張 帆，胡麗蓉，劉嘉莉，康 玲，羅漢鵬，楊明路，徐 青*，郭 剛，初 芹，黃錫霞，王雅春*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3.北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044；4.北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，北京 100029；5.北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京 100089）

熱應(yīng)激每年給奶牛業(yè)帶來巨大損失，已成為困擾全世界奶牛產(chǎn)業(yè)的難題之一。熱應(yīng)激環(huán)境下，多數(shù)動物會產(chǎn)生熱休克反應(yīng)，機(jī)體表達(dá)大量的熱休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）。熱休克蛋白種類繁多，按分子量分為小分子熱休克蛋白（sHSP）、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110 及泛素 7 個家族。在sHSP 家族中，HSPB8 蛋白亦稱為HSP22、H11 激酶，在氧化應(yīng)激[1-2]、線粒體自噬[3-5]、細(xì)胞凋亡[5-6]、炎癥反應(yīng)[7-9]中均有重要的功能。HSPB8 作為一種分子伴侶，能夠與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）結(jié)合，激活PI3K/Akt 通路，抑制細(xì)胞凋亡[10-11]；與BAG3（Bcl-2-associated Anti-Apoptotic Gene 3）、HSP70、SYNPO2（Synaptopodin 2）結(jié)合，加快變性或錯誤折疊的蛋白質(zhì)修復(fù)和降解[12-15]；與微管相關(guān)蛋白-2（Microtubule Associated Protein 2，MAP2）結(jié)合以維持細(xì)胞骨架完整[16-18]，保護(hù)熱應(yīng)激下的細(xì)胞。此外，熱應(yīng)激時機(jī)體為減少產(chǎn)熱會增加糖代謝，減少脂代謝，細(xì)胞的能量需求量也會增加。而HSPB8 蛋白通過阻止二硫蘇糖醇誘導(dǎo)的胰島素聚集和熱誘導(dǎo)的檸檬酸合酶聚集，使三羧酸循環(huán)正常進(jìn)行，保證細(xì)胞的能量平衡[19-20]。因此，HSPB8 蛋白在細(xì)胞抗熱應(yīng)激中發(fā)揮重要作用，在熱應(yīng)激條件下過表達(dá)HSPB8 蛋白可以在一定程度上增加細(xì)胞的耐熱性[21-22]。

在果蠅和水牛的研究中都發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可以引起HSPB8基因表達(dá)顯著上調(diào)[19,23-24]；2018 年，Sengar 等[25]研究發(fā)現(xiàn)牛熱應(yīng)激后表達(dá)顯著上調(diào)的1 個miRNA（btamiR-2898），在HSPB8基 因3'UTR 區(qū)域有2 個結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步在外周血單核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）中證實了熱應(yīng)激引起btamiR-2898 的過表達(dá)能夠調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。Verma等[26]在沙希華牛群中發(fā)現(xiàn)HSPB8基因第一外顯子區(qū)g.507 G＞A 突變不同基因型個體間的耐熱性存在顯著差異，并認(rèn)為該位點(diǎn)的AG 基因型可作為沙希華牛耐熱性選擇的遺傳標(biāo)記。

本文從細(xì)胞水平研究了HSPB8基因的表達(dá)及其與中國荷斯坦牛熱應(yīng)激反應(yīng)性狀之間的相關(guān)性，為研究熱應(yīng)激反應(yīng)與奶牛重要候選基因遺傳多樣性的關(guān)系、篩選奶牛耐熱性相關(guān)遺傳標(biāo)記、培育耐熱品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 熱應(yīng)激條件下HSPB8基因的表達(dá)變化

1.1.1 細(xì)胞熱應(yīng)激處理 奶牛外周血單核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）和牛腎細(xì)胞（Madin-Darbv Bovine Kidney，MDBK）為課題組保存的細(xì)胞模型[27]。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)[27]24 h 后，實驗組42℃水浴處理1 h，對照組37℃處理1 h，每組12 個重復(fù)。

1.1.2HSPB8基因mRNA 表達(dá)分析 利用NCBI 網(wǎng)站檢索目標(biāo)基因HSPB8和內(nèi)參基因GAPDH的mRNA 序列，設(shè)計引物：HSPB8-F：TAAAATGTTGGGGGTCGGGG；HSPB8-R：TGCAATGGAGCATGACCTGT；GAPDH-F：GGCGCCAAGAGGGTCAT；GAPDH-R：AGGCATTG CTGACAATCTTGAG，進(jìn)行細(xì)胞總RNA 的提取、反轉(zhuǎn)錄及定量PCR 檢測。

1.2HSPB8基因多態(tài)篩查

1.2.1 DNA 池的構(gòu)建 選取70 頭無親緣關(guān)系的中國荷斯坦牛公牛，凍精樣品由北京奶牛中心提供。采用高鹽法[28]提取基因組DNA，NanoDrop 2000 檢測濃度后調(diào)整為100 ng/μL。隨機(jī)將樣品分成3 組（20、20、30 頭），根據(jù)DNA 濃度等量混合構(gòu)建3 個DNA 池，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因多態(tài)篩查 參考已知序列（NC_037344.1）共設(shè)計3 對引物（表1），涵蓋HSPB8基因全部編碼區(qū)、部分內(nèi)含子區(qū)及上下游調(diào)控區(qū)各500 bp。

表1 HSPB8 基因多態(tài)篩查用引物信息

PCR 反應(yīng)體系25 μL：DNA 池（100 ng/μL）0.5 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/μL）各1 μL，ddH2O 10 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，根據(jù)測序峰圖與參考序列比對來判定多態(tài)性。

1.3HSPB8多態(tài)性與熱應(yīng)激反應(yīng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

1.3.1 熱應(yīng)激反應(yīng)性狀表型及估計育種值（EBVs）估計 熱應(yīng)激對奶牛造成的影響與體溫升高的幅度有關(guān)[29-30]，耐熱性較好的個體體溫調(diào)節(jié)能力強(qiáng)，熱應(yīng)激時體溫變化幅度小，應(yīng)激反應(yīng)小。奶牛有多種度量體溫的方法，其中直腸溫度具有穩(wěn)定性高且易檢測的優(yōu)點(diǎn)，往往被作為體溫指標(biāo)的重要首選。此外，當(dāng)奶牛出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)時，會表現(xiàn)出呼吸頻率加快、心率加快，同時出現(xiàn)張嘴呼吸伴隨流涎。因此，除直腸溫度外，呼吸評分和流涎指數(shù)也往往被作為衡量熱應(yīng)激反應(yīng)的生理指標(biāo)[31]。

2013—2017 年夏季（THI＞72），共測定北京地區(qū)12 541 頭中國荷斯坦母牛的直腸溫度、評分及流涎指數(shù)3項生理指標(biāo)，方法參考文獻(xiàn)[31]。課題組共整理70 819 條數(shù)據(jù)（含系譜），其中1 665 頭實驗牛（基因分型）每頭含有6 條表型數(shù)據(jù)，直接使用表型值與SNP 進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析并不嚴(yán)謹(jǐn)。EBVs 在計算過程中去除了系統(tǒng)環(huán)境效應(yīng)和永久環(huán)境效應(yīng)對表型值的影響，使用熱應(yīng)激性狀的EBVs 與基因多態(tài)性進(jìn)行相關(guān)性分析相對表型值來說，結(jié)果更準(zhǔn)確、更靈敏[32]。

采用多性狀動物模型借助DMU 軟件DMUAI 模塊[33-34]估計EBVs。系譜來自北京奶牛中心，包括1990—2017年共450 975 頭牛。模型為：

其中，Yilkpmn為直腸溫度、呼吸評分或流涎指數(shù)表型；FYMi為固定效應(yīng)，在直腸溫度評估中為場年組合效應(yīng)，在呼吸評分和流涎指數(shù)評估中為場年評分人的組合效應(yīng)；Ml為擠奶時間（前/后）效應(yīng)；Timek為測定時間（上午/下午）效應(yīng)；PARITYp為胎次（1、2、3、4、5、≥6）效應(yīng)；DIM為泌乳天數(shù)效應(yīng)；DIM2為泌乳天數(shù)二次項；TEM為環(huán)境溫度；Am為加性遺傳效應(yīng)；PEm為永久環(huán)境效應(yīng)。

1.3.2 母牛DNA 的提取及基因分型 從上述有表型數(shù)據(jù)的母牛中隨機(jī)選取1 665 頭，來自北京地區(qū)9 個牧場。頸靜脈采血，肝素鈉抗凝，使用DNA 試劑盒（天根，DP318）提取基因組DNA，濃度檢測后調(diào)整至50 ng/μL備用。對篩選到的HSPB8基因的2 個SNPs，重新設(shè)計引物（表2），采用競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive Allele Specif ic PCR，KASP）分型[35]，由中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司完成。

表2 SNP 位點(diǎn)KASP 分型用引物信息

1.3.3 統(tǒng)計分析 使用Haploview（version 4.2）軟件分別對HSPB8基因的SNPs 進(jìn)行連鎖不平衡分析，采用SAS 9.2 軟件對直腸溫度、呼吸評分和流涎指數(shù)的EBVs 與SNP 進(jìn)行單個位點(diǎn)和單倍型組合關(guān)聯(lián)分析，線性模型為Y=μ+G+e，其中Y表示各性狀EBVs，μ是總體均值，G為基因型效應(yīng)，e為隨機(jī)殘差效。采用Bonferroni 法進(jìn)行同一SNP 不同基因型的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激對HSPB8基因mRNA 表達(dá)量的影響 如圖1 所示，在PBMC 細(xì)胞中，與對照組相比，熱應(yīng)激組HSPB8基因的表達(dá)量上調(diào)了2.17 倍（P＜0.01）；而在MDBK 細(xì)胞中，HSPB8基因的表達(dá)量上調(diào)更加明顯，與對照組相比差異達(dá)到了6 倍（P＜0.01）。

圖1 熱應(yīng)激對HSPB8 基因表達(dá)的影響

2.2 中國荷斯坦牛HSPB8基因多態(tài)性分析 采用DNA池測序法對HSPB8基因進(jìn)行多態(tài)性篩選，共檢測到2個SNPs（表3），一個位于內(nèi)含子2 區(qū)域，另一個位于3'UTR 區(qū)（圖2）。

表3 中國荷斯坦牛HSPB8 基因多態(tài)位點(diǎn)

圖2 HSPB8 基因多態(tài)位點(diǎn)測序峰圖

2.3HSPB8基因SNPs 與熱應(yīng)激反應(yīng)性狀的相關(guān)性 基因分型結(jié)果如表4 所示，卡方檢驗表明，在中國荷斯坦牛群體 中g(shù).58406728G＞A 和g.58406042A＞G 這2 個位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（P＞0.05）。二者均屬于中度多態(tài)標(biāo)記，多態(tài)信息含量（PIC）為0.37。對g.58406728G＞A 位點(diǎn)而言，G 等位基因是優(yōu)勢等位基因，AG 基因型為優(yōu)勢基因型。而g.58406042A＞G 位點(diǎn)，A等位基因?qū)儆趦?yōu)勢等位基因，AG 基因型為優(yōu)勢基因型。

表4 基因頻率和基因型頻率的分布以及Hardy-Weinberg 平衡的卡方檢驗

分別用這2 個SNPs 位點(diǎn)與3 個熱應(yīng)激反應(yīng)性狀直腸溫度、呼吸評分和流涎指數(shù)的EBVs 進(jìn)行單標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表5 所示?？梢钥闯?，g.58406728G＞A位點(diǎn)與流涎指數(shù)EBVs 性狀顯著相關(guān)，其中，GG 型個體的EBVs 顯著高于AA 型和AG 型個體，分別高0.097和0.083；AA 型個體的EBVs 數(shù)值最低，但與AG 型差異不顯著。

表5 HSPB8 基因多態(tài)與直腸溫度EBVs、呼吸評分EBVs 和流涎指數(shù)EBVs 的關(guān)聯(lián)分析

g.58406042A＞G 位點(diǎn)分析結(jié)果顯示其與直腸溫度性狀呈顯著相關(guān)。AA 型個體的EBVs 極顯著低于GG 型；而雜合子AG 型EBVs 居中，與2 個純合子差異不顯著。

2.4HSPB8基因SNPs 連鎖不平衡分析 單倍型分析結(jié)果顯示，2 個SNPs 具有較緊密的連鎖關(guān)系，D'=0.957，r2=0.912，二者均為標(biāo)簽SNP（圖3）。H1、H2 為優(yōu)勢單倍型，二者頻率之和為0.978（表6）。當(dāng)二者均為有利突變時，其中單倍型組合為H3H3，但是H3H3的個體數(shù)量太少，僅有4 頭牛，不具有群體代表性，會導(dǎo)致所估計的總體均值具有較大誤差，因此未納入后續(xù)分析中。此外，為更準(zhǔn)確估計各單倍型組合的總體均值，本研究以個體百分比大于5%為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了3 種優(yōu)勢單倍型組合（即H1H1、H1H2、H2H2）與表型性狀EBVs 進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分析結(jié)果如表7 所示。

表6 單倍型頻率

表7 單倍型組合相關(guān)性分析

圖3 HSPB8 基因2 個SNPs 連鎖不平衡估計

3 討 論

3.1 熱應(yīng)激誘導(dǎo)HSPB8基因的表達(dá) 本研究中，牛MDBK細(xì)胞和PBMC 細(xì)胞經(jīng)熱刺激處理后，HSPB8基因表達(dá)量都極顯著上調(diào)。Boardman[23]和Kirbach[36]分別對果蠅和大鼠的組織進(jìn)行熱處理，均發(fā)現(xiàn)HSPB8基因表達(dá)顯著上調(diào)，這也與本研究結(jié)果一致。根據(jù)目前的研究顯示，HSPB8基因受熱應(yīng)激誘導(dǎo)顯著上調(diào)可能與熱休克因子1（Heat Shock Factor 1，HSF1）過磷酸化激活有關(guān)。Vydra 等[37]使用雌激素磷酸化HSF1 發(fā)現(xiàn)，HSF1與HSPB8基因啟動子區(qū)域的熱休克原件（Heat Shock Elements，HSEs）結(jié)合能力增加，并導(dǎo)致HSPB8基因過表達(dá)。Anckar 等[38]也發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激誘導(dǎo)HSF 過度磷酸化，增強(qiáng)與HSPB8基因啟動子區(qū)域HSEs 的結(jié)合。但HSF1 的激活過程十分復(fù)雜，有人認(rèn)為熱休克蛋白水平和細(xì)胞蛋白損傷程度的平衡可以作為應(yīng)激的敏感因子激活HSF1[39]。2006 年，Shamovsky 等[40]研究發(fā)現(xiàn)HSF1 可以由一種核糖核蛋白復(fù)合物激活，這種復(fù)合物中包含一類RNA 分子，這類RNA 在細(xì)胞中可能作為溫度感受器發(fā)揮作用，當(dāng)溫度變化時，其構(gòu)像發(fā)生變化，并最終導(dǎo)致HSF1 的激活[41]。

3.2 中國荷斯坦牛HSPB8基因多態(tài)與熱應(yīng)激反應(yīng) 本研究在中國荷斯坦牛群中發(fā)現(xiàn)HSPB8基因的2 個SNPs，一個位于內(nèi)含子2，一個位于3'UTR 區(qū)。Nishant 等[26]在沙希瓦華牛群體中發(fā)現(xiàn)2 個SNPs，分別是g.507G＞A和g.881T＞C，與本研究檢測到的突變位點(diǎn)沒有重疊，這可能與品種的特異性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)HSPB8基因的多態(tài)位點(diǎn)與奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)性狀間存在顯著的相關(guān)性。其中，位于內(nèi)含子2 上的位點(diǎn)g.58406728G＞A 與流涎指數(shù)EBVs 顯著相關(guān)。本研究對流涎指數(shù)的評分標(biāo)準(zhǔn)包括流涎與否和口鼻干濕情況，理論上流涎指數(shù)越低代表牛越耐熱，AA 型和AG 型的EBVs 顯著低于GG 型，意味著AA 型和AG 型個體的耐熱性可能高于GG 型個體，這也意味著A 等位基因有作為耐熱育種標(biāo)簽的潛力。

此外，位于3'UTR 區(qū)的位點(diǎn)g.58406042A＞G 則與直腸溫度EBVs 顯著相關(guān)，AA 型EBVs 值極顯著低于GG 型。直腸溫度是個體對于環(huán)境溫度變化生理調(diào)節(jié)反應(yīng)的直接表現(xiàn)，熱應(yīng)激耐受型奶牛的直腸溫度顯著低于敏感個體[9]，因此判斷AA 型個體較GG 型個體更耐熱，在育種中可以作為熱應(yīng)激耐受型個體的重要參考遺傳標(biāo)記。目前有研究表明位于3'UTR 上的SNP 可以通過改變miRNA 與其結(jié)合能力來影響基因的表達(dá)[42]。Sengar等[25]也發(fā)現(xiàn)奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)下表達(dá)上調(diào)的miRNA（bta-miR-2898）能夠靶向結(jié)合HSPB8基因3'UTR 區(qū)進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。

本研究中檢測的2 個SNPs 位點(diǎn)分別與奶牛流涎指數(shù)EBVs、直腸溫度EBVs 顯著相關(guān)，這可能與直腸溫度和流涎的發(fā)生和發(fā)展具有異相性有關(guān)。當(dāng)熱應(yīng)激不嚴(yán)重時，奶牛主要通過皮膚出汗進(jìn)行散熱，此時牛群的流涎指數(shù)可能會趨向同質(zhì)，即很少出現(xiàn)流涎的現(xiàn)象。而當(dāng)奶牛處于嚴(yán)重的熱應(yīng)激時，皮膚出汗已無法滿足散熱需求，這時機(jī)體會采用加快呼吸頻率的方式散熱，但當(dāng)呼吸頻率升高到一定程度時，會轉(zhuǎn)為喘息，且出現(xiàn)流涎的現(xiàn)象。因此，直腸溫度和流涎指數(shù)是從不同角度去評估熱應(yīng)激，具有不同的生物學(xué)意義。本研究中，2 個位點(diǎn)與不同的生理指標(biāo)具有相關(guān)性，說明二者參與不同的調(diào)控過程，在奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)過程中均具有非常重要的意義。此外，這2 個位點(diǎn)與呼吸評分EBVs 均未有顯著的相關(guān)關(guān)系，可能與奶牛在熱應(yīng)激反應(yīng)時出現(xiàn)第二項呼吸有關(guān)。穆玉云等[43]也認(rèn)為當(dāng)牛體溫上升到一定程度會出現(xiàn)第二項呼吸，使呼吸頻率下降，而耐熱的牛呼吸頻率仍可保持著較高水平，其認(rèn)為呼吸頻率作為牛的耐熱指標(biāo)不完全準(zhǔn)確。在單倍型關(guān)聯(lián)分析中，3 種單倍型組合與直腸溫度EBVs、呼吸評分EBVs、流涎指數(shù)EBVs均無顯著相關(guān)性。優(yōu)勢單倍型均不為最優(yōu)等位基因組合，而是GA 或者AG，這可能是導(dǎo)致單倍型與表型性狀EBVs 關(guān)聯(lián)不顯著的原因。

4 結(jié) 論

本研究從細(xì)胞水平和分子水平表明奶牛HSPB8基因是與荷斯坦牛熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的重要候選基因。奶牛MDBK 和PBMC 細(xì)胞經(jīng)熱處理后，HSPB8基因表達(dá)量均極顯著上調(diào)，證明HSPB8是奶牛體內(nèi)受熱應(yīng)激誘導(dǎo)的重要基因。進(jìn)一步，在中國荷斯坦牛群中檢測到HSPB8基因的2 個SNPs，與奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)直腸溫度、呼吸評分、流涎指數(shù)估計育種值（EBVs）關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，位于3'UTR 區(qū)的g.58406042A＞G 位點(diǎn)和位于內(nèi)含子2 上的g.58406728G＞A 位點(diǎn)分別與直腸溫度和流涎指數(shù)EBVs 顯著相關(guān)，2 個位點(diǎn)具有A 等位基因的個體比具有G 等位基因的個體更耐熱，可用于分子標(biāo)記輔助育種培育耐熱中國荷斯坦牛群體。