秦家碧 盛小奇 王婷婷 黃鵬 李依寰 羅柳 劉亦萍 刁靜怡 朱平

（1.廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東廣州 510100；2.中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計系，湖南長沙 410078；3.湖南省婦幼保健院國家衛(wèi)健委出生缺陷研究與預(yù)防重點實驗室，湖南長沙 410008；4.湖南省兒童醫(yī)院心胸外科，湖南長沙 410007）

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）是指胚胎發(fā)育時期由于心臟及大血管的形成障礙而引起的局部解剖結(jié)構(gòu)異常，或出生后應(yīng)閉合的通道未閉合而引起的心臟、血管功能異常，是我國最常見的出生缺陷和嬰幼兒非感染性死亡的主要原因。全球發(fā)病率為8.22‰［1］，我國為8.98‰［2］，發(fā)病呈逐年上升趨勢［3］。此外，即使經(jīng)過有效干預(yù)，CHD患者仍存在較高的心血管疾病及死亡風(fēng)險，并可能在行為、認(rèn)知、注意力和運動表現(xiàn)等方面存在功能缺陷［4-5］。同其他復(fù)雜疾病一樣，CHD病因涉及遺傳和環(huán)境因素。流行病學(xué)證據(jù)顯示圍孕期增補葉酸或含葉酸的多種維生素能有效降低CHD的發(fā)生風(fēng)險［6］，但這種危險降低的機(jī)制并不清楚。調(diào)查與葉酸代謝、吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)酶基因的遺傳變異有助于解釋葉酸相關(guān)出生缺陷的發(fā)生機(jī)制。許多學(xué)者已經(jīng)將焦點集中于影響葉酸代謝的酶基因上，包括5,10亞甲基四氫葉酸還原酶基因、蛋氨酸合酶還原酶基因、胱硫醚β合酶基因等［7-8］。然而，在機(jī)體利用葉酸過程中，除上述與葉酸代謝有關(guān)的酶外，尚有葉酸轉(zhuǎn)運過程中涉及到的受體及載體，如葉酸受體和還原葉酸載體（reduced folate carrier，RFC）也在葉酸吸收轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。因此，RFC基因的突變或表達(dá)異?？赡艹蔀樵心溉~酸正常代謝過程的重要影響因素。值得注意的是，雖然有研究顯示RFC基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與CHD發(fā)生存在關(guān)聯(lián)［10］，但這些研究只關(guān)注了該基因的一個位點（rs1051266）。RFC基因上除了已經(jīng)關(guān)注的位點外，尚有其他SNP位點。本研究首次關(guān)注母親RFC基因多個位點（rs10483080、rs2236484、rs3788190、rs3788189、rs12483377、rs2330183） 與子代CHD的關(guān)聯(lián)，能為CHD遺傳易感因素研究提供流行病學(xué)依據(jù)，也為揭示葉酸預(yù)防出生缺陷的潛在作用機(jī)制提供線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象

采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對照研究，招募2017年11月至2020年3月在湖南省兒童醫(yī)院心胸外科就診的683例CHD嬰兒的母親為病例組。診斷的CHD亞型包括：房間隔缺損、室間隔缺損、房室隔缺損、動脈導(dǎo)管未閉、主肺動脈隔缺損、法洛四聯(lián)癥、完全大動脈轉(zhuǎn)位。招募同期因感冒、腹瀉、外傷等就診于同一家醫(yī)院并排除任何畸形的740例嬰兒的母親為對照組。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

所有CHD患兒均為單純性CHD，排除其他系統(tǒng)畸形，均符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且經(jīng)心臟彩超或術(shù)中探查證實。對照組患兒經(jīng)體檢初篩及心臟彩超證實心臟結(jié)構(gòu)、功能均正常，且無染色體異常及系統(tǒng)性畸形等疾病。研究對象需滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）了解本項目并簽署知情同意，愿意配合本課題調(diào)查研究；（2）彼此無親緣關(guān)系；（3）完成調(diào)查問卷并愿意提供血標(biāo)本用于本課題基因SNP檢測；（4）漢族；（5）單胎受孕。本研究排除輔助生殖技術(shù)受孕、多胎受孕或患有精神障礙性疾病不能配合完成調(diào)查的產(chǎn)婦。為了降低對孕前或孕期環(huán)境暴露的回憶偏倚，本研究也排除產(chǎn)后超過1年的產(chǎn)婦。

1.3 問卷調(diào)查

本研究使用統(tǒng)一的問卷調(diào)查表，所有調(diào)查員經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)，以訪談的形式對研究對象進(jìn)行流行病學(xué)問卷調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括：產(chǎn)婦基本社會人口學(xué)特征（孕齡、文化程度、家庭年收入、民族、戶籍等）、出生缺陷家族史、個人先天畸形史、家族近親婚配史、既往不良妊娠史（自然流產(chǎn)、死胎或死產(chǎn)、早產(chǎn)、低出生體重、妊娠糖尿病、妊娠高血壓等）、圍孕期感冒和發(fā)熱史、圍孕期生活行為史（主動吸煙、二手煙暴露、飲酒史等）、圍孕期葉酸補充情況、圍孕期環(huán)境污染物接觸史等。圍孕期定義為懷孕前3個月至懷孕后12周。為防止回憶偏倚，本研究結(jié)合孕母婦幼保健手冊，以進(jìn)一步確認(rèn)圍孕期相關(guān)暴露信息。

1.4 基因多態(tài)性檢測

完成問卷后，采集產(chǎn)婦5 mL靜脈血用于基因SNP檢測。本研究選擇RFC基因作為備檢基因，并參考已發(fā)表的文獻(xiàn)［11］所介紹的方法來選擇相關(guān)候選位點。檢索NCBI和HapMap數(shù)據(jù)庫，查詢并核實RFC基因主要的SNP位點，要求選擇tanSNP時r2所設(shè)的閾值不小于0.8，且最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）不低于10%。最終，6個 位 點 （rs10483080、rs2236484、rs3788190、rs3788189、rs12483377、rs2330183）被確定為本研究的待檢位點。采用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA，USA）提取血細(xì)胞中的DNA，用紫外分光光度計測定DNA溶液的濃度和純度。應(yīng)用MassARRAY飛行時間質(zhì)譜對6個位點的SNP進(jìn)行檢測，具體檢測工作由博淼生物科技（北京）有限公司完成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用EpiData 3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用率或構(gòu)成比（%）描述，組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法；等級資料比較采用Wilcoxon秩和檢驗。對對照組人群基因型分布頻率進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗（如果P＞0.01，說明對照樣本符合HWE）。采用logistic回歸模型計算優(yōu)勢比（odds ratio，OR）和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI），以評估RFC基因SNP與CHD的關(guān)聯(lián)性。采用基因模型選擇（genetic model selection，GMS）的方法判定各位點與疾病關(guān)聯(lián)的遺傳模型［當(dāng)哈迪-溫伯格不平衡趨勢檢驗 （Hardy-Weinberg disequilibrium trend test，HWDTT）ZHWDTT＜-1.645時，判定為顯性模型；ZHWDTT＞1.645時，判定為隱性模型；ZHWDTT＞-1.645或ZHWDTT＜1.645時，判定為加性模型］。利用Haploview 4.2軟件計算各位點之間的r2值，r2＞0.8表明兩個位點之間存在連鎖不平衡；同時，利用四配子檢驗的方法構(gòu)建單倍型，并評估各單倍型與CHD發(fā)生的關(guān)聯(lián)。采用廣義多因子降維法探討各位點間交互作用與CHD發(fā)生的關(guān)聯(lián)。涉及多重比較時，采用錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）校正的方法調(diào)整P值以控制假陽性率，得到校正P值（QFDR），并以QFDR≤0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較

病例組和對照組產(chǎn)婦戶籍、文化程度、家庭年收入、家族出生缺陷史和近親婚配史、既往不良妊娠史（死胎或死產(chǎn)、妊娠糖尿病、妊娠高血壓）及圍孕期感冒或發(fā)熱史、葉酸補充、不良生活習(xí)慣（主動或被動吸煙、飲酒）和環(huán)境污染物接觸史方面比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這些因素將作為后續(xù)多因素分析的混雜因素進(jìn)行控制，見表1。

表1 病例組和對照組的基線資料比較 ［例（%）］

2.2 母親RFC基因多態(tài)性與子代CHD的關(guān)聯(lián)分析

HWE檢驗顯示，對照組人群RFC基因有1個位點（rs10483080）的基因型分布不符合HWE（P＜0.001），因此后續(xù)分析中不納入該位點（表2）。多因素logistic回歸分析顯示，在調(diào)整表1基線資料比較中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的混雜因素后，母親RFC基因的兩個位點rs2236484和rs2330183的多態(tài)性與CHD風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)（表3）。在位點rs2236484上，攜帶AG（OR=1.91，95%CI：1.45～2.51；QFDR＜0.001）或GG（OR=1.96，95%CI：1.40～2.75；QFDR＜0.001）基因型的母親與攜帶AA基因型相比，子代CHD的風(fēng)險顯著增加；該位點的顯性模型（OR=1.93，95%CI：1.48～2.50；QFDR＜0.001）和加性模型（OR=1.43，95%CI：1.21～1.69；QFDR＜0.001）與CHD風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)。在位點rs2330183上，攜帶CT（OR=1.39，95%CI：1.06～1.83；QFDR=0.045） 基因型的母親與攜帶CC基因型比較顯著增加了子代CHD的風(fēng)險；該位點顯性模型（OR=1.39，95%CI：1.07～1.79；QFDR=0.030）與CHD風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)。

表2 母親RFC基因型分布頻數(shù)及HWE檢驗 （例）

表3 母親RFC基因多態(tài)性與CHD關(guān)聯(lián)的logistic回歸分析

表3 （續(xù)）

2.3 母親RFC基因各位點遺傳模型分析

基于HWDTT，利用病例組和對照組在各位點不同基因型頻率，計算各位點對應(yīng)的統(tǒng)計量ZHWDTT，并通過與C=1.645相比，判定各位點的遺傳模型，結(jié)果見表4?？梢?，母親RFC基因與子代CHD風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)的兩個位點rs2236484和rs2330183的遺傳模型均為顯性模型。

表4 各位點遺傳模型分析

2.4 連鎖不平衡及單倍型分析

連鎖不平衡分析顯示，母親RFC基因的兩個位點rs3788189和rs3788190之間存在連鎖不平衡（r2=0.916），提示兩個位點間強(qiáng)關(guān)聯(lián)（表5）。單倍型分析顯示，RFC基因的5個位點共形成2個單倍型塊（Block）。Block1涉及兩個位點rs12483377和rs2236484，構(gòu)成3種單倍型：G-A、G-G和A-G。Block2涉及兩個位點rs3788189和rs3788190，構(gòu)成3種單倍型：G-A、T-G和G-G（圖1）。在Block1中，母親攜帶單倍型G-G（OR=1.21，95%CI：1.03～1.41）顯著增加子代CHD的風(fēng)險；在Block2中，母親攜帶單倍型T-G（OR=1.25，95%CI：1.07～1.46）顯著增加子代CHD的風(fēng)險（表6）。

2.5 位點間交互作用分析

采用廣義多因子降維法分析RFC基因各位點間的交互作用。結(jié)果顯示，2個位點（rs2236484和rs2330183）的一階交互作用、3個位點（rs2236484、rs3788189和rs2330183）的二階交互作 用 、4個 位 點 （rs2236484、rs3788189、rs12483377和rs2330183）的三階交互作用可能與CHD的發(fā)生風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)（P=0.001），見表7。

表5 基因位點連鎖不平衡檢驗

圖1 RFC基因各位點連鎖不平衡圖 圖中紅色方框代表位點連鎖不平衡的程度，顏色越深表示位點之間連鎖不平衡強(qiáng)度越強(qiáng)?？蛑袛?shù)值為連鎖不平衡指標(biāo)的具體值，接近于100，提示兩位點之間連鎖不平衡強(qiáng)度越強(qiáng)；接近于0，則提示兩位點連鎖不平衡強(qiáng)度越弱，即趨向于遺傳平衡。數(shù)字1～5分別對應(yīng)數(shù)字上方的位點rs號。

表6 單倍型分析及其在病例組和對照組中的分布情況

表7 RFC基因各位點間交互作用分析

3 討論

母親妊娠前后增補葉酸或含葉酸的維生素可以有效降低神經(jīng)管畸形、唇腭裂及CHD的發(fā)病風(fēng)險［6，12-13］。因此，圍孕期增補葉酸已成為預(yù)防神經(jīng)管畸形等先天缺陷的一級預(yù)防措施。然而，妊娠期增補葉酸可以降低出生缺陷發(fā)生風(fēng)險的機(jī)制仍不清楚。研究影響葉酸的細(xì)胞吸收、轉(zhuǎn)運及代謝的遺傳變異能幫助解釋一部分葉酸相關(guān)出生缺陷的發(fā)病機(jī)制。目前，國內(nèi)外的研究大多只關(guān)注葉酸代謝相關(guān)基因的遺傳變異對CHD的影響。本研究分析了母親RFC基因的6個SNP與子代CHD的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，RFC基因rs2236484和rs2330183位點的多態(tài)性與子代CHD的發(fā)生顯著相關(guān)。RFC基因位于21號染色體（21q22.2-22.3），編碼分子量在80～120 kDa間的膜蛋白，對還原葉酸具有高親和力［14］。RFC主要的生理功能是與葉酸受體共同作用完成葉酸從組織到細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，介導(dǎo)葉酸在腸道的吸收，以維持細(xì)胞內(nèi)的葉酸濃度［15］。作為葉酸轉(zhuǎn)運的主要載體，還原葉酸載體促進(jìn)葉酸向胎盤的轉(zhuǎn)移，有利于DNA合成和細(xì)胞增生，對胚胎的生長和分化具有重要意義［16］。已有研究表明RFC基因多態(tài)性與血漿中葉酸水平降低和同型半胱氨酸水平升高顯著相關(guān)［14］。因此，RFC基因突變或異常表達(dá)可能導(dǎo)致RFC酶活性降低，RFC轉(zhuǎn)運葉酸能力下降，葉酸的正常代謝受到影響進(jìn)而導(dǎo)致組織發(fā)育異常，從而增加CHD的風(fēng)險［17］。

既往關(guān)于RFC基因多態(tài)性與疾病的研究多集中在神經(jīng)管畸形和顱面畸形［9，18-19］，僅有3項研究評估了其與CHD的關(guān)聯(lián)［10，20-21］。但是這些研究都只關(guān)注了RFC基因上的一個位點rs1051266（A80G），結(jié)果表明rs1051266位點突變與子代CHD、神經(jīng)管畸形及顱面畸形等出生缺陷的高患病風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)［10，20-21］。本研究首次關(guān)注了RFC基因上多個位點 （rs10483080、rs2236484、rs3788190、rs3788189、rs12483377、rs2330183）與子代CHD的關(guān)系，為揭示RFC基因的遺傳變異與CHD發(fā)病機(jī)制的關(guān)系提供潛在的線索。此外，本研究還對各位點的遺傳模型進(jìn)行了篩選并在分析單個位點基因多態(tài)性的基礎(chǔ)上進(jìn)行了單倍型分析。由于在復(fù)雜疾病的研究中很難事先明確基因的遺傳模式，且錯誤的遺傳模型會降低分析的檢驗效能，因此對單個位點的遺傳模型進(jìn)行篩選能更清晰地明確基因在疾病發(fā)生中的作用［22-23］。RFC基因各位點的遺傳模型分析結(jié)果顯示，與子代CHD發(fā)生相關(guān)的rs2236484和rs2330183位點均為顯性模型。單倍型是等位基因的線性排列，具有整體遺傳的趨勢［24］。在基因與疾病的關(guān)聯(lián)分析中結(jié)合單倍型有助于更精準(zhǔn)地定位致病基因。RFC基因的5個位點共形成2個單倍型塊，Block1中的單倍型G-G與Block2中的單倍型T-G均顯著增加子代CHD的風(fēng)險。

本研究的局限性：第一，作為一項以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對照研究，本研究在資料的收集上不可避免地存在回憶偏倚。為了減少這種偏倚，選擇1歲以內(nèi)兒童的母親作為研究對象并結(jié)合孕母婦幼保健手冊確認(rèn)圍孕期相關(guān)暴露信息。第二，本研究只納入活產(chǎn)住院的CHD患者，那些因為CHD流產(chǎn)的病例并未納入，這可能導(dǎo)致選擇性偏倚。第三，由于樣本量的限制，本研究未對RFC基因多態(tài)性與不同CHD亞型的關(guān)聯(lián)進(jìn)行評估。

綜上所述，母親RFC基因兩個位點（rs2236484和rs2330183）的遺傳變異與子代CHD的發(fā)生風(fēng)險升高顯著相關(guān)，并且該基因各位點之間在CHD的發(fā)生中存在交互作用，這為CHD遺傳易感因素的研究提供了新的流行病學(xué)證據(jù)，也為揭示葉酸預(yù)防出生缺陷的潛在作用機(jī)制提供線索。然而，RFC基因的遺傳變異如何影響CHD發(fā)生的潛在機(jī)制仍不明確，未來需要開展更多研究。

志謝：本研究得到了湖南省兒童醫(yī)院心胸外科的全力支持。該科室工作人員在繁忙的工作中承擔(dān)了收集病例資料及收集標(biāo)本的任務(wù)，同時為我們進(jìn)行現(xiàn)場調(diào)查提供支持。在此，我們對該科室工作人員表示誠摯的感謝！

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。