徐林飛，張海濤，劉 晟，蔡海榮，胡恩平

(臺(tái)州市立醫(yī)院 泌尿外科，浙江 臺(tái)州 318000)

膀胱癌(bladder cancer)是世界范圍常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、細(xì)胞分化差、侵襲能力強(qiáng)等特點(diǎn)?；熕幍膽?yīng)用盡管降低了膀胱癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，但其在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)往往引起機(jī)體嚴(yán)重的不良反應(yīng)。白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草的全草，除具有清熱解毒、利尿消腫功效外，其通過調(diào)控細(xì)胞周期、抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡對(duì)肺癌、卵巢癌等惡性腫瘤表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用[1-2]。此外，白花蛇舌草對(duì)膀胱癌細(xì)胞亦具有顯著的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用[3-4]。然而，其抗腫瘤作用的潛在機(jī)制并不明確。miR-485-5p是近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，多種癌中miR-485-5p表達(dá)下調(diào)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[5]。黃岑苷通過上調(diào)miR-485-5p表達(dá)可抑制前列腺細(xì)胞增殖[6]。然而miR-485-5p在膀胱癌是否具有抑癌作用尚未可知。本研究通過觀察白花蛇舌草對(duì)膀胱癌細(xì)胞系KU-19-19增殖、遷移、侵襲以及miR-485-5p表達(dá)的影響，探討白花蛇舌草抗腫瘤作用的潛在分子機(jī)制，以期為膀胱癌治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌細(xì)胞系KU-19-19(南京科佰生物)；白花蛇舌草(Hedyotis diffusa，安徽中藥材批發(fā)市場(chǎng))；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit，CCK-8)(日本同仁化學(xué)研究所)；miR-485-5p模擬物(miR-485-5p mimics)、抑制物(anti-miR-485-5p)及其相應(yīng)對(duì)照(miR-NC、anti-miR-NC)(廣州銳博生物科技有限公司)；兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)抗體、兔抗MMP9抗體、兔抗磷酸化的磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphorylated phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，p-PI3K)抗體、兔抗磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-AKT)抗體、兔抗β-actin抗體、山羊抗兔二抗(上海艾博抗貿(mào)易公司)；LY294002(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和分組處理：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)KU-19-19細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，按照1∶3比例稀釋進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取干燥白花蛇舌草干燥全草，浸泡煮沸一段時(shí)間后，過濾，將濃縮液過濾后加入乙酸乙酯和乙醇抽提，獲得純度較高的提取物，過濾除菌后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹3]。將KU-19-19細(xì)胞分別用白花蛇舌草濃度為25、50和100 μmol/L的培養(yǎng)液處理48 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，確定最適白花蛇舌草濃度。

將KU-19-19細(xì)胞分為對(duì)照組；白花蛇舌草組(100 μmol/L的培養(yǎng)液處理48 h)；miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)；miR-485-5p組(轉(zhuǎn)染miR-485-5p mimics)；anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)；anti-miR-485-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-485-5p)；白花蛇舌草+anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)；白花蛇舌草+anti-miR-485-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-485-5p)；白花蛇舌草+anti-miR-485-5p+LY294002組(轉(zhuǎn)染anti-miR-485-5p后，用白花蛇舌草濃度為100 μmol/L的培養(yǎng)液處理48 h，再用10 μmol/L的LY294002處理30 min)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力：按照5×103個(gè)/孔接種96孔板，培養(yǎng)24 h后加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=[(A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔)/(A對(duì)照孔-A空白孔)]×100%

1.2.3 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲：無血清培養(yǎng)基重懸各組細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，取5×103個(gè)細(xì)胞接種Transwell上腔室，下層24孔板中加入含10%血清培養(yǎng)基。37 ℃孵育24 h后，擦去上腔室未轉(zhuǎn)移細(xì)胞。多聚甲醛固定下腔室膜10 min，結(jié)晶紫染液染色30 min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，拍照，記錄遷移細(xì)胞數(shù)量。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)用100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的終濃度為1 g/L的基質(zhì)膠包被上腔室膜，37 ℃培養(yǎng)箱凝固后備用，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)miR-485-5p表達(dá)：Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，RT-qPCR法檢測(cè)miR-485-5p表達(dá)水平。miR-485-5p的上游引物序列為5′-AGAGGCTGGCCGTGATG-3′，下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參U6的上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAA AT-3′，下游引物序列為5′-CGCTTCACGAATTTGC GTGTCAT-3′。2-ΔΔCt法分析miR-485-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 蛋白質(zhì)印記(Western blot)檢測(cè)MMP2、MMP9、p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)：RIPA裂解法獲得細(xì)胞蛋白。取等量的蛋白樣品上樣，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%牛血清白蛋白37 ℃封閉1 h，37 ℃孵育一抗(MMP2為1∶500，MMP9、p-PI3K和p-AKT為1∶1 000)2 h，37 ℃孵育二抗(1∶2 000)1 h。用化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參，掃描吸光度值分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度白花蛇舌草對(duì)KU-19-19細(xì)胞增殖的影響

與NC組比較，白花蛇舌草(25、50和100 μmol/L)干預(yù)組細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05)。選取100 μmol/L白花蛇舌草進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(表1)。

表1 不同濃度白花蛇舌草對(duì)KU-19-19細(xì)胞增殖的影響

2.2 白花蛇舌草對(duì)KU-19-19細(xì)胞遷移和侵襲的影響

與NC組比較，白花蛇舌草(100 μmol/L)組KU-19-19細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(表2，圖1)。

圖1 Western blot檢測(cè)MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)Fig 1 Western blot detected the expression of MMP2 and MMP9 protein

表2 白花蛇舌草對(duì)KU-19-19細(xì)胞遷移和侵襲的影響Table 2 Effect of Hedyotis diffusa on the migration and invasion of KU-19-19 cells n=9)

2.3 白花蛇舌草對(duì)miR-485-5p表達(dá)的影響

白花蛇舌草組KU-19-19細(xì)胞miR-485-5p表達(dá)量為3.57±0.31，顯著高于NC組的1.00±0.11(P<0.05)。

2.4 miR-485-5p對(duì)KU-19-19細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與miR-NC組比較，miR-485-5p組KU-19-19細(xì)胞增殖率、遷移侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著降低；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-485-5p組KU-19-19細(xì)胞增殖率、遷移侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(表3，圖2)。

表3 miR-485-5p對(duì)KU-19-19細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響Table 3 Effects of miR-485-5p on the proliferation, migration and invasion of KU-19-19 cells n=9)

圖2 Western blot檢測(cè)MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)Fig 2 Western blot detected the expression of MMP2 and MMP9 protein

2.5 抑制miR-485-5p可以逆轉(zhuǎn)白花蛇舌草對(duì)KU-19-19細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與白花蛇舌草+anti-miR-NC組比較，白花蛇舌草+anti-miR-485-5p組KU-19-19細(xì)胞miR-485-5p的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞增殖率、遷移侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(表4，圖3)。

表4 Anti-miR-485-5p可以逆轉(zhuǎn)白花蛇舌草對(duì)KU-19-19細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖3 Western blot檢測(cè)MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)Fig 3 Western blot detected the expression of MMP2 and MMP9 protein

2.6 LY294002可以減弱anti-miR-485-5p逆轉(zhuǎn)白花蛇舌草對(duì)KU-19-19細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與白花蛇舌草+anti-miR-485-5p組比較，白花蛇舌草+anti-miR-485-5p+LY294002組KU-19-19細(xì)胞增殖率、遷移侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著降低，p-PI3K、p-AKT表達(dá)顯著降低(P<0.05)(表5，圖4)。

表5 LY294002可以減弱anti-miR-485-5p逆轉(zhuǎn)白花蛇舌草對(duì)KU-19-19細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 Western blot檢測(cè)MMP2、MMP9、p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)Fig 4 Western blot detected the expression of MMP2, MMP9, p-PI3K, and p-AKT protein

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草可抑制KU-19-19細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，降低MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平，并提高miR-485-5p的表達(dá)水平。提示，白花蛇舌草對(duì)KU-19-19細(xì)胞的抗腫瘤作用與上調(diào)miR-485-5p表達(dá)有關(guān)。

miR-485-5p已被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。黑色素瘤細(xì)胞中miR-485-5p表達(dá)降低，過表達(dá)miR-485-5p可降低腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[7]。過表達(dá)miR-485-5p還可抑制乳腺癌進(jìn)展并提高其化療敏感性[8]。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-485-5p mimics、anti-miR-485-5p分別上調(diào)或下調(diào)miR-485-5p表達(dá)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-485-5p可抑制KU-19-19細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，與白花蛇舌草對(duì)KU-19-19細(xì)胞的抗腫瘤作用一致，而抑制miR-485-5p表達(dá)則具有相反的作用。進(jìn)一步研究顯示，抑制miR-485-5p表達(dá)還可逆轉(zhuǎn)白花蛇舌草對(duì)KU-19-19細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。以上結(jié)果表明，白花蛇舌草可能通過上調(diào)miR-485-5p表達(dá)在膀胱癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。

PI3K/AKT通過調(diào)控下游信號(hào)分子活化狀態(tài)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、拮抗細(xì)胞凋亡的重要作用，與多種惡性腫瘤進(jìn)展有關(guān)。膀胱癌中PI3K/AKT信號(hào)通路異常激活，miRNA、中藥提取物等通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活化可減弱膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，抑制腫瘤進(jìn)展[9-10]。白花蛇舌草通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路還可抑制肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的形成[11]。最近研究顯示，miR-485-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用與阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002可逆轉(zhuǎn)抑制miR-485-5p表達(dá)對(duì)白花蛇舌草干預(yù)的KU-19-19細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。提示，白花蛇舌草可能通過上調(diào)miR-485-5p抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而在膀胱癌中具有增殖和遷移侵襲抑制作用。

綜上所述，白花蛇舌草通過上調(diào)miR-485-5p能夠抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，這為臨床上白花蛇舌草用于治療膀胱癌奠定了理論基礎(chǔ)。