李柏鈞 溫昭科

【關(guān)鍵詞】 液體活檢;肺結(jié)節(jié);游離循環(huán)腫瘤細(xì)胞;循環(huán)RNA;循環(huán)腫瘤DNA;腫瘤血小板;外泌體

中圖分類(lèi)號(hào)：R734.2?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.04.013

在全世界范圍內(nèi)，肺癌是發(fā)病率和死亡率居于第一位的惡性腫瘤，且約四分之三的病人在診斷時(shí)已處在疾病的晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，5年存活率低[1]。隨著低劑量螺旋計(jì)算機(jī)斷層掃描在國(guó)內(nèi)外的廣泛應(yīng)用，大量肺結(jié)節(jié)的患者被發(fā)現(xiàn)，但是肺結(jié)節(jié)并不等于肺癌，只有5%～10%的肺結(jié)節(jié)為惡性，而惡性結(jié)節(jié)如果不進(jìn)行早期干預(yù)，其惡性程度強(qiáng)、病情進(jìn)展迅速、預(yù)后差，如果能在早期對(duì)病灶進(jìn)行手術(shù)切除，將會(huì)明顯改善肺癌患者的預(yù)后[2]。臨床上依據(jù)肺結(jié)節(jié)一般特征如大小、形態(tài)、成分比例、密度，以及特殊征象如毛刺樣改變等以判別肺結(jié)節(jié)的良惡性程度。同時(shí)，對(duì)于診斷困難的患者進(jìn)行定期隨訪[3]。然而這些策略不僅增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且加劇了患者的焦慮心理。因此，早期準(zhǔn)確地定性診斷肺結(jié)節(jié)成為臨床面臨的主要挑戰(zhàn)。最常用的肺結(jié)節(jié)評(píng)估手段包括痰脫落細(xì)胞學(xué)、肺部CT、支氣管鏡檢查、肺組織活檢等[4]。痰脫落細(xì)胞學(xué)具有無(wú)創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但陽(yáng)性率非常低。肺部增強(qiáng)CT具有準(zhǔn)確、快捷、敏感性較高等優(yōu)點(diǎn)，但是具有輻射性、嚴(yán)格的設(shè)備要求等缺點(diǎn)。支氣管鏡檢查是侵入性獲得病理標(biāo)本的手段，結(jié)果的敏感性較低。手術(shù)具有可獲得病理標(biāo)本并消除病灶的優(yōu)點(diǎn)，但具有手術(shù)及麻醉的風(fēng)險(xiǎn)。液體活檢是通過(guò)檢驗(yàn)血液或其他體液（如尿液、唾液、胸腔積液、腦脊液等），協(xié)助臨床對(duì)腫瘤等疾病進(jìn)行診斷、判斷預(yù)后、選擇治療方案的一種檢測(cè)手段。具有無(wú)創(chuàng)、標(biāo)本易獲得且可重復(fù)獲取、能夠動(dòng)態(tài)反映腫瘤基因譜全景等優(yōu)點(diǎn)，有被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的診斷及治療方案選擇的潛力。液體活檢包括游離循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌體、循環(huán)RNA及腫瘤血小板（tumor educated platelets， TEPs）等多項(xiàng)技術(shù)?，F(xiàn)對(duì)液體活檢在肺結(jié)節(jié)定性診斷中的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景進(jìn)行討論，希望可以為肺結(jié)節(jié)的定性診斷提供更多選擇和更準(zhǔn)確的方法。

1 CTC

1.1 CTC的定義

通常把進(jìn)入人體外周血的腫瘤細(xì)胞稱(chēng)為CTC。CTC在腫瘤形成過(guò)程中因脫落而進(jìn)入血液循環(huán)中，故而對(duì)肺結(jié)節(jié)等肺癌的早期診斷具有重要作用。CTC的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)有以下幾點(diǎn)：①可通過(guò)觀察CTC細(xì)胞形態(tài)確定腫瘤的惡性表型，還可以進(jìn)行熒光原位雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)等進(jìn)一步檢測(cè);②可通過(guò)CTC的表型鑒定以檢測(cè)基因組變化，同時(shí)進(jìn)行體外培養(yǎng)CTC建立CTC細(xì)胞系以用于各種體外、體內(nèi)的功能實(shí)驗(yàn)及藥物篩選[5～6]。因此，CTC在肺癌的個(gè)體化治療方面具有巨大潛力。目前，CTC檢測(cè)可用的方法包括：上皮細(xì)胞因子陽(yáng)性富集法和白細(xì)胞去除法、免疫熒光法、密度梯度離心法、免疫磁珠技術(shù)等。

1.2 CTC在肺結(jié)節(jié)診療中的應(yīng)用

ILIE等[7]檢測(cè)到3%的慢性阻塞性肺疾病患者外周血中含有CTC，當(dāng)時(shí)肺部CT并未發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)，隨后監(jiān)測(cè)1 至4年才發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)，行手術(shù)切除后術(shù)后病理均顯示均為Ⅰa期肺癌。RIED等[8]發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀高危因素的人群中外周血CTC陽(yáng)性率為50%，其中20%的患者在后續(xù)的影像學(xué)篩查中發(fā)現(xiàn)了早期肺癌。這些研究表明，CTC檢測(cè)可以先于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的存在。因此，我們可以推測(cè)聯(lián)合CTC和影像學(xué)將提高對(duì)肺結(jié)節(jié)定性診斷的準(zhǔn)確率。YU等[9]檢測(cè)153例非小細(xì)胞肺癌患者與113例對(duì)照組患者外周血中CTC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌患者外周血中CTC明顯增多，其中對(duì)Ⅰ期肺癌的敏感性為67.2%。該研究說(shuō)明液體活檢在肺癌的診斷中是可行的生物標(biāo)志物，甚至對(duì)于在肺部表現(xiàn)為肺結(jié)節(jié)的Ⅰ期肺癌也具有較高的敏感性，有助于提高肺結(jié)節(jié)定性診斷的精準(zhǔn)度。李金波等[10]回顧性分析58例肺結(jié)節(jié)患者（良性組22例與惡性組36例），采用配體靶向聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)兩組患者的CTC，比較其與癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白21片段水平差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTC對(duì)肺結(jié)節(jié)的診斷敏感度、特異度分別為84%、86%，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)CTC在治療時(shí)的水平與預(yù)后具有相關(guān)性。丁運(yùn)等人[11]比較了CTC與癌胚抗原鑒別肺結(jié)節(jié)良惡性的差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTC比癌胚抗原具有更高的敏感度和特異度，且CTC的高低水平與臨床肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后TNM分期具有相關(guān)性。

此外，CTC攜帶了大量肺癌生物信息，在肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中扮演了重要角色，因此對(duì)于CTC的充分利用不僅可以提高早期診斷肺癌的可能性，而且可以通過(guò)對(duì)其攜帶生物信息進(jìn)一步為肺癌提供精準(zhǔn)的治療方案。雖然目前CTC的檢測(cè)及分析技術(shù)仍有一定局限性，但隨著科技的發(fā)展，CTC將在肺結(jié)節(jié)等肺癌的早期診斷中扮演舉足輕重的角色。

2 ctDNA

2.1 ctDNA的定義

ctDNA是腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死后釋放出來(lái)的遺傳物質(zhì)，與腫瘤組織DNA具有高度的一致性。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者體內(nèi)血漿游離DNA的平均含量約是健康人體的6倍，可作為早期診斷、治療效果評(píng)價(jià)與治療后臨床隨訪的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)[12]。目前，ctDNA檢測(cè)技術(shù)主要包括二代測(cè)序技術(shù)、數(shù)字PCR和等位基因特異性PCR。

2.2 ctDNA在肺結(jié)節(jié)診療中的應(yīng)用

2016 年美國(guó)食品藥品管理局先后批準(zhǔn)了針對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者ctDNA檢測(cè)試劑盒[13]和基于NGS檢測(cè)技術(shù)的ctDNA診斷試劑盒的使用[14]。表明了ctDNA檢測(cè)對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的診斷和治療具有重要的價(jià)值。CHEN等[15]前瞻性地收集了58例早期NSCLC患者（ⅠA期、ⅠB期和ⅡA期）的血液和腫瘤樣本，并采用靶向測(cè)序方法檢測(cè)匹配的腫瘤DNA （tDNA）和血漿ctDNA的體細(xì)胞驅(qū)動(dòng)突變基因，發(fā)現(xiàn)EGFR、KRAS、PIK3CA和TP53等肺癌常見(jiàn)突變基因在血漿ctDNA和tDNA突變頻繁。該研究證實(shí)了檢測(cè)人群中血漿ctDNA突變用于肺癌早期篩查、診斷的可行性，并有望在肺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別上發(fā)揮用武之地。LIANG等[16]通過(guò)比較肺惡性腫瘤和肺良性病變，從組織中了解DNA甲基化特征，最終建立了區(qū)分惡性結(jié)節(jié)和良性結(jié)節(jié)的診斷模型。該模型有望成為一種非侵入性但敏感的可以區(qū)分良惡性肺結(jié)節(jié)的診斷方法。PENG等[17]通過(guò)開(kāi)展一項(xiàng)多中心研究，對(duì)192例可手術(shù)的肺部占位性疾病患者切下的組織行組織gDNA與血漿ctDNA的深度基因測(cè)序，檢測(cè)ctDNA在診斷肺結(jié)節(jié)方面的價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用血漿ctDNA法檢測(cè)時(shí)，肺癌敏感性為69%，特異性為96%。而當(dāng)ctDNA突變與血清生物標(biāo)志物聯(lián)合時(shí)，該模型的敏感性和特異性分別提高到80%和99%，其中64%的癌癥患者處于Ⅰ期，肺結(jié)節(jié)平均直徑2.2 cm（0.5～4.0 cm），敏感性為63%。這些研究均證實(shí)了檢測(cè)血液中ctDNA有助于肺結(jié)節(jié)的定性診斷，提高惡性結(jié)節(jié)的檢出率，早期發(fā)現(xiàn)肺癌使患者獲得良好的預(yù)后。

綜上，ctDNA不僅可以促進(jìn)肺癌的精準(zhǔn)醫(yī)療，用于療效評(píng)價(jià)、耐藥性檢測(cè)和預(yù)后評(píng)估，還可以在肺結(jié)節(jié)的早期評(píng)估定性中發(fā)揮重要作用。

3 外泌體

3.1 外泌體的定義

外泌體是可在血漿、唾液、尿液等多種體液中檢測(cè)到的直徑為30～100 nm的細(xì)胞外囊泡，可以包含來(lái)自其原始細(xì)胞的由脂質(zhì)雙分子層保護(hù)的生物活性miRNA、mRNA或DNA，在細(xì)胞間通信中發(fā)揮作用[18～19]，此外，外泌體在各種溫度和酸堿度中極其穩(wěn)定，外泌體可能是診斷各類(lèi)癌癥的潛在生物指標(biāo)[20]。研究證實(shí)在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體發(fā)揮了重要作用，在促進(jìn)腫瘤血管生成，參與腫瘤耐藥性發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)等作用[21]。目前，常用的外泌體分離技術(shù)如過(guò)濾離心法、超速離心法、密度梯度離心法等。分離后進(jìn)一步通過(guò)各種蛋白質(zhì)和基因檢測(cè)手段檢測(cè)外泌體的生物信息。

3.2 外泌體在肺結(jié)節(jié)診療中的應(yīng)用

外泌體中含多種蛋白質(zhì)，如鼠類(lèi)肉瘤病毒癌基因蛋白、表皮生長(zhǎng)因子受體、緊密連接蛋白等，這些蛋白與肺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[22]。外泌體中含有幾十種有可能成為非小細(xì)胞肺癌的特異性生物蛋白及因子[23]，且在肺癌患者的外泌體中微小RNA也具有特異性[24]，因此外泌體是肺癌的重要標(biāo)志物， 對(duì)肺癌的早期診斷極其重要[25]。SANDFELD等[26]證實(shí)外泌體膜結(jié)合蛋白等外泌體相關(guān)蛋白在肺癌患者表達(dá)增加且與肺癌患者總體生存時(shí)間呈相關(guān)性。外泌體還可以作為肺癌治療藥物的藥物載體，提高其藥物的靶向性而增加治療效果[27]。JIN等[28]發(fā)現(xiàn)腺癌和鱗狀細(xì)胞癌患者的外泌體中具有特異性miRNA。

綜上所述，外泌體可能成為高敏感性、非侵入性的早期肺癌診斷生物標(biāo)志物，有應(yīng)用于肺結(jié)節(jié)定性診斷的價(jià)值，但目前已經(jīng)發(fā)表的相關(guān)研究仍較少。

4 微小核糖核酸（miRNA）

4.1 miRNA的定義

液體活檢中檢測(cè)miRNA是通過(guò)在體液（通常是外周血）中檢測(cè)miRNA協(xié)助腫瘤診療的一種檢測(cè)方法，miRNA是具有調(diào)控功能的非編碼RNA，大小長(zhǎng)為20～25個(gè)核苷酸。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過(guò)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后沉默以調(diào)節(jié)細(xì)胞活性等方面在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵信息傳導(dǎo)作用[29]。許多研究團(tuán)隊(duì)都在尋找腫瘤患者和健康人群中miRNA的差異以便為肺癌早期診斷尋找標(biāo)記，其中l(wèi)et-7家族、miRNA-21等在肺癌患者中表達(dá)具有特異性，可能成為對(duì)肺結(jié)節(jié)進(jìn)行定性及肺癌篩查或早期診斷的工具[30～31]。miRNA的常用檢測(cè)方法包括RT-PCR、微陣列法（microarray）、Northern blot。

4.2 miRNA在肺結(jié)節(jié)診斷中的應(yīng)用

通過(guò)比較肺癌和正常對(duì)照組患者血漿中的多種miRNA，SOZZI等[32]和MONTANI等[33]發(fā)現(xiàn)在肺癌患者中miRNA具有較高的特異性，說(shuō)明了miRNA測(cè)定在肺癌診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值?？紤]到單個(gè)miRNA對(duì)腫瘤發(fā)病影響稍小，BIANCHI等建立一個(gè)包含了34個(gè)miRNA檢測(cè)組成的模型[34]，應(yīng)用該模型可以從無(wú)癥狀高危肺癌人群中識(shí)別出早期肺癌患者，準(zhǔn)確性為80%;還可以區(qū)分在肺部CT中發(fā)現(xiàn)的高危人群中的肺小結(jié)節(jié)的性質(zhì)，在肺結(jié)節(jié)和肺癌高危人群的篩查中具有巨大潛力。為了闡明肺癌與肺部良性疾病之間miRNA的表達(dá)是否存在差異，F(xiàn)AN等[35]對(duì)非小細(xì)胞肺癌、良性肺結(jié)節(jié)和肺部炎癥疾病患者血清中的miRNAs進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個(gè)miRNA的比率在非小細(xì)胞肺癌組的表達(dá)高于良性肺結(jié)節(jié)組，敏感性為0.70，特異性為0.90。說(shuō)明miRNAs的比值可作為惡性肺結(jié)節(jié)的潛在非侵入性生物標(biāo)志物。

以上研究顯示了miRNA在作為肺部結(jié)節(jié)診療方面的巨大潛質(zhì)，但miRNA在定量檢測(cè)時(shí)存在內(nèi)參/外參基因的選擇上存在不一致以及各種來(lái)源的miRNA在獲取過(guò)程中質(zhì)量和數(shù)量的差異較大等等問(wèn)題。因此，目前miRNA在腫瘤的診療中仍處于臨床前期研究，需要大量更規(guī)范研究促使miRNA的臨床應(yīng)用成為可能。

5 腫瘤血小板（TEPs）

5.1 腫瘤血小板的定義

腫瘤血小板概念指的是機(jī)體在與腫瘤細(xì)胞對(duì)抗過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境釋放的生物分子可能使血小板中發(fā)生剪接事件從而形成了TEPs[36]。還有研究發(fā)現(xiàn)血小板可以攝取并保護(hù)腫瘤的外泌體，使之不被降解[37]。 由于TEPs中含有RNA等生物分子，通過(guò)應(yīng)用測(cè)序或者定量分析的手段，就可以獲得腫瘤患者體內(nèi)這些相應(yīng)生物分子的組成及其狀態(tài)，從而為腫瘤的診療提供參考。因此，TEPs可能作為肺結(jié)節(jié)定性診斷的生物標(biāo)志物[37]。

5.2 腫瘤血小板在肺結(jié)節(jié)診療中的應(yīng)用

2017 年，有研究通過(guò)對(duì)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行TEPs檢測(cè)，應(yīng)用粒子群優(yōu)化（particle swarm optimization，PSO）算法可以有效地從血小板RNA序列庫(kù)中選擇RNA生物標(biāo)記板，在早期和晚期非小細(xì)胞肺癌其準(zhǔn)確性大于80%[38]。PSO算法是一種為選擇一個(gè)穩(wěn)健的生物標(biāo)志物集合而用于識(shí)別最佳的生物標(biāo)志物的算法[39]，能夠從血小板RNA測(cè)序文庫(kù)中有效地選擇RNA生物標(biāo)志物組。應(yīng)用PSO算法可使基于TEPs檢測(cè)早期和晚期NSCLC的準(zhǔn)確度提高，有助有識(shí)別早期肺結(jié)節(jié)的性質(zhì)。ZU等[40]通過(guò)研究血液和富血小板血漿中的整合血小板特征期望建立肺癌的診斷模型并區(qū)分肺結(jié)節(jié)的良惡性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌患者在全血平均血小板體積、平均血小板體積、富血小板血漿、血小板計(jì)數(shù)和血小板回收率等多種血小板特征有顯著差異。XING等[41]通過(guò)比較小于2 cm的孤立性肺惡性結(jié)節(jié)與良性結(jié)節(jié)的血小板源性ITGA2B mRNA水平，肯定了TEPs在鑒別肺結(jié)節(jié)良惡性方面的能力，測(cè)量TEP ITGA2B mRNA有助于臨床醫(yī)生在影像學(xué)發(fā)現(xiàn)的肺結(jié)節(jié)人群中篩選出惡性結(jié)節(jié)患者，從而實(shí)施個(gè)體化的治療，提高早期肺癌患者的總體生存率。

6 小結(jié)

肺癌仍然是威脅人類(lèi)健康的高發(fā)病率、高致死率的癌癥，肺結(jié)節(jié)的發(fā)現(xiàn)為早期發(fā)現(xiàn)診斷肺癌提供了機(jī)會(huì)，液體活檢在肺結(jié)節(jié)診療中發(fā)揮著巨大作用，可用于肺結(jié)節(jié)的定性診斷，進(jìn)一步促進(jìn)了肺癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。目前，由于技術(shù)限制，雖然液體活檢仍存在許多局限性，但是相比于影像學(xué)，早期可以在血液中檢測(cè)到相應(yīng)的生物標(biāo)志物，為人類(lèi)早期發(fā)現(xiàn)腫瘤提供可能性。

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（收稿日期：2021-01-11 修回日期：2021-01-29）

（編輯：梁明佩）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（82060078）;廣西自然科學(xué)基金（2016GXNSFAA380196）

作者簡(jiǎn)介：李柏鈞，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，研究方向：胸外科。E-mail：2364313910@qq.com

[本文引用格式]李柏鈞，溫昭科.液體活檢在肺結(jié)節(jié)診療中的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景[J].右江醫(yī)學(xué)，2021，49（4）：299-303.