王 麗，耿生蓮

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016； 3.青海省高原林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

引言

園林綠化不僅可以改善城市人居環(huán)境、減輕環(huán)境污染，還具有調(diào)節(jié)氣候、豐富物種多樣性等多種功能，是提升城市生態(tài)環(huán)境質(zhì)量最為重要的途徑之一。不同氣候背景下的城鎮(zhèn)綠化需充分考慮當(dāng)?shù)丨h(huán)境和資源基礎(chǔ)，在遵循適地適樹原則的基礎(chǔ)上穩(wěn)步推進(jìn)綠化工程建設(shè)。青藏高原地區(qū)平均海拔在3500m以上，氣溫低，熱量資源不足[1]，樹種的抗寒性是高原城鎮(zhèn)綠化需要關(guān)注和考量的重要方面。

低溫對(duì)植物的危害，按低溫程度和受害情況，可分為凍害和冷害兩種。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，對(duì)低溫有其特殊的適應(yīng)方式，其中就包括低溫適應(yīng)引發(fā)的生理生化變化，以增強(qiáng)植物對(duì)冷脅迫的適應(yīng)能力[2]。低溫引發(fā)的生理指標(biāo)變化部分與膜的通透性改變有關(guān)。低溫脅迫可導(dǎo)致膜相的改變，以及由于膜損傷而引發(fā)的代謝紊亂。通過細(xì)胞電解質(zhì)外滲率的變化可反映出植物受傷害的程度，使用Logistic方程進(jìn)行擬合，用拐點(diǎn)溫度表示組織的半致死溫度(LT50)，可得到與真實(shí)情況較為接近的抗寒性比較結(jié)果。這種方法受浸泡時(shí)間的影響很小[3]，因此被廣泛用于植物的抗寒性鑒定[4-5]。近年來，圍繞保護(hù)酶系統(tǒng)與抗寒性的關(guān)系做了較多的研究，多數(shù)報(bào)道表明抗寒性強(qiáng)的植物酶活性較高[6]，低溫與酶活性顯著相關(guān)。植物處于低溫脅迫時(shí)，體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的含量會(huì)顯著增加，起到一定的抗寒和自我保護(hù)作用[7]。此外，多數(shù)植物在逆境條件下往往發(fā)生膜脂過氧化，其產(chǎn)物丙二醛(MDA)會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷生物膜。利用MDA含量作為膜脂過氧化指標(biāo)，可表征逆境條件下細(xì)胞膜脂過氧化程度強(qiáng)弱。郭太君等通過測(cè)定越冬期山楂等落葉果樹枝條的MDA含量證實(shí)：隨自然溫度的下降，MDA含量增加，抗寒性強(qiáng)的品種MDA含量低，抗寒性弱的品種MDA含量高，這一結(jié)果與試材電解質(zhì)外滲率的變化相一致[8]。

項(xiàng)目組在前期調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，三江源區(qū)城鎮(zhèn)園林樹木有30種，隸屬11科19屬，鄉(xiāng)土樹種9種，外來樹種21種，綠化樹種豐富度較低[9]。本研究以三江源區(qū)用于城鎮(zhèn)綠化的10種喬木為研究對(duì)象，選擇一年生枝條為研究材料，通過人工模擬低溫處理，測(cè)定分析其抗寒生理指標(biāo)的變化趨勢(shì)。采用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)了10種喬木樹種的抗寒性，以期為高海拔地區(qū)城鎮(zhèn)綠化樹種的選擇提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為2019年9月份采集于三江源地區(qū)，具體采集地點(diǎn)見表1。對(duì)所選植物抗寒性研究的實(shí)驗(yàn)于2019年9月-10月進(jìn)行。采集一年生枝條，石蠟封口，裝入自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室后在人工氣候條件下進(jìn)行低溫脅迫和生理指標(biāo)測(cè)定。低溫處理前，先將離體枝條用自來水沖洗1遍，再用去離子水沖洗3遍，吸干水分。每個(gè)樹種枝條分成4組，裝入自封袋后放置于低溫冰箱中進(jìn)行人工模擬低溫脅迫處理。處理設(shè)置5℃、-5℃、-15℃、-25℃四個(gè)溫度梯度，降溫速率為5℃/h。達(dá)到設(shè)定溫度后保持24h，將處理組全部放置于5℃冰箱中保存，隨后進(jìn)行相關(guān)抗寒生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2 電解質(zhì)滲透率的測(cè)定

采用電導(dǎo)率法測(cè)定電解質(zhì)的相對(duì)外滲率。將葉片取出后，避開葉脈和葉緣，剪成0.5cm×1cm左右的細(xì)條，準(zhǔn)確稱取0.1g，裝入15ml試管中，加入10ml去離子水，充分震蕩后于室溫下靜置4h。使用雷磁DDSJ-308F型電導(dǎo)率儀測(cè)定浸提液電導(dǎo)率，記錄為R1。將試管煮沸30min，流水冷卻至室溫后搖勻，再次測(cè)定電導(dǎo)率并記錄為R2。以相對(duì)電導(dǎo)率(REC)表示電解質(zhì)的相對(duì)外滲率，即細(xì)胞膜透性的大小。相對(duì)電導(dǎo)率的計(jì)算公式如下：相對(duì)電導(dǎo)率REC(%)=R1/R2×100

1.3 其他生理指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1丙二醛含量(MDA)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定

稱取0.5g葉片并剪成小段，液氮研磨后，加入4.5ml 0.1mmol/L(pH7.0)預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，充分混勻。將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管，4℃6000rpm離心10min。取上清液進(jìn)行后續(xù)測(cè)定，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。POD活性、SDO活性和MDA含量的測(cè)定和計(jì)算均使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行。

1.3.2 脯氨酸含量測(cè)定

稱取0.1g葉片并剪成小段，液氮研磨后，加入9倍體積的勻漿介質(zhì)(南京建成生物工程研究所研制試劑盒提供)。將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管，4℃6000rpm離心10min，取上清液使用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 抗寒性綜合評(píng)價(jià)

采用隸屬函數(shù)法對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，評(píng)價(jià)樹種抗寒性[10]。與抗寒性正相關(guān)的脯氨酸含量、SOD活性、CAT活性和POD活性，其隸屬函數(shù)法計(jì)算公式如下：

與抗寒性負(fù)相關(guān)的電解質(zhì)滲透率、MDA含量，其隸屬函數(shù)法計(jì)算公式如下：

式中：Xij為i樹種j指標(biāo)的測(cè)定值；Xjmin為各樹種中j指標(biāo)的最小值；Xjmax為各樹種中j指標(biāo)的最大值；Rij為i樹種j性狀的隸屬值(0

將每個(gè)樹種所有指標(biāo)的隸屬函數(shù)值累加，求其平均數(shù)，數(shù)值越大的抗寒性越強(qiáng)。

1.4.2 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析，使用Origin 8軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 低溫脅迫對(duì)細(xì)胞膜透性的影響

如圖1所示，5℃條件下，參試樹種葉片的相對(duì)電導(dǎo)率較低，保持在9.5%-21.4%之間。低溫脅迫促進(jìn)了電解質(zhì)外滲，尤其是在-25℃條件下，所有參試樹種葉片相對(duì)電導(dǎo)率均顯著高于對(duì)照。但不同樹種控制電解質(zhì)外滲的能力存在明顯差異，-25℃條件下青海云杉葉片的相對(duì)電導(dǎo)率為44.21%，顯著低于新疆楊、青楊、小葉楊、白榆、旱柳等闊葉樹種，暗示其抗寒能力較強(qiáng)。而經(jīng)過-25℃處理的新疆楊、青楊、小葉楊葉片的相對(duì)電導(dǎo)率均超過90%，表明上述樹種在低溫條件下調(diào)控電解質(zhì)外滲的能力較弱。參試樹種在低溫脅迫初期相對(duì)電導(dǎo)率增加緩慢，當(dāng)脅迫溫度降低到一定溫度時(shí)(-25℃或-15℃)，相對(duì)電導(dǎo)率急劇上升，隨后又趨于平緩，變化呈現(xiàn)“S”型曲線。5個(gè)針葉樹種，特別是青海云杉低溫條件下葉片的相對(duì)電導(dǎo)率較低。

圖1 低溫脅迫下不同樹種葉片相對(duì)電導(dǎo)率變化

2.2 低溫脅迫對(duì)葉片MDA含量的影響

如圖2所示，低溫脅迫顯著促進(jìn)了MDA在10個(gè)供試喬木樹種葉片中的積累，但不同樹種對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)存在差異。在新疆楊、青楊、小葉楊、青海云杉和落葉松5個(gè)樹種中，葉片MDA含量隨脅迫加劇而增加。說明在上述樹種中，葉片MDA含量在一定溫度范圍內(nèi)與脅迫程度正相關(guān)。在祁連圓柏、白榆、川西云杉和旱柳5個(gè)樹種中，-5℃或-15℃處理?xiàng)l件下，葉片MDA含量達(dá)到峰值，顯著高于其余處理。而在油松中，低溫脅迫處理對(duì)針葉MDA含量的影響不顯著?？傮w上看，油松、祁連圓柏、青海云杉、落葉松、川西云杉5個(gè)針葉樹種葉片在低溫脅迫條件下的MDA含量較低。

圖2 低溫脅迫下不同樹種葉片MDA含量變化

2.3 低溫脅迫對(duì)葉片SOD活性的影響

如圖3所示，在新疆楊、青楊、小葉楊、油松、祁連圓柏、白榆和旱柳7個(gè)樹種中，-5℃低溫脅迫條件下，葉片SOD活性降低。進(jìn)一步降低處理溫度至-15℃后，葉片SOD活性顯著提高，說明低溫處理可誘導(dǎo)SOD在上述樹種葉片中的活性，增強(qiáng)組織響應(yīng)冷脅迫的能力。在青海云杉、落葉松和川西云杉3個(gè)樹種中，-5℃低溫脅迫即可使葉片SOD活性提高，進(jìn)一步降低處理溫度至-15℃后，SOD活性也隨之顯著增強(qiáng)，達(dá)到峰值。上述結(jié)果說明：低溫脅迫可增強(qiáng)供試樹種葉片SOD活性，不同樹種葉片SOD對(duì)冷脅迫的響應(yīng)方式存在差異。

2.4 低溫脅迫對(duì)葉片POD活性的影響

如圖4所示，低溫脅迫顯著影響了POD在供試樹種葉片中的活性。-5℃脅迫使新疆楊、小葉楊、白榆、川西云杉葉片POD活性降低，進(jìn)一步增加脅迫溫度至-15℃或-25℃后，葉片POD活性顯著增強(qiáng)，達(dá)到峰值。說明低溫脅迫可顯著誘導(dǎo)POD活性，增強(qiáng)上述樹種對(duì)冷脅迫的適應(yīng)能力。在青楊、油松、祁連圓柏、青海云杉、落葉松5個(gè)樹種中，-5℃、-15℃和-25℃處理均可使POD活性增強(qiáng)，其活性在-15℃或-25℃脅迫條件下達(dá)到最高。旱柳葉片POD活性則未發(fā)生顯著變化。上述結(jié)果表明：低溫脅迫可使大部分供試樹種葉片的POD活性增強(qiáng)，但不同樹種的POD活性對(duì)冷脅迫的響應(yīng)存在差異。

圖4 低溫脅迫下不同樹種葉片POD活性變化

2.5 低溫脅迫對(duì)葉片脯氨酸含量的影響

如圖5所示，低溫脅迫顯著促進(jìn)了脯氨酸在新疆楊、青楊、小葉楊、油松、祁連圓柏、旱柳、青海云杉、落葉松、川西云杉9個(gè)樹種葉片中的積累。在大部分供試樹種中，葉片脯氨酸含量與脅迫程度存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。與上述9個(gè)樹種不同，白榆葉片脯氨酸含量在低溫脅迫條件下顯著降低(-15℃處理)，而-5℃及-25℃脅迫處理對(duì)其葉片脯氨酸含量的影響不顯著。上述結(jié)果表明：脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可能在植物響應(yīng)低溫脅迫過程中發(fā)揮了滲透調(diào)節(jié)作用，以增強(qiáng)植物響應(yīng)低溫脅迫的能力。

圖5 低溫脅迫下不同樹種葉片脯氨酸含量變化

2.6 抗寒性綜合評(píng)價(jià)

采用單一指標(biāo)對(duì)植物抗寒性進(jìn)行評(píng)價(jià)往往存在片面性，基于隸屬函數(shù)法對(duì)多種抗性相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，可相對(duì)準(zhǔn)確的反應(yīng)植物抗寒的整體表現(xiàn)。本研究使用隸屬函數(shù)法，對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性、POD活性和脯氨酸含量5個(gè)冷脅迫響應(yīng)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了綜合分析(表2)，結(jié)果顯示10個(gè)參試樹種的抗寒性強(qiáng)弱排序依次為：落葉松>青海云杉>祁連圓柏>川西云杉>油松>白榆>新疆楊>小葉楊>青楊>旱柳。

表2 不同喬木抗寒性的綜合評(píng)價(jià)

3 結(jié)論與討論

植物的抗寒性是與多性狀緊密關(guān)聯(lián)的綜合表現(xiàn)，因而其評(píng)價(jià)涉及形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理變化和基因表達(dá)多個(gè)層次[11]。在眾多的生理指標(biāo)中，相對(duì)電導(dǎo)率通過測(cè)定電解質(zhì)滲漏引發(fā)的電導(dǎo)率變化來衡量脅迫引發(fā)的細(xì)胞膜受損情況，是使用最為廣泛的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[12]。本研究中，低溫脅迫均顯著增加了10個(gè)參試樹種在-25℃脅迫條件下的相對(duì)電導(dǎo)率，部分參試闊葉樹種的相對(duì)電導(dǎo)率已超過90%，說明在強(qiáng)冷脅迫條件下，上述樹種的膜系統(tǒng)受損嚴(yán)重，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)容物大量釋放。相較而言，油松、祁連圓柏、青海云杉、落葉松、川西云杉5個(gè)針葉樹種的相對(duì)電導(dǎo)率保持在較低水平，暗示其細(xì)胞膜損傷較輕，抗寒性較強(qiáng)。并且本研究中參試樹種在低溫脅迫初期相對(duì)電導(dǎo)率增加緩慢，當(dāng)脅迫溫度降低到一定溫度時(shí)(-25℃或-15℃)，相對(duì)電導(dǎo)率急劇上升，隨后又趨于平緩，變化呈現(xiàn)“S”型曲線，這一結(jié)果也與崔帥的研究結(jié)果相一致[13]。

低溫脅迫引發(fā)的膜系統(tǒng)損傷可能與胞內(nèi)氧自由基的積累有關(guān)，自由基和活性氧可攻擊細(xì)胞膜和蛋白，造成膜系統(tǒng)損傷[14]。自由基與膜脂反應(yīng)的最終產(chǎn)物是丙二醛，因此丙二醛含量常被當(dāng)作反映細(xì)胞膜損傷的一項(xiàng)間接指標(biāo)用于抗寒性評(píng)價(jià)。本研究中，低溫脅迫條件下油松、祁連圓柏、青海云杉、落葉松、川西云杉5個(gè)針葉樹種的MDA的積累水平較低，說明低溫脅迫對(duì)上述樹種的細(xì)胞膜損傷相對(duì)較輕，回應(yīng)和驗(yàn)證了相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定的結(jié)果和初步結(jié)論。

胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)具有清除自由基的作用，可減輕由低溫引發(fā)的氧化損傷[15]。SOD和POD是最為重要的抗氧化酶類，因而常被選為抗寒性評(píng)價(jià)的參試指標(biāo)。在對(duì)柑橘[16]和豆梨[6]的抗寒性評(píng)價(jià)中，不同樹種的POD和SOD均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這一結(jié)果與近期發(fā)表的關(guān)于白楊[17]、冬青[18]、牧草[19]、杏[20]、蘋果[21]等植物抗寒性評(píng)價(jià)研究中的活性變化規(guī)律一致。本研究中，隨著脅迫程度的加劇，大部分參試樹種的SOD和POD活性均呈現(xiàn)典型的先上升后下降趨勢(shì)，兩種酶的活性在-15℃或-25℃條件下達(dá)到最高。上述結(jié)果表明，大部份參試樹種中SOD和POD活性對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)是保守的。

植物的抗寒性是多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，這決定了其評(píng)價(jià)必須采用與之相關(guān)的復(fù)合指標(biāo)體系進(jìn)行[11]。目前，采用形態(tài)、生理、分子指標(biāo)的抗寒性評(píng)價(jià)均已見諸報(bào)道[22]，其中以基于相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性糖含量、POD活性、SOD活性、脯氨酸含量等生理指標(biāo)的評(píng)價(jià)研究最多，應(yīng)用最為廣泛。通過隸屬函數(shù)法對(duì)抗寒關(guān)聯(lián)指標(biāo)進(jìn)行綜合，可得到抗寒性的量化結(jié)果。使用該方法對(duì)本研究中的10個(gè)參試樹種進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，抗寒性強(qiáng)弱的排序依次為：落葉松>青海云杉>祁連圓柏>川西云杉>油松>白榆>新疆楊>小葉楊>青楊>旱柳。上述結(jié)果可為高原耐寒適生樹種的選擇提供參考和依據(jù)。