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GnRH 主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)公豬的糞便Ca、P含量差異及機(jī)制研究

2021-06-19 02:34王彥旭韓興發(fā)曾憲垠曹曉涵孟風(fēng)艷
中國(guó)畜牧雜志 2021年6期
關(guān)鍵詞:去勢(shì)公豬小腸

王彥旭,韓興發(fā),曾憲垠,曹曉涵,孟風(fēng)艷

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川雅安 625014)

為去除由睪丸分泌的雄烯酮在脂肪沉積所導(dǎo)致的肉“膻味”,養(yǎng)豬生產(chǎn)中公豬需先閹割去勢(shì)后育肥[1-4]。然而,外科閹割會(huì)引起動(dòng)物高度應(yīng)激、外科傷口感染、死亡等不良后果[1,4],已越來越不被人們所接受[5-6]。促性腺激素釋放激素(GnRH)主動(dòng)免疫動(dòng)物可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量抗GnRH 抗體,特異性“中和”內(nèi)源性GnRH,從而抑制生殖軸活性,達(dá)到去勢(shì)的目的[1]。目前,GnRH 主動(dòng)免疫已成為最有望替代傳統(tǒng)外科閹割的新去勢(shì)方法[1-3]。前期研究發(fā)現(xiàn),GnRH 主動(dòng)免疫除顯著抑制公豬生殖功能,降低脂肪中雄烯酮含量外,還可顯著降低公豬糞便Ca、P排泄量[7]。然而,目前尚不清楚GnRH 主動(dòng)免疫去勢(shì)是如何降低公豬糞便Ca、P 等礦物元素含量。Ca、P 經(jīng)腸道消化后由小腸黏膜細(xì)胞中相應(yīng)Ca、P 轉(zhuǎn)運(yùn)載體協(xié)助運(yùn)輸至胞內(nèi)[8-9],未吸收部分則隨糞便排出體外,進(jìn)而造成環(huán)境污染。有研究報(bào)道,生長(zhǎng)激素可通過影響腸道黏膜生長(zhǎng)和分化,繼而影響腸道微量元素的吸收[10-11]。據(jù)此,本研究擬對(duì)比研究GnRH 主動(dòng)免疫和手術(shù)去勢(shì)對(duì)公豬血清生長(zhǎng)相關(guān)激素含量、小腸黏膜Ca 和P 轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)水平及糞便中Ca、P 含量的影響,以解析GnRH 主動(dòng)免疫降低公豬糞便Ca、P 含量的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 疫苗制備 GnRH 疫苗制備參照Oonk 等[12]的方法進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將30 頭10 周齡公豬(大白×長(zhǎng)白×杜洛克)隨機(jī)分為3 組,每組10 頭。其中對(duì)照組不做任何處理,手術(shù)去勢(shì)組公豬在出生1 周內(nèi)進(jìn)行手術(shù)閹割。免疫去勢(shì)組公豬在10 周齡時(shí)耳后頸部肌肉注射2 mL 62.5 μg GnRH 肽當(dāng)量去勢(shì)疫苗,并于8 周后以同樣的免疫方式和劑量進(jìn)行加免[3]。試驗(yàn)前和試驗(yàn)期間所有公豬自由采食和飲水,加免后8 周(即26 周齡時(shí))將所有動(dòng)物進(jìn)行屠宰取樣。

1.3 樣品采集及屠宰 所有公豬于初免當(dāng)天及初免后4、8、16 周頸靜脈采血10 mL。為減少因采血時(shí)間不同造成血液分析指標(biāo)差異,每次采血時(shí)間均限定在08:00 采食飼料前。所有血樣于4℃條件下,2 000 ×g 離心15 min 后分離血清,并于-20℃冰箱保存,用以血清激素含量的測(cè)定。加免后8 周屠宰所有試驗(yàn)公豬,迅速分離十二指腸,玻片刮取腸黏膜,液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存待用。屠宰前1 周起每天早晨收集公豬糞便,連續(xù)收集7 d。糞便收集后,室內(nèi)自然風(fēng)干后,過0.5 mm 篩,每頭豬每天取0.5 g 風(fēng)干糞便混合在一起,-20℃保存,用于測(cè)定糞便中Ca 及P 含量。

1.4 糞便Ca、P 含量測(cè)定 公豬糞便中Ca、P 含量采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)測(cè)定。每個(gè)糞便樣本重復(fù)測(cè)量2 次,測(cè)量由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)分析中心完成。

1.5 血清生長(zhǎng)激素測(cè)定 利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)技術(shù)測(cè)定公豬血清中生長(zhǎng)激素(GH)和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)濃度。測(cè)定方法嚴(yán)格參照試劑盒(Cusabio Biotech Co.Ltd)的操作說明書進(jìn)行,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2 次。GH 及IGF1 測(cè)定靈敏度分別為 2.5 ng/mL及0.156 ng/mL。所測(cè)定激素批內(nèi)及批間變異系數(shù)均<15%。

1.6 基因檢測(cè) 用液氮將公豬十二指腸黏膜組織研磨至粉狀,取約100 mg 組織粉末通過苯酚-氯仿法提取組織總RNA。參照試劑盒(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)說明書進(jìn)行RNA 提取。凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性,然后用Nanodrop 2000 測(cè)定總RNA 濃度及純度。取1 μg RNA 用于反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄試劑采用試劑盒PrimeScript?RT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa,Dalian,China)。以cDNA 為模板,設(shè)計(jì)基因特異性引物(表1),利用熒光定量PCR 方法檢測(cè)目的基因的表達(dá),每個(gè)樣品重復(fù)3 次。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min,95℃變性10 s,57~62℃退火,延伸25 s,反應(yīng)結(jié)束后用熔解檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。以β-actin為內(nèi)參基因,目的基因mRNA 表達(dá)經(jīng)β-actin矯正t 后,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 利用SAS 9.2 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3 組公豬十二指腸黏膜目的基因mRNA 的表達(dá)及糞便中Ca、P 含量的差異,采樣GLM 過程進(jìn)行單因素方差分析,Duncan's 法進(jìn)行多重比較。GH 和IGF1 含量采用混合模型(Mixed Model)重復(fù)性測(cè)量(Repeated Statement)方差分析。模型固定因素包括試驗(yàn)處理、采樣時(shí)間及兩者間的交互作用,隨機(jī)因素包括各處理組中動(dòng)物個(gè)體。采用Pearson 對(duì)血清IGF1 濃度與小腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因mRNA 表達(dá)水平間進(jìn)行相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示,其中P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 糞便中Ca、P 含量 如圖1 所示,與對(duì)照公豬相比,公豬手術(shù)去勢(shì)糞便中Ca、P 含量均增加(P<0.05)。GnRH 免疫后公豬糞便Ca、P 含量雖也升高,但仍低于手術(shù)去勢(shì)組公豬(P<0.05)。

圖1 GnRH 主動(dòng)免疫對(duì)公豬糞便Ca、P 含量的影響

2.2 血清生長(zhǎng)激素濃度 如圖2 所示,血清GH 和IGF1 濃度受試驗(yàn)處理、采樣時(shí)間及兩者間交互作用的影響(P<0.0001)。對(duì)照公豬中,血清GH 和IGF1 濃度在免疫去勢(shì)期間隨青春期發(fā)育而升高(P<0.05),從加免后到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)保持相對(duì)穩(wěn)定。手術(shù)去勢(shì)組公豬的血清GH 和IGF1 濃度在手術(shù)去勢(shì)后顯著降低,整個(gè)試驗(yàn)期間一直低于對(duì)照組公豬血清GH 和IGF1 濃度(P<0.05)。免疫去勢(shì)公豬的血清GH 和IGF1 濃度在初免到加免期間與對(duì)照組公豬血清GH 和IGF1 無顯著差異,但加免后開始下降,到屠宰取樣時(shí)低于對(duì)照組(P<0.05),但仍高于手術(shù)去勢(shì)組公豬(P<0.05)。

圖2 GnRH 主動(dòng)免疫對(duì)血清IGF1 和GH 濃度的影響

2.3 十二指腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因mRNA 表達(dá) 如圖3 所示,與對(duì)照組公豬相比,手術(shù)去勢(shì)下調(diào)公豬十二指腸黏膜Ca 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體TRPV6及PMCA1mRNA表達(dá)水平(P<0.05),下調(diào)公豬十二指腸黏膜P 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體Npt2bmRNA 表達(dá)水平(P<0.05),而對(duì)公豬Ca 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體CalbindinmRNA 表達(dá)無影響。而GnRH 主動(dòng)免疫對(duì)上述所測(cè)公豬十二指腸黏膜Ca、P 相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因mRNA 表達(dá)水平均無顯著影響。

圖3 GnRH 主動(dòng)免疫對(duì)十二指腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因mRNA 表達(dá)的影響

2.4 血清IGF1 與小腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因mRNA表達(dá)相關(guān)分析 Pearson 相關(guān)分析顯示,血清IGF1 濃度與十二指腸Ca 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體TRPV6(r=0.6807,P<0.001)、PMCA1(r=0.3399,P=0.0661)、P 離 子轉(zhuǎn)運(yùn)載體Npt2b(r=0.4396,P<0.0151)mRNA 表達(dá)量存在顯著正相關(guān)(圖4),表明十二指腸Ca、P 轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因mRNA 表達(dá)受血清IGF1 水平的影響。

圖4 血清IGF1 與十二指腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因mRNA 表達(dá)相關(guān)性

3 討 論

本團(tuán)隊(duì)前期研究表明,GnRH 主動(dòng)免疫顯著降低公豬血液生殖激素濃度,顯著抑制睪丸發(fā)育和精子生成;同時(shí)相較于手術(shù)去勢(shì)公豬,GnRH 主動(dòng)免疫顯著降低公豬背膘厚度,提高公豬的生產(chǎn)性能,表明GnRH 主動(dòng)免疫完全可以替代傳統(tǒng)外科去勢(shì)應(yīng)用于生豬養(yǎng)殖[3]。在此基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步開展GnRH 主動(dòng)免疫與手術(shù)去勢(shì)對(duì)公豬糞便Ca、P 含量的影響,為降低生豬養(yǎng)殖帶來的環(huán)境Ca、P 污染提供參考。

十二指腸是Ca、P 等元素消化吸收的主要場(chǎng)所[13],其中十二指腸對(duì)Ca 的吸收程度主要依賴于Ca 離子載體Calbindin、TRPV6及PMCA1的表達(dá)量[8];對(duì)P 的吸收程度主要依賴P 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體NPT2b 的表達(dá)量[9,14]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,手術(shù)去勢(shì)顯著下調(diào)公豬十二指腸黏膜Ca 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體TRPV6及PMCA1mRAN 表達(dá)水平,顯著下調(diào)小腸黏膜P 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體NPT2bmRNA 表達(dá)水平。與手術(shù)去勢(shì)形成鮮明對(duì)比,GnRH 免疫去勢(shì)對(duì)公豬十二指腸黏膜上述Ca、P 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因mRNA 表達(dá)均無明顯影響。相應(yīng)地,GnRH免疫去勢(shì)公豬糞便Ca、P 含量也顯著低于手術(shù)去勢(shì)公豬。因此,相較于手術(shù)去勢(shì)公豬,GnRH 免去勢(shì)公豬可能因小腸Ca、P 轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)較高,小腸Ca、P 吸收效率也較高,最終糞便Ca、P 環(huán)境排泄量降低。但本研究未對(duì)糞便Ca、P 排泄總量進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算,上述結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

哺乳動(dòng)物胃腸道黏膜是機(jī)體更新速度最快的組織[10],小腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運(yùn)載體數(shù)量受黏膜更新影響[8,13]。研究顯示,GH-IGF1 可通過影響小腸黏膜的生長(zhǎng)和分化,繼而影響小腸對(duì)Ca、P 的吸收[11]。本研究中公豬手術(shù)去勢(shì)后血清GH 和IGF1 濃度顯著降低,而GnRH 主動(dòng)免疫去勢(shì)公豬血清GH 和IGF1 濃度雖有所降低但仍顯著高于手術(shù)去勢(shì)公豬,與前人研究結(jié)果一致[15-16]。相關(guān)分析顯示,血清IGF1 濃度與十二指腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)存在顯著的正相關(guān)關(guān)系,表明GH-IGF1對(duì)公豬小腸黏膜Ca、P 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)具有重要調(diào)控作用。因此,GnRH 免去勢(shì)公豬小腸黏膜Ca、P轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)顯著高于手術(shù)去勢(shì)公豬,主要是由于其體內(nèi)GH-IGF1 濃度相對(duì)較高所致。同時(shí),大鼠中研究也發(fā)現(xiàn)GH-IGF1 可通過上調(diào)十二指腸Ca、P 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá),繼而提高小腸對(duì)Ca、P 等微量元素離子的吸收[17]。

4 結(jié) 論

綜上所述,GH-IGF1 是調(diào)控公豬小腸黏膜Ca、P離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的重要因子。相較于手術(shù)去勢(shì)公豬,GnRH 主動(dòng)免疫去勢(shì)公豬體內(nèi)較高水平的GHIGF1 提高了小腸黏膜Ca、P 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá);較高水平的Ca、P 離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)或許可提高小腸對(duì)Ca、P 離子的吸收率,繼而降低糞便Ca、P 含量及Ca、P 環(huán)境排泄量。因此,養(yǎng)豬生產(chǎn)中,可將GnRH主動(dòng)免疫作為一種降低公豬糞便Ca、P 含量的手段加以推廣應(yīng)用。

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