胡 紅，劉金艷，曾 艷，李 洋，饒澤斌，胡 萍，唐志如*

（1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，生物飼料與分子營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.湖南省微生物研究院，湖南長(zhǎng)沙 410000）

飼糧蛋白質(zhì)的消化率受蛋白質(zhì)來源的氨基酸組成濃度與蛋白質(zhì)源一起食用的其他飼料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等多種因素影響[1]。蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)被分解為氨基酸，腸道微生物起重要作用。研究表明，仔豬蛋白質(zhì)消化率更多地取決于蛋白質(zhì)來源的氨基酸組成[2]。不同蛋白質(zhì)來源的飼料氨基酸和粗蛋白質(zhì)（CP）含量與組成存在很大差異，常見幾種物質(zhì)的CP 含量較高，豆粕CP 含量為42%～50%，菜粕為32%～44%，魚粉為50%～65%，棉粕為43%～53%，其中豆粕需求量較大。不同蛋白質(zhì)飼料各有優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)，不同情況可選擇性地使用不同蛋白質(zhì)飼料，因此其他幾類蛋白質(zhì)原料也常作為豆粕的替代品[3-7]。動(dòng)物腸道是蛋白質(zhì)和氨基酸代謝的主要產(chǎn)所，腸道微生物對(duì)動(dòng)物腸道的蛋白質(zhì)和氨基酸代謝十分重要[8]。微生物對(duì)CP 的利用是一個(gè)分解與合成的動(dòng)態(tài)過程，即蛋白質(zhì)的分解和氨基酸合成蛋白質(zhì)的變化過程。由于蛋白質(zhì)飼料源結(jié)構(gòu)組成的差異，雖然飼料中的CP 含量相同，但飼料源蛋白質(zhì)的氨基酸組成不同，其代謝方式也有較大差異，這些差異會(huì)造成微生物對(duì)其蛋白及游離氨基酸利用的差異。因此，研究豬腸道微生物對(duì)不同飼料源氨基酸利用的差異性，對(duì)于氮源的選擇及配制具有重要參考價(jià)值[9]。為消除動(dòng)物宿主的影響，本試驗(yàn)所取樣本為腸道內(nèi)容物中的微生物而非黏膜微生物，采用體外試驗(yàn)研究豬不同腸段內(nèi)容物微生物對(duì)豆粕、棉粕、菜粕、魚粉的代謝及不同飼料源氨基酸消失率的差異性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-Oxalacetic Transaminase，GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-Pyruvic Transaminase，GPT）、腺苷脫氨酶（Adenosine Deaminase，ADA）生化試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所，化學(xué)試劑購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司。厭氧基礎(chǔ)培養(yǎng)基參照Dai 等[10]的方法進(jìn)行配制。

1.2 試驗(yàn)方法 選取3 頭30 kg 左右健康杜×長(zhǎng)×大生長(zhǎng)豬屠宰，無菌操作以獲得50 mL 空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物；用500 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（pH 7.3）反復(fù)清洗內(nèi)容物5 次，梯度離心后得到菌懸液。在250 mL 玻璃瓶中加入180 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，先取5 mL 空腸微生物菌懸液接種于250 mL 預(yù)熱的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 h 后取5 mL培養(yǎng)液用于測(cè)定氨基酸含量及酶活力；再加入5 mL 回腸微生物懸混液繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，取5 mL 培養(yǎng)液用于測(cè)定氨基酸含量及酶活力；最后加入5 mL 盲腸微生物懸混液繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，取5 mL 培養(yǎng)液用于測(cè)定氨基酸含量及酶活力。試驗(yàn)分為豆粕組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+豆粕+微生物）、棉粕組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+棉粕+微生物）、菜粕組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+菜粕+微生物）、魚粉組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+魚粉+微生物）4 個(gè)組；另設(shè)1 個(gè)負(fù)對(duì)照組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+微生物）與3 個(gè)正對(duì)照組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+豆粕，基礎(chǔ)培養(yǎng)基+棉粕，基礎(chǔ)培養(yǎng)基+菜粕，基礎(chǔ)培養(yǎng)基+魚粉），每組3 個(gè)重復(fù)。各組培養(yǎng)基的組成及含量見表1。根據(jù)食糜在體內(nèi)的停留時(shí)間（空腸4 h，回腸4 h，盲腸4 h）設(shè)置各個(gè)腸段的培養(yǎng)時(shí)間。

表1 各組培養(yǎng)基的組成及含量 mg/mL

生長(zhǎng)豬飼糧組成：玉米58.6%，豆粕29%，麥麩7.8%，豆油1.55%，L-賴氨酸.HCl 0.18%，L-蘇氨酸 0.01%，磷酸一鈣0.69%，石灰石0.87%，鹽0.3%，預(yù)混料1%（預(yù)混料為每千克飼糧提供維生素A 1 353 IU、維生素B11.000 mg、維生素B22.400 mg、維生素B61.000 mg、維生素B128.100 μg、維生素D 156 IU、維生素E 11 IU、維生素K 0.520 mg、膽堿 0.310 g、生物素0.050 mg、葉酸0.310 mg、泛酸7.900 mg、煙酸31.200 mg、銅3.900 mg、鐵57.100 mg、錳2.100 mg、鋅 58 mg、碘 0.150 mg、硒 0.185 mg）總計(jì)100%。

1.3 氨基酸含量的測(cè)定

1.3.1 樣品前處理 準(zhǔn)確量取樣品1 mL 于15 mm×150 mm試管中，向盛有樣品的試管中加入6 mol/L 鹽酸10 mL，振蕩混勻。用酒精噴燈把該試管口下1/3 處拉細(xì)到4～6 mm，抽真空10 min 后封管。處理過的試管置（110±1）℃恒溫烘箱中沙浴水解22 h，拿出冷卻至室溫，搖勻過濾，取1 mL 濾液于50 mL 燒杯中，用60℃恒溫水浴蒸干濾液，用 0.02 mol/L 鹽酸將其稀釋6 倍，用0.22 μm 濾膜過濾上機(jī)分析。

1.3.2 分析條件 采用日立L-8800 型全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定氨基酸含量。一個(gè)樣品分析周期為53 min。分離柱：（4.6 mm×60 mm）洗脫液流速0.4 mL/min，柱溫70℃，柱壓12.627 MPa；反應(yīng)柱：茚三酮及茚三酮緩沖液流速0.35 mL/min，柱溫135℃，柱壓1.078 MPa。

1.4 氨基酸脫羧酶與轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定 色氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶、甘氨酸脫羧酶、酪氨酸脫羧酶的活性測(cè)定參照唐志如等[11]和賴星等[12]報(bào)道的方法進(jìn)行。根據(jù)南京建成生物工程研究所的試劑盒說明，采用比色法結(jié)合紫外分光光度計(jì)，測(cè)定GOT（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、GPT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、ADA（腺苷脫氨酶）酶活力。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)，Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。試驗(yàn)結(jié)果用平均標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05為差異顯著。氨基酸消失率Dt計(jì)算公式如下[13]：

其中，Dt為t h 的氨基酸消失率，AA0為0 h 試驗(yàn)組氨基酸濃度，AAt為試驗(yàn)組t h 的氨基酸濃度，PC0為正對(duì)照組0 h 的氨基酸濃度，PCt為正對(duì)照組t h 的氨基酸濃度；NC0為負(fù)對(duì)照組0 h 的氨基酸濃度；NCt為負(fù)對(duì)照組t h 的氨基酸濃度。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)豬腸道微生物脫羧酶、轉(zhuǎn)氨酶和脫氨酶對(duì)不同飼料源的響應(yīng)規(guī)律 由表2 可知，接種空腸微生物培養(yǎng)4 h 后，菜粕組的色氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶、甘氨酸脫羧酶、酪氨酸脫羧酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、腺苷脫氨酶酶活力均為最大。因此空腸微生物脫羧酶對(duì)不同飼料源的響應(yīng)規(guī)律由高到低為菜粕、棉粕和魚粉、豆粕。

表2 不同飼料源對(duì)腸道微生物酶活力的影響（n=3） U/mg prot

接種回腸微生物培養(yǎng)4 h 后，棉粕組的色氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶、甘氨酸脫羧酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、腺苷脫氨酶酶活力和魚粉組的賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、甘氨酸脫羧酶、酪氨酸脫羧酶活力均為最大。因此回腸微生物氨基酸脫羧酶、轉(zhuǎn)氨和脫氨酶對(duì)不同飼料源響應(yīng)規(guī)律由高到低為棉粕和魚粉、菜粕和豆粕。

接種盲腸微生物培養(yǎng)4 h 后，魚粉組的組氨酸脫羧酶、甘氨酸脫羧酶、酪氨酸脫羧酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力均為最大。因此，盲腸微生物氨基酸脫羧酶和轉(zhuǎn)氨和脫氨酶對(duì)不同飼料源響應(yīng)規(guī)律由高到低為魚粉和菜粕、棉粕和豆粕。

2.2 生長(zhǎng)豬腸道微生物對(duì)不同飼料源的氨基酸消失率的利用規(guī)律 由表3 可知，在接種空腸微生物培養(yǎng)4 h 后，菜粕組氨基酸被微生物利用最大；菜粕組的蘇氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、脯氨酸的氨基酸消失率顯著高于豆粕組；不同飼料源在空腸微生物作用下氨基酸消失程度從高到低表現(xiàn)為菜粕組、豆粕組、魚粉組和棉粕組。

表3 豬腸道微生物對(duì)不同飼料源氨基酸消失率的影響（n=3） %

注：ND 代表沒有消失。

接種回腸微生物培養(yǎng)4 h 后大部分氨基酸并未消失。不同飼料源在回腸微生物作用下氨基酸消失程度從高到低表現(xiàn)為棉粕組、魚粉組、菜粕組和豆粕組。

接種盲腸微生物培養(yǎng)4 h 過后，各組氨基酸均出現(xiàn)大幅度消失。豆粕組天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、組氨酸都顯著低于其他3 組。而棉粕組可見除了半胱氨酸、纈氨酸、精氨酸外其他氨基酸都顯著高于豆粕組而低于魚粉組。除了半胱氨酸和精氨酸外，魚粉組的其他氨基酸都顯著低于菜粕組而高于棉粕組和豆粕組。除了半胱氨酸外，菜粕組的其他氨基酸消失率均在80% 以上，多數(shù)氨基酸消失率都是最高?？傮w上，各組空腸與回腸的氨基酸消失率較低，可見總氨基酸消失程度從高到低為菜粕組、魚粉組、棉粕組、豆粕組。

整體可見，魚粉組氨基酸在空腸微生物的作用下未消失，在回腸和盲腸微生物的作用下各氨基酸逐漸消失；豆粕組、棉粕組在盲腸微生物作用下氨基酸才開始消失；菜粕組氨基酸表現(xiàn)的規(guī)律為在空腸微生物作用下先消失，在回腸微生物作用后得到補(bǔ)償，在盲腸微生物作用后又開始消失；不同飼料源在空腸和回腸微生物作用下氨基酸消失都較少，在盲腸微生物作用下大幅度消失。

3 討 論

腸道微生物種群對(duì)飼料消化生物學(xué)過程有著極大影響，腸道微生物酶的差異源于微生物種群的差異[14]。本試驗(yàn)在體外進(jìn)行，不考慮機(jī)體與微生物及物質(zhì)的互作，只考慮微生物與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝互作，結(jié)果表明酶活力大小與氨基酸消失率存在一定關(guān)聯(lián)，空腸微生物作用后的菜粕、回腸微生物作用后的棉粕組、盲腸微生物作用后的魚粉組和菜粕組的各種酶活性與氨基酸消失率最大；整體可見不同腸道微生物作用下各組氨基酸消失率由高到低均為盲腸微生物、空腸微生物、回腸微生物，這與胡紅等[23]研究得到的不同腸段大豆蛋白組的氨基酸消失率由高到低為盲腸微生物、空腸微生物、回腸微生物結(jié)果一致。劉藝端等[15]研究認(rèn)為，在體外培養(yǎng)條件下，空腸和回腸微生物具有相似的發(fā)酵規(guī)律。本試驗(yàn)中空腸與回腸的氨基酸消失率在各個(gè)組都很低，與劉藝端等[15]研究結(jié)果存在一致性。賴星等[12]發(fā)現(xiàn)，飼糧粗蛋白質(zhì)水平顯著影響腸道微生物酶的活力，這是腸道微生物對(duì)氨基酸差異性降解和動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)利用率低的原因之一；另外，鄧歡等[16]研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物的蛋氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸脫羧酶活力對(duì)飼糧高CP 水平響應(yīng)明顯，這些都證明酶活力與蛋白質(zhì)及氨基酸代謝的密切關(guān)系，為本試驗(yàn)測(cè)定的相關(guān)酶活力指標(biāo)提供有效參考。本試驗(yàn)也證明，微生物酶活力與氨基酸消失率存在一定聯(lián)系，酶活力越大其代謝活動(dòng)越強(qiáng)，但由于酶活力受環(huán)境條件影響較大，在不同腸道內(nèi)pH[17]等條件不同會(huì)影響酶活力，從而形成不同氨基酸消失率。另一方面比較氨基酸的消失率與酶活力，可見在空腸與回腸中有大量氨基酸都未檢測(cè)到其消失率，但依然能檢測(cè)到微生物酶活力，說明氨基酸的消失率為0 并不代表沒有氨基酸的代謝，氨基酸的合成大于或等于分解。

Dai 等[10]研究體外培養(yǎng)豬小腸微生物對(duì)氨基酸的利用中表明，在十二指腸、空腸或回腸中，賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和組氨酸在24 h 后消失率為50%～90%，而本結(jié)果中整體可見氨基酸在盲腸微生物加入后消失率最高，其原因可能是Dai 等的試驗(yàn)中只加入了游離氨基酸無其他可利用的氮源，并且本試驗(yàn)培養(yǎng)總共為12 h 沒有其作用時(shí)間長(zhǎng)，在最后階段加入盲腸微生物，再加上前面兩階段加入的空腸、回腸微生物經(jīng)過時(shí)間累積，其他可利用氮源已經(jīng)消耗過了，再來利用的游離氨基酸，此時(shí)的微生物多樣性豐度更高，也更有利于氨基酸代謝。

不同飼料源由于其物質(zhì)本身組成（如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等）差異[18-19]，微生物對(duì)其進(jìn)行的代謝途徑、主要代謝產(chǎn)物、優(yōu)勢(shì)菌株[20-21]的形成等都會(huì)存在較大差異。本試驗(yàn)中各組CP 含量相同，因飼料源的差異，其他粗纖維、粗脂肪等含量就會(huì)出現(xiàn)差異。飼糧中，豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他幾類蛋白質(zhì)飼料源，這點(diǎn)從蛋白質(zhì)飼料源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成上也可解釋。馬占霞等[19]研究發(fā)現(xiàn)，豆粕的纖維素復(fù)合物峰高、峰面積均極顯著高于普通菜粕，豆粕中的酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素含量顯著低于普通菜粕；碳水化合物組分剖分中，豆粕內(nèi)不可利用的中性洗滌纖維含量顯著低于普通菜粕。本試驗(yàn)中豆粕粗纖維低于菜粕和棉粕，從碳水化合物利用角度而言，豆粕飼用價(jià)值高于菜粕和棉粕，可見腸道內(nèi)微生物對(duì)于可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更多的豆粕的利用更多，菜粕與棉粕中的可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)少且不可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)多，從而使微生物對(duì)其中游離氨基酸的利用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于豆粕組。Santos 等[22]研究不同蛋白質(zhì)源哺乳山羊的氮代謝影響，發(fā)現(xiàn)在CP 水平相同的情況下，以棉籽粉為蛋白質(zhì)源的飼糧可增加尿液中的氮排泄量和負(fù)氮平衡，顯著高于豆粕組，認(rèn)為尿中氮的流失與瘤胃中可降解蛋白質(zhì)含量有關(guān)，這種營(yíng)養(yǎng)素的消耗量越大，產(chǎn)生氨的量就越大，可能超出瘤胃微生物的使用量，從而導(dǎo)致肝臟中尿素合成增加和尿液排泄量增加，從一定程度上解釋了本試驗(yàn)結(jié)果，即微生物對(duì)棉粕組氨基酸的利用高于豆粕組，氮流失得更多。

另外，有研究從不同飼料飼料源物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及組成的分析來評(píng)估其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。唐春梅[4]對(duì)不同氮源的養(yǎng)分組成研究發(fā)現(xiàn)，菜粕的快速降解部分高于豆柏和棉粕，豆粕慢速降解部分高于棉粕和菜粕，菜粕的不可利用蛋白是豆粕和棉粕的3 倍以上，可見不同飼料源的CP 組成存在較大差異。雖然本試驗(yàn)原料中控制了各組中CP 含量相同，但其組成不同，同時(shí)由于豆粕的CP中快速降解部分低，因此豆粕組微生物慢速降解占主要部分，對(duì)游離氨基酸的降解力度?。欢似傻目焖俳到獠糠指哂诙拱睾兔奁?，且由于其不可利用蛋白都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于豆粕和棉粕，因此菜粕組微生物會(huì)優(yōu)先利用游離氨基酸從而造成其TAA 的消失率相對(duì)更高。曹克飛[21]將豬腸道微生物于不同氮源培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，得到的產(chǎn)蛋白酶菌株的蛋白酶活性及對(duì)蛋白的消化率均為豆粕最高，棉粕次之，魚粉最低，可見豬腸道微生物的組成中，豆粕類型飼料源會(huì)更有利于產(chǎn)蛋白酶菌株生長(zhǎng)，產(chǎn)生的蛋白酶活性也更高，從而使微生物首先利用豆粕中的物質(zhì)，而對(duì)于游離氨基酸的利用相對(duì)于其他組更低，造成本試驗(yàn)中氨基酸消失率由高到低為菜粕組、魚粉組、棉粕組、豆粕組，因此與本試驗(yàn)結(jié)果存在一致性，可見豆粕在豬飼糧中更適合作為飼料源物質(zhì)。另外，在研究豬腸道微生物對(duì)游離氨基酸、小分子多肽、大豆蛋白的氨基酸利用時(shí)發(fā)現(xiàn)，微生物對(duì)大豆蛋白質(zhì)組的TAA 消失率最高[23]，說明微生物在利用氮源時(shí)，會(huì)優(yōu)先利用CP，其次利用游離氨基酸，這一結(jié)果對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)行了很好地解釋。

氨基酸消失率的高低差異在于蛋白質(zhì)飼料源中可利用物質(zhì)與不可利用物質(zhì)的比例、微生物優(yōu)先利用CP 還是游離氨基酸、微生物種屬差異。在豆粕組不可利用蛋白少可利用蛋白多，使微生物更易對(duì)CP 分解形成大量游離氨基酸，氨基酸的形成與分解同時(shí)進(jìn)行，因此游離氨基酸的消失率很低；而與豆粕組相比，其他3 組的可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)少，不可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)多，對(duì)游離氨基酸的利用高于豆粕組，以及由于微生物動(dòng)態(tài)變化，產(chǎn)蛋白酶菌株少，物質(zhì)結(jié)構(gòu)更不適合微生物對(duì)其進(jìn)行利用，而更多利用游離氨基酸，產(chǎn)生更多氮排泄，氨基酸消失率遠(yuǎn)高于豆粕組。前人研究發(fā)現(xiàn)，豆粕較其他原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，各方面限制性更小，是更為優(yōu)質(zhì)的豬飼料源[19,24-25]。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，豬腸道微生物對(duì)豆粕、棉粕、菜粕、魚粉4 種不同飼料源的利用存在差異性，對(duì)豆粕的氨基酸利用程度最小，對(duì)菜粕的氨基酸利用程度最大，對(duì)棉粕與魚粉的氨基酸利用程度居中，這可能與不同飼料源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成以及微生物種屬有關(guān)。