任晶晶，李 晨，彭其勝

(吉林大學(xué) 人獸共患病研究所/教育部人獸共患病研究重點實驗室， 吉林 長春 130062)

布魯菌病(簡稱布病)是由布魯菌侵入機體后引起的傳染-變態(tài)反應(yīng)性人獸共患細菌病，被列為我國法定傳染病中的乙類傳染病之首。布魯菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，其毒力在于細胞內(nèi)生存和增殖[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、加工運輸和分泌的主要場所，對于維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅在機體抵抗胞內(nèi)感染中發(fā)揮重要作用，并且還是多種胞內(nèi)寄生菌逃避宿主免疫殺傷的理想靶位點[2]。布魯菌的入侵和增殖同樣與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有著緊密的聯(lián)系[3]。研究發(fā)現(xiàn)布魯菌在宿主細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)生存與繁殖，能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)重組，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[1]。近年來學(xué)者們發(fā)現(xiàn)布魯菌感染會誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的未折疊蛋白反應(yīng)[4-6]。

布魯菌分泌的效應(yīng)蛋白可以分為Ⅳ型分泌系統(tǒng)依賴性的和Ⅳ型分泌系統(tǒng)非依賴性的2種。目前國內(nèi)外研究表明，Ⅳ型分泌系統(tǒng)依賴性效應(yīng)蛋白在調(diào)節(jié)布菌感染誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[4-5]。但是，隨著對布魯菌感染機制的深入研究，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了4種比較特殊的效應(yīng)蛋白BPE159、BspG、Bsp和BspK，這些分泌到宿主細胞內(nèi)的效應(yīng)蛋白不依賴于Ⅳ型分泌系統(tǒng)的存在[5,7]，即使布菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)被缺失，它們依然能分泌到宿主細胞的包漿內(nèi)。然而，關(guān)于Ⅳ型分泌系統(tǒng)非依賴效應(yīng)蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的功能目前未知。

通過分析這4種Ⅳ型分泌系統(tǒng)非依賴性蛋白，發(fā)現(xiàn)BspI蛋白由布魯菌的一號染色體基因BAB1-1865編碼，含有3個獨特的結(jié)構(gòu)域：信號肽域(1～17 aa)、轉(zhuǎn)膜域(17～33 aa)及GTPase活化域(98～220 aa)[5]。其中GTPase活化域理論上能夠調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小G蛋白的活性，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的組裝，暗示著可能參與布魯菌感染引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[8]。因此，本研究選?、粜头置谙到y(tǒng)非依賴效應(yīng)蛋白BspI作為研究對象，探究其在未折疊蛋白反應(yīng)中的相關(guān)調(diào)節(jié)功能。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與試劑PGEX-4T-1載體購自吉林安舍科技公司；T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA Marker、衣霉素為北京索萊寶公司產(chǎn)品；膠回收純化試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒為天根公司產(chǎn)品；Anti-rabbit IgG antibody-HRP購自Bioworld公司；Anti-Bip IgG購自Affinity公司；Anti-XBP1 IgG和Anti-his IgG購自Santa公司；細胞因子ELISA檢測試劑盒購自博士德生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自莫納公司；細胞RNA提取試劑盒購自天根公司；CCK-8試劑盒購自MCE公司；Glutathione Beads購自天地人和生物有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成以滅活(80℃，2 h)的S19菌液為模板，根據(jù)布魯菌S19標準株的BspI基因(NC_007618.1)設(shè)計上游和下游引物進行擴增。設(shè)計BspI基因引物序列見表1，由吉林庫美生物公司合成。擴增程序按照Premix TaqTM說明書設(shè)置(TaKaRa公司Cat.#:RR901)。

表1 引物序列及擴增片段大小

1.3 GST-BspI融合蛋白的表達、純化及Pull-down試驗首先運用基因克隆方法構(gòu)建PGEX4T-1-BspI原核表達載體,然后按照文獻[9]進行GST-BspI融合蛋白的表達純化及Pull-down試驗。將SDS-PAGE切膠，送到上海毆易生物公司進行質(zhì)譜分析。

1.4 BspI蛋白的原核表達、純化及鑒定將目的基因插入pET-28a(+)載體中，構(gòu)建pET-28a-BspI原核表達載體，經(jīng)PCR及測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(ED3)感受態(tài)細胞，以1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白BspI表達。利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化BspI蛋白。以Anti-his tag IgG為一抗，HPR標記的羊抗鼠IgG為二抗，對純化后的重組蛋白進行Western blot鑒定。

1.5 CCK-8細胞毒性試驗將RAW264.7細胞鋪于96孔板中，分別設(shè)置試驗組、對照組以及空白組。試驗組分別加入不同質(zhì)量濃度的BspⅠ蛋白(10，20，40，80 mg/L)，每組設(shè)置3個平行孔，置于5% CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用酶標儀測定各孔D450 nm值，計算各組細胞存活率。

1.6 BspI蛋白對RAW264.7細胞Bip及IL-6和TNF-α表達影響將RAW264.7細胞鋪于6孔板中，分別將質(zhì)量濃度為40，60 mg/L的BspI蛋白加入到6孔板中以刺激細胞。設(shè)置陽性對照即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑衣霉素作用組及陰性對照組。24 h后利用Western blot檢測Bip蛋白表達。用雙抗夾心ELISA試劑盒檢測IL-6和TNF-α的表達。

1.7 BspI蛋白對RAW264.7細胞未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)分子mRNA水平的影響為檢測未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)分子IRE1、PERK、ATF6、GAPDH、XBP1和ATF4在mRNA水平的表達量，根據(jù)所需要檢測基因在基因庫中mRNA的序列，設(shè)計IRE1 (XM_005694366.1)、PERK(XM_005686691.1)、ATF6(AY942654)、GAPDH(XM_005680968.1)、XBP1(XR_3106431)和ATF4(NM_001142518.1)基因的定量引物，引物序列見表2。利用細胞RNA提取試劑盒提取經(jīng)BspI刺激24 h后的RAW264.7細胞RNA，再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行qPCR檢測。反應(yīng)程序：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共34個循環(huán)。

表2 引物序列及擴增片段大小

1.8 BspI蛋白對RAW264.7細胞未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)蛋白表達的影響取BspI刺激24 h后的RAW264.7細胞及陰性對照利用Western blot檢測XBP-1表達情況，同時利用免疫熒光檢測XBP-1的表達。免疫熒光樣品制備步驟：用4%多聚甲醛4℃固定30 min，PBS洗滌后用0.1%曲拉通-100作用10 min。PBS洗2次后用5%BSA室溫固定1 h，以Anti-XBP-1為一抗，1∶100稀釋后4℃過夜。PBS洗2次，二抗1∶500稀釋后室溫避光孵育1 h，最后在熒光顯微鏡下進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 GST-BspI融合蛋白的表達純化及質(zhì)譜分析以布魯菌S19株滅活菌液為模板，擴增出BspI基因，結(jié)果顯示在675 bp處有單一DNA條帶，與預(yù)期大小相符(圖1A)。將構(gòu)建的PGEX-4T-1-BspI轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達后純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，成功純化出GST-BspI融合蛋白(圖1B)。與RAW264.7細胞Pull-down后可見差異蛋白，進行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)BspI可與Bip蛋白結(jié)合(圖1C)。

2.2 BspI蛋白的原核表達、純化及鑒定將構(gòu)建成功的pET28a-BspI載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，用IPTG誘導(dǎo)BspI蛋白表達。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，重組BspI蛋白在37℃條件下表達量較16℃條件下表達量多，且大部分形成包涵體，少部分為可溶蛋白(圖2A)。利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對可溶蛋白進行純化，SDS-PAGE分析后結(jié)果顯示，400 mmol/L咪唑洗脫效果最優(yōu)(圖2B)。Western blot分析證明，重組BspI蛋白可以被His-tag抗體特異性識別(圖2C)。

A.BspI蛋白可溶性分析(M1.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準，1.pET28a(+)空載體誘導(dǎo)產(chǎn)物，2.37℃誘導(dǎo)pET28a(+)-BspI全菌，3.37℃誘導(dǎo)pET28apET28a(+)-BspI超聲上清，4.37℃誘導(dǎo)pET28apET28a(+)-BspI超聲沉淀，5.16℃誘導(dǎo)pET28apET28a(+)-BspI全菌，6.16℃誘導(dǎo)pET28apET28a(+)-BspI超聲上清，7.16℃誘導(dǎo)pET28apET28a(+)-BspI超聲沉淀)；B.不同咪唑濃度洗脫液SDS-PAGE分析(M2.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準，8.20 mmol/L咪唑洗脫液，9.50 mmol/L咪唑洗脫液，10.200 mmol/L咪唑洗脫液，11.400 mmol/L咪唑洗脫液，12.500 mmol/L咪唑洗脫液)；C.BspI重組蛋白Western blot鑒定(13.誘導(dǎo)空載體菌液,14.37℃誘導(dǎo)菌液)

2.3 BspI對RAW264.7細胞存活率的影響CCK-8試驗結(jié)果(圖3)顯示，BspI質(zhì)量濃度為80 mg/L時，細胞存活率顯著性下降(P<0.001)，而質(zhì)量濃度為40 mg/L時，細胞存活率與對照組相比并沒有明顯變化。因此后續(xù)采用質(zhì)量濃度為40，60 mg/L 的BspI刺激細胞，檢測未折疊蛋白反應(yīng)發(fā)生，明確BspI刺激質(zhì)量濃度。

1.對照組；2.10 mg/L BspI蛋白；3.20 mg/L BspI蛋白；4.40 mg/L BspI蛋白；5.80 mg/L BspI蛋白；6.160 mg/L BspI蛋白

A.BspI基因PCR擴增(M1.DL2000 DNA Marker,1.BspI基因的PCR產(chǎn)物)；B.GST-BspI融合蛋白的純化(M2.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準，2.純化后的GST-BspI融合蛋白，3.純化后的GST蛋白)；C.質(zhì)譜差異蛋白分析(4.GST-BspI融合蛋白Pull-down結(jié)果，5.GST蛋白Pull-down結(jié)果)

圖1 GST-BspI表達載體鑒定、融合蛋白的表達純化和質(zhì)譜差異蛋白分析

2.4 BspI蛋白對RAW264.7細胞未折疊蛋白反應(yīng)標志性分子Bip及相關(guān)細胞因子表達影響收集衣霉素處理的陽性對照組、PBS處理的陰性對照組及BspI蛋白刺激組的細胞，裂解后進行Western blot檢測。結(jié)果如圖4A所示，質(zhì)量濃度為60 mg/L的BspI蛋白刺激RAW264.7細胞24 h后，Bip蛋白表達量顯著升高，引起的未折疊蛋白反應(yīng)更為顯著。由于TNF-α和IL-6與未折疊蛋白反應(yīng)有關(guān)，因此對TNF-α和IL-6進行ELISA檢測，結(jié)果顯示(圖4B，C)，RAW264.7細胞TNF-α和IL-6的表達顯著提高(P<0.001,P<0.05)。

A.不同質(zhì)量濃度BspI重組蛋白刺激RAW264.7細胞Bip表達量鑒定(1.衣霉素陽性對照組，2.60 mg/L BspI作用組，3.40 mg/L BspI作用組，4.PBS陰性對照組)；B.BspI對RAW264.7細胞TNF-α表達的影響；C.BspI對RAW264.7細胞IL-6表達的影響

2.5 BspI蛋白對RAW264.7細胞未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平影響上述結(jié)果表明BspI可以引起RAW264.7細胞的未折疊蛋白反應(yīng)。為明確相關(guān)通路，利用實時熒光定量PCR檢測BspI對參與未折疊蛋白反應(yīng)的3條信號通路相關(guān)分子mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果表明，BspI蛋白刺激RAW264.7細胞24 h后，IRE1與XBP-1的mRNA表達量較對照組有顯著升高(圖5C，E；P<0.01，P<0.05)，而PERK、ATF6與ATF4的mRNA表達量較對照組無明顯變化(圖5A，B，D)。

A.ATF6;B.PERK;C.IRE1;D.ATF4;E.XBP-1

2.6 BspI蛋白對RAW264.7細胞XBP-1蛋白表達的影響分別利用Western blot與免疫熒光檢測試驗組與對照組的XBP-1蛋白表達情況，結(jié)果顯示(圖6)，試驗組的XBP-1蛋白表達水平顯著升高，與對照組相比有極顯著性差異(P<0.001)。

A.XBP-1S在不同處理組的表達(1.TM陽性對照組，2.PBS陰性對照組，3.BspI處理組)；B.免疫熒光檢測XBP-1在RAW264.7細胞表達

3 討論

布魯菌感染宿主細胞后，通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)中，形成早期布魯菌菌泡，歷經(jīng)中期布魯菌菌泡，最后與細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生融合，形成復(fù)制型布魯菌菌泡。從此，布魯菌在細胞內(nèi)開始增殖，顯示其毒力[10-12]。目前已知布魯菌在與細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)互作時，能誘導(dǎo)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過未折疊蛋白反應(yīng)等實現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能穩(wěn)定，促進布魯菌的胞內(nèi)生存[13]。用TUDCA(一種未折疊蛋白反應(yīng)的抑制劑)處理宿主細胞能顯著抑制布魯菌在細胞內(nèi)的增殖[6,14]。可見未折疊蛋白反應(yīng)在布魯菌的胞內(nèi)生長中發(fā)揮重要作用。PERK、IRE1和ATF6是未折疊蛋白反應(yīng)的3條信號通路的重要分子。當(dāng)未折疊蛋白反應(yīng)未發(fā)生時， Bip能結(jié)合這3個分子的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)端，使它們處于非活化狀態(tài)。當(dāng)未折疊蛋白反應(yīng)發(fā)生時，Bip表達增加，Bip與未折疊蛋白結(jié)合，解除對這3個分子的抑制作用，激活UPR反應(yīng)的3條信號通路，恢復(fù)細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。由此也可見，Bip是未折疊蛋白反應(yīng)的關(guān)鍵性調(diào)控分子[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)布魯菌BspI蛋白能夠與Bip結(jié)合，因此推測布魯菌BspI蛋白能夠引起宿主細胞的未折疊蛋白反應(yīng)。為此，首先表達并純化BspI蛋白，確定BspI刺激所需質(zhì)量濃度后通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)未折疊蛋白反應(yīng)標志分子Bip蛋白表達量顯著增加。同時，通過實時熒光定量PCR、Western blot和免疫熒光試驗發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在受到BspI蛋白刺激后，巨噬細胞中的XBP-1S表達量增加。XBP-1由無活性的XBP-1U轉(zhuǎn)化為有活性的XBP-1S是未折疊蛋白反應(yīng)發(fā)生的重要標志之一。表明BspI激活了巨噬細胞未折疊蛋白反應(yīng)，從而證明布魯菌BspI蛋白在巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控中發(fā)揮重要作用

布魯菌感染導(dǎo)致的巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能誘導(dǎo)炎癥因子，如TNF-α和IL-6的產(chǎn)生[15]。在本研究中利用ELISA試劑盒檢測巨噬細胞受到BspI刺激后，細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α與IL-6分泌量情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BspI蛋白刺激可以顯著引起炎性因子TNF-α與IL-6的分泌，這從另一個角度證明BspI能誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。

綜上所述，本研究證明布魯菌BspI蛋白可以引起巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，且主要是通過未折疊蛋白反應(yīng)中的IRE1通路。同時還提出了Ⅳ型分泌系統(tǒng)非依賴性效應(yīng)蛋白在布魯菌感染導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)Ⅳ型分泌系統(tǒng)非依賴性效應(yīng)蛋白也可以參與布魯菌感染導(dǎo)致的宿主細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控，豐富了布魯菌感染的機制研究，為未來進一步研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)提供新思路。