12 Comparison of modification methods of DF cholesterol adsorption

圖13 未改性和改性茶樹菇DF掃描電子顯微鏡照片(3000×)Fig.13 Two modification methods of DF electron microscope structure analysis(3000×)

體內(nèi)膽固醇含量過高是誘發(fā)心腦血管疾病的主要病因之一,像果膠、β-葡聚糖等可溶性膳食纖維可以在胃腸中形成凝膠態(tài),增加胃腸中食物粘稠度,增加對食物的膽固醇的吸收從而降低腸道對膽固醇的吸收[24]。從圖12可以看出,兩種改性方法同樣都能顯著(P<0.05)提高膽固醇吸附力,膽固醇吸附力從3.5 mg/g分別上升到7.8和7.4 mg/g,與測得的持油力相對應(yīng)。

2.4 改性方法對茶樹菇DF微觀形態(tài)的影響

從圖13中可以看出,未改性和改性茶樹菇DF結(jié)構(gòu)差別較大,未改性處理的DF結(jié)構(gòu)較為緊密;經(jīng)過纖維素酶改性處理的DF結(jié)構(gòu)中孔狀結(jié)構(gòu)較多,茶樹菇膳食纖維主要成分為纖維素,纖維素酶分解一部分纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)镾DF,造成膳食纖維表面孔狀結(jié)構(gòu)增多;而高溫高壓改性的DF結(jié)構(gòu)孔表面疏松多孔,且表面多呈現(xiàn)絲狀結(jié)構(gòu),原因是高溫迫使DF結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使得相當(dāng)一部分不溶性膳食纖維轉(zhuǎn)換成可溶性膳食纖維溶解在水中,導(dǎo)致表面結(jié)構(gòu)多孔疏松,由此可以看出，兩種改性方法均可以使茶樹菇膳食纖維結(jié)構(gòu)具有更大的表面積和多孔結(jié)構(gòu),且高溫高壓改性的效果比纖維素酶改性效果更為顯著。

3 結(jié)論

本研究采用兩種改性方法對茶樹菇DF進行改性,通過單因素試驗和正交實驗優(yōu)化得到最佳工藝優(yōu)化參數(shù),發(fā)現(xiàn)高溫高壓改性效果(SDF得率為6.8%)要優(yōu)于纖維素酶改性效果(SDF得率為4.9%),并對比改性前后理化性質(zhì)的不同,發(fā)現(xiàn)兩種方法均能提高膳食纖維的理化性質(zhì),高溫高壓改性的膳食纖維的理化指標(biāo)更為優(yōu)越,這是因為可溶性膳食纖維具有更好的理化性質(zhì),這與改性的結(jié)果相吻合。將改性后的茶樹菇膳食纖維制作成功能性食品應(yīng)用到飲料、面包、餅干等食品中,對于今后充分發(fā)揮茶樹菇產(chǎn)品的附加值具有深遠意義。