劉靜慧，李 沖，徐美利，牛志平，劉亞娟，陳寶江*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；3.晨光生物科技集團股份有限公司，河北邯鄲 057250；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)山區(qū)研究所，河北保定 071001；5.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001）

中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194 號文件宣告，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑的商品飼料?？股靥娲?，尤其是植物提取物成為研究熱點。綠原酸（Chlorogenic Acid）是由咖啡酸（Caffeic Acid）與奎尼酸（Quinic Acid）生成的縮酚酸，是植物有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，其廣泛存在于多種植物中，在金銀花、杜仲中含量較高。綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、保肝利膽、抗腫瘤等多種生物活性[1]，在動物生產(chǎn)中有一定應(yīng)用。賴星等[2]報道，綠原酸和橙皮苷能顯著提高仔豬的生長性能，其中綠原酸具有抗菌、抗炎和抗氧化作用，并能參與維持腸道微生物多樣性。李乃順等[3]報道，在草魚飼糧中添加綠原酸能顯著提高草魚的生長性能和非特異性免疫功能，改善草魚的肌肉品質(zhì)。綠原酸在兔生產(chǎn)中的研究報道較少，因此，本試驗旨在研究不同水平綠原酸對伊拉肉兔生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化率、腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)及其抗氧化性能的影響，為其在兔生產(chǎn)中的進一步研究和應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 綠原酸（有效含量≥80%）由晨光生物科技集團股份有限公司提供，由甜葉菊提取，有效成分為3,5-二咖啡?；G原酸和4,5-二咖啡酰基綠原酸。

1.2 試驗設(shè)計及試驗日糧 選擇35 日齡的斷奶伊拉兔72 只，體重（950±25）g，公、母各半，隨機分為6 個處理組，每組12 個重復(fù)，每個重復(fù)1 只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加18.80 mg/kg 桿菌肽鋅和15.51 mg/kg 喹烯酮，綠原酸組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加500、1 000、2 000、3 000 mg/kg 綠原酸?；A(chǔ)飼糧參照谷子林[4]推薦的兔營養(yǎng)需要進行配制，飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧教學(xué)基地進行，試驗前對兔舍和籠具進行清理和消毒，采用育成兔三層階梯式金屬籠單獨飼養(yǎng)，對每只兔籠進行單獨編號，自然通風(fēng)和光照，試驗期間平均溫度23℃，平均濕度55%，自由采食和飲水，每天08:00 和18:00 進行飼喂，投料后2 h 后對兔舍進行糞便清理、衛(wèi)生清掃。預(yù)試期7 d，正試期28 d。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 生產(chǎn)性能 正式試驗開始后，稱量各組試驗兔的體重獲得初始重，于第28 天稱量記錄試驗?zāi)┲?，根?jù)試驗天數(shù)計算平均日增重，統(tǒng)計試驗期間試驗兔的采食量，計算平均日采食量和耗料增重比。

統(tǒng)計試驗期間試驗兔的腹瀉情況，計算獲得腹瀉頻率，公式：

腹瀉頻率=［試驗期內(nèi)腹瀉只日數(shù)/（試驗天數(shù)×試驗只數(shù)）］×100%

1.4.2 消化試驗 飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，將試驗兔于消化代謝籠內(nèi)單籠飼養(yǎng)，每天飼喂2 次，自由采食和飲水。根據(jù)家兔消化試驗規(guī)程操作，采用全收糞法進行消化試驗，每天10:00 收集濾網(wǎng)上的全部新鮮糞便，清除糞球上的兔毛后稱重，將新鮮糞便分成2 份，一份用10% 鹽酸溶液固定揮發(fā)性氮，用于粗蛋白質(zhì)測定；剩余部分不做處理，用于其他常規(guī)營養(yǎng)成分測定。將每天收集的糞便放入-20℃儲存，連續(xù)收集7 d。把同一兔子7 d 的糞便充分混勻，放入65～70℃烘箱內(nèi)烘48 h，取出后回潮24 h。烘干后的糞便粉碎、過篩、待測。

分別測定飼糧和糞便樣品中營養(yǎng)物質(zhì)的含量。計算表觀消化率：

某營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率=（食入某營養(yǎng)物質(zhì)量－對應(yīng)糞中某營養(yǎng)物質(zhì)量）/食入某營養(yǎng)物質(zhì)量×100%

1.4.3 空腸抗氧化性能 正試期結(jié)束后，每組挑選接近平均體重的6 只試驗兔屠宰，迅速找到并剪取所需腸段，用冷生理鹽水輕輕沖洗掉其內(nèi)容物后置于冰臺上，在鑷子的輔助下用剪刀剪開小腸，暴露出腸黏膜，用吸水紙輕輕拭干小腸內(nèi)部，利用玻片刮取小腸黏膜置于凍存管中，-80℃保存。取出黏膜，研磨后按1:9 比例與PBS緩沖液混勻，4 000 r/min 離心10 min，分裝上清，于-80℃保存待測，采用生化法測定超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的活性和水平，試劑盒購自北京百智生物科技有限公司，貨號分別為BCEA002、BCBU-011、BCOS-009，具體操作按說明書指示進行。

1.4.4 空腸結(jié)構(gòu) 取試驗兔空腸放于10% 福爾馬林固定，HE 染色制作石蠟切片，在光鏡下觀察腸黏膜結(jié)構(gòu)，使用Moditec 照相處理軟件和和病理分析圖像系統(tǒng)測量各試驗兔腸段的腸絨毛高度、隱窩深度，并計算腸絨毛高度與隱窩深度比。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，用Duncan's 法進行多重比較，以P＜0.05 為差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸對肉兔生長性能的影響 由表2 可知，對照組和抗生素組各指標(biāo)差異不顯著。與對照組和抗生素組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組肉兔的末重分別升高了9.90%、9.82%（P＜0.05）。與對照組相比，2 000 mg/kg綠原酸組肉兔的平均日增重升高了18.73%（P＜0.05）。與對照組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組肉兔的耗料增重比降低了7.84%（P＞0.05），與抗生素組相比，2 000 mg/kg綠原酸組肉兔的耗料增重比降低了6.74%（P＞0.05）。對照組腹瀉率最高，綠原酸組其次，抗生素組最低。

表2 綠原酸對肉兔生長性能的影響

2.2 綠原酸對飼料主要營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率的影響 由表3 可知，與對照組和抗生素組相比，2 000 mg/kg綠原酸組 粗脂肪的消化率分別升高了2.07%和7.71%，（P＞0.05），與500 mg/kg 綠原酸組和3 000 mg/kg 綠原酸組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組粗脂肪的消化率分別升高了11.18% 和11.08%（P＜0.05）。與對照組及抗生素組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組鈣的消化率分別提高了7.41% 和8.47%（P＞0.05）。與3 000 mg/kg 綠原酸組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組鈣的消化率升高了12.27%（P＜0.05）。與對照組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組磷的消化率升高了13.92%（P＞0.05），與抗生素組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組磷的消化率降低了6.54%（P＞0.05），與抗生素組相比，3 000 mg/kg 綠原酸組磷的消化率降低了30.16%（P＜0.05）。

表3 綠原酸對肉兔飼料主要營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響 %

2.3 綠原酸對肉兔空腸抗氧化性能的影響 由表4 可知，與對照組相比，綠原酸組和抗生素組肉兔空腸黏膜T-AOC、SOD 活性及MDA 水平均無顯著差異。

表4 綠原酸對肉兔空腸抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 綠原酸對肉兔空腸結(jié)構(gòu)的影響 由圖1 可知，添加綠原酸可以改善肉兔的腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)，使空腸絨毛高度增加，隱窩深度變淺。由表5 可知，與對照組相比，綠原酸組肉兔空腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度分別升高了8.43%、11.10%、11.5%、2.80%以及18.31%、14.85%、18.31%、0.99%（P＜0.05）。綠原酸組肉兔空腸結(jié)構(gòu)形態(tài)的改善效果優(yōu)于抗生素組。

表5 綠原酸對肉兔空腸結(jié)構(gòu)的影響

圖1 綠原酸對肉兔空腸絨毛結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

3.1 綠原酸對肉兔生長性能的影響 飼糧中添加綠原酸可以改善動物的生長性能。劉則學(xué)等[5]報道，在仔豬飼糧中添加250 g/t 綠原酸使耗料增重比顯著降低，腹瀉頻率有降低趨勢，改善了仔豬的生長性能。Chen 等[6]發(fā)現(xiàn)在斷奶仔豬飼糧中添加1 000 mg/kg 綠原酸可顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率。陳鵬等[7]發(fā)現(xiàn)在斷奶仔豬飼糧中添加綠原酸可顯著提高仔豬平均日增重，改善生長性能。本試驗中，與對照組和抗生素組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組肉兔末重和平均日增重顯著升高，可能是添加綠原酸改善了肉兔空腸的結(jié)構(gòu)形態(tài)，使腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值均顯著升高，提高了肉兔對養(yǎng)分的消化吸收能力，且2 000 mg/kg 綠原酸組對總能、粗蛋白質(zhì)、粗纖維等營養(yǎng)素的消化率均有升高趨勢，從而提高了肉兔的生長性能。同時，綠原酸還具有抗菌、消炎以及增強免疫力等作用，對肉兔具有益生作用[8]。

3.2 綠原酸對肉兔營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響 飼料表觀消化率在一定程度上可反映動物對飼料養(yǎng)分的利用情況。王多伽[9]研究發(fā)現(xiàn)，吉戎兔飼糧中添加0.03%～0.27%綠原酸對粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維消化率均顯著提高。陳鵬等[10]報道，杜仲提取物中綠原酸含量大于5%，添加后可以提高斷奶仔豬對干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、總能的消化率。其可能原因是，添加綠原酸增強了消化酶的分泌能力，改善了腸道的結(jié)構(gòu)形態(tài)，從而促進對營養(yǎng)素的吸收效率[11]。本試驗中各組肉兔對各營養(yǎng)素的消化率差異并不顯著，可能與動物畜種與機體的生理特點和消化機制有關(guān)。

3.3 綠原酸對肉兔空腸抗氧化性能的影響 腸道是動物主要的消化吸收器官，其有著自己的抗氧化系統(tǒng)，過程中有自由基的產(chǎn)生，過量的自由基與較低的抗氧化酶活性打破了氧化還原狀態(tài)的平衡，損傷腸道。Chen 等[12]研究表明，飼喂1 000 mg/kg 綠原酸可顯著提高斷奶仔豬十二指腸和空腸谷胱甘肽過氧化酶、過氧化氫酶活性，降低空腸和回腸MDA 活性。周艷[13]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠飼糧中添加60 mg/kg 綠原酸能顯著提高慢性內(nèi)毒素應(yīng)激大鼠回腸組織SOD 活性和T-AOC，降低組織和線粒體MDA 含量。其原因可能是綠原酸在代謝過程中伴隨著新的酚酸產(chǎn)生，有良好的抗氧化能力，使腸道系統(tǒng)的抗氧化系統(tǒng)發(fā)生變化[14]。綠原酸具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，可以通過捐贈氫原子減少自由基，抑制氧化反應(yīng)。也可能是綠原酸可抑制TLR4/NF-κB 信號通路并激活Nrf2/HO-1 信號通路，增強抗氧化酶活性[15]。本試驗中，各組空腸抗氧化性能差異并不顯著，可能是試驗兔在屠宰時發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，胃腸道黏液分泌不足。

3.4 綠原酸對肉兔空腸結(jié)構(gòu)的影響 Zhang 等[16]報道，在仔豬飼糧中添加綠原酸，可以使其十二指腸絨毛高度及絨毛高度/隱窩深度值均升高，隱窩深度顯著降低，也可以使空腸絨毛高度升高。Chen 等[17]發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼糧中添加1 000 mg/kg 綠原酸可顯著提高絨毛高度和絨毛高度/ 隱窩深度值。黃芳等[18]報道，綠原酸可以緩解鎘導(dǎo)致的大鼠腸道黏膜損傷，使絨毛高度增大隱窩深度變淺。本試驗中，與對照組相比，抗生素組和綠原酸組的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值均顯著增高，說明綠原酸可以改善肉兔空腸的結(jié)構(gòu)形態(tài)，增加空腸對營養(yǎng)的吸收面積。其可能的原因是綠原酸能降低生長過程的氧化應(yīng)激水平，絨毛長度增加，保護腸道形態(tài)，抵御細菌侵入。也可能增加腸道緊密連接蛋白的表達，改變腸道的通透性，維持腸道微生物群落的多樣性及微生態(tài)平衡[19]。綠原酸的多種生物學(xué)功能減少了各種應(yīng)激、致病菌、病毒對腸道的影響，有益于腸道發(fā)育。

4 結(jié) 論

本試驗中，添加綠原酸可改善肉兔的空腸結(jié)構(gòu)形態(tài)，改善肉兔的營養(yǎng)物質(zhì)消化率來提高肉兔的生長性能，推薦綠原酸添加量為2 000 mg/kg。