李晶，劉昌嶺，吳能友，賀行良，許曉晴,3，陳燁，孟慶國(guó)

1.自然資源部天然氣水合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)地質(zhì)調(diào)查局青島海洋地質(zhì)研究所，青島 266071 2.海洋國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋礦產(chǎn)資源評(píng)價(jià)與探測(cè)技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266071 3.中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266100

甲烷好氧氧化作用是由甲烷氧化細(xì)菌介導(dǎo)下甲烷和氧分子分別作為電子供體和電子受體的生物地球化學(xué)反應(yīng)[1]，主要發(fā)生于海底表層沉積物和海水中，是影響海洋生態(tài)系統(tǒng)、控制溫室氣體排放的重要生化過(guò)程[2-3]。海洋泄露環(huán)境中，不同泄露位置、泄露時(shí)刻或縱深層位的甲烷好氧氧化強(qiáng)度存在顯著差異，每天每平方米的氧化速率跨度可從幾個(gè)納摩爾到幾百個(gè)毫摩爾，與之相應(yīng)的甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)也不盡相同[4]，造成這一現(xiàn)象的原因可能是海底不同區(qū)域位置的環(huán)境因子差異。

前人曾通過(guò)模擬不同的溫度[5-6]、壓力[7]、甲烷濃度[8]或營(yíng)養(yǎng)源[9]等參數(shù)條件，探究了不同環(huán)境因子條件下氣體氧化速率及其對(duì)應(yīng)的微生物群落結(jié)構(gòu)。除此之外，一些實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)氧濃度也是影響甲烷好氧氧化過(guò)程的重要參數(shù)之一。首先，從微生物角度而言，氧濃度對(duì)甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)和活性都存在十分重要的影響。不同甲烷氧化菌具有不同的最適氧濃度范圍，其濃度范圍差異較大，當(dāng)氧濃度偏離最適范圍時(shí)，其微生物活性及甲烷氧化潛力將受到顯著抑制。例如Methylosinus trichosporium的最適氧濃度范圍較大，跨度為1.6%～18%，而Methylosoma difficilesp.nov.對(duì)氧濃度要求較為苛刻，最適氧濃度僅為2%左右[10]。在極端低氧生境中，大部分氧化菌如Methylococcus和Methylomonas等通常處于休眠狀態(tài)，僅有CandidatusMethylomirabilis oxyferea等少數(shù)氧化菌仍可借助自身的氧轉(zhuǎn)化機(jī)制存活，進(jìn)而發(fā)生甲烷氧化反應(yīng)[1]。其次，從甲烷氧化速率角度而言，氧濃度對(duì)甲烷氧化菌的影響將直接導(dǎo)致其甲烷氧化潛力的差異。前人對(duì)不同生態(tài)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，氧濃度對(duì)甲烷氧化速率的影響規(guī)律不一。例如，某樹(shù)葉堆肥低氧培養(yǎng)（1.5%）下甲烷氧化速率高于高氧培養(yǎng)（10.5%）[11]，而某稻田土在高氧條件（19.2%）下的氧化速率卻顯著高于低氧條件（1.1%）[12]，推測(cè)認(rèn)為氧濃度對(duì)甲烷氧化的影響可能還受其他環(huán)境因素的限制。但是，以上實(shí)驗(yàn)研究使用的菌群大都來(lái)自湖泊、草原、水稻田等環(huán)境，指示陸地生態(tài)系統(tǒng)規(guī)律，海洋和陸地兩種不同環(huán)境系統(tǒng)的原位微生物組成存在較大不同，兩種生境的菌群特性及其甲烷氧化特征可能并不一致[1]。

海水溶解氧主要來(lái)源于大氣和海洋植物光合作用，受海洋環(huán)流、海洋生物、氣候以及大陸徑流等多重因素影響，海水溶解氧的分布十分復(fù)雜[13]。溶解氧具有一定的垂向分布特征，通常由表層海-氣界面平衡狀態(tài)（約200 μmol/L）疊加植物光合作用增長(zhǎng)至最高值（約250 μmol/L），隨后急劇降低至最小值（約100 μmol/L），進(jìn)而逐漸隨深度回升至表層氧濃度[14-15]。總體來(lái)看，海洋生境氧濃度分布雖較為復(fù)雜，但是總體呈現(xiàn)低氧的生境特點(diǎn)。海洋低氧生境與低溫、高壓、高鹽等生境特點(diǎn)相耦合的環(huán)境背景下，已發(fā)現(xiàn)的甲烷氧化菌多以Methylocicrobium屬、Methylococcus屬、Methylocaldum屬、Methylobacter屬和Methylocystis屬等I 型氧化菌為主[16]，它們是海洋生境的優(yōu)勢(shì)菌群。Vekemann等[17]曾利用海底沉積物樣品實(shí)驗(yàn)?zāi)M了不同氧濃度（1%O2和20%O2）的甲烷氧化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)低氧下氧化速率相對(duì)較高，但并未從微生物角度分析其中緣由。

氧濃度等環(huán)境因子對(duì)甲烷好氧氧化影響的相關(guān)研究，大多來(lái)自于湖泊、草原等陸地生態(tài)系統(tǒng)，海洋生境中甲烷好氧氧化研究相對(duì)較弱。那么，氧濃度對(duì)來(lái)自海洋生境的甲烷氧化過(guò)程有何影響？氧化菌群落結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)繁殖情況及甲烷氧化速率如何表現(xiàn)？為解決以上問(wèn)題，本文通過(guò)室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)手段，利用來(lái)自海底油氣泄露區(qū)的新鮮沉積物樣品作為甲烷氧化菌的菌種來(lái)源，模擬不同氧濃度條件下的甲烷好氧氧化過(guò)程，分析氧濃度對(duì)甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)繁殖情況的影響規(guī)律，探討不同氧濃度下的甲烷氧化潛力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌種來(lái)自我國(guó)東部渤海灣沙壘田油氣滲漏 區(qū) 的 表 層 沉 積 物（38°16′52.827′′N、118°53′56.893′′W），水深22.7m。現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試獲得沉積物pH值和氧化還原電位分別為7.57和?29 mV，海底底層溶氧量（DO）年平均值為6.61 mg/L。樣品采集方式為遙控潛水式箱形采樣器，沉積物重約2.0 kg，避光4 ℃密封貯存。在實(shí)驗(yàn)工作前，已通過(guò)預(yù)培養(yǎng)試驗(yàn)驗(yàn)證了沉積物樣品中含有豐富的活性甲烷好氧氧化菌。關(guān)于沉積物來(lái)源和采集過(guò)程的更多細(xì)節(jié)可詳見(jiàn)Li等[8]。

實(shí)驗(yàn)所采用的氣體包括高純CH4、O2和N2，純度均為99.999%。實(shí)驗(yàn)中微生物培養(yǎng)液為人工配制海水，配比為NaCl 26.5 g/L，MgCl224 g/L，KCl 0.73 g/L，MgSO43.3 g/L，NaHCO30.2 g/L，CaCl21.1 g/L，NaBr 0.28 g/L，pH為7.5。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及步驟

根據(jù)海洋含氧量特征，本研究將海洋環(huán)境分為完全無(wú)氧、含微量氧、相對(duì)富氧3個(gè)氧濃度條件。另外，為了考察海洋來(lái)源的甲烷氧化菌在極端富氧環(huán)境中的表現(xiàn)，同時(shí)考慮甲烷好氧氧化反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量比，實(shí)驗(yàn)還模擬了一種極端富氧條件。因此，實(shí)驗(yàn)中共設(shè)計(jì)4個(gè)氧濃度條件：0%O2（實(shí)驗(yàn)i）、1%O2（實(shí)驗(yàn)ii）、10%O2（實(shí)驗(yàn)iii）、50%O2（實(shí)驗(yàn)iv），依次對(duì)應(yīng)了完全無(wú)氧、含微量氧、相對(duì)富氧以及極端富氧的氧濃度條件。其中，實(shí)驗(yàn)i（0%O2）體系中，在頂空無(wú)氧氣供給的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)還在溶液中額外添加了Na2S試劑，直至氧化還原電位ORP達(dá)到約?200mV以達(dá)到完全無(wú)氧。實(shí)驗(yàn)ii（1%O2）的設(shè)定用于模擬海底含微量氧環(huán)境，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定得知，1%O2頂空條件下溶液的氧化還原電位約為?50mV，其氧濃度條件與渤海與采樣位置的原始生存環(huán)境（?29 mV）最為接近。實(shí)驗(yàn)iii（10%O2）用于模擬海水表層、富氧的南極中層水等相對(duì)富氧的氧濃度環(huán)境[18]。實(shí)驗(yàn)iv（50%O2）中O2含量顯著高于大氣O2濃度，屬于極端富氧環(huán)境。各實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置了兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組。頂空氣體中，甲烷分壓設(shè)定為10%，另外還額外注入高純氮?dú)庾鳛閴毫ρa(bǔ)償氣體，防止后續(xù)實(shí)驗(yàn)中頻繁取氣操作造成實(shí)驗(yàn)體系真空。根據(jù)微需氧微生物培養(yǎng)方法及前期預(yù)試驗(yàn)，1%O2與10%O2實(shí)驗(yàn)體系需定期補(bǔ)充O2（2 mL/d），使系統(tǒng)內(nèi)O2濃度保持相對(duì)穩(wěn)定，該補(bǔ)氣操作所產(chǎn)生的壓力波動(dòng)較小（＜0.002 MPa），可忽略不計(jì)。本實(shí)驗(yàn)中還設(shè)置了一個(gè)空白組（50%O2無(wú)CH4），在無(wú)CH4供應(yīng)條件下僅充入50% O2，用于觀察沉積物中有機(jī)質(zhì)發(fā)生完全氧化作用所產(chǎn)生的O2損耗量和CO2產(chǎn)生量。各實(shí)驗(yàn)組的具體設(shè)定情況詳見(jiàn)表1。

實(shí)驗(yàn)具體操作步驟如下，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組首先稱取約12 g的沉積物樣品與30mL人工海水（V/V接近1/1）進(jìn)行混勻，注入120mL玻璃鉗口瓶中，隨后進(jìn)行N2洗氣操作以除去瓶?jī)?nèi)空氣，丁基橡膠塞密封后用針管連接真空泵進(jìn)行抽真空處理。按照實(shí)驗(yàn)方案分別向各實(shí)驗(yàn)組充入實(shí)驗(yàn)氣體和 N2補(bǔ)充氣。另外，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)體系中加入了刃天青顯色劑，根據(jù)顯色程度對(duì)實(shí)驗(yàn)體系O2濃度情況進(jìn)行輔助觀察。將配制好的8組實(shí)驗(yàn)樣品分別倒置放于恒溫培養(yǎng)搖床中進(jìn)行恒溫避光培養(yǎng)。

1.3 氣體組分測(cè)定及氧化速率計(jì)算

1.3.1 氣體組分測(cè)定分析

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中定期對(duì)頂空氣體進(jìn)行取樣及組分測(cè)定分析。氣體取樣間隔為3～7天，由氣相色譜配套使用的樣品鎖定型微量進(jìn)樣針（Hamilton 81056型，100 μL）直接扎取取樣，單次取樣量50 μL。CH4、CO2的氣體組分分析采用即取即測(cè)方式，所采用儀器為毛細(xì)管分流-氫火焰離子化檢測(cè)器/熱導(dǎo)檢測(cè)器并聯(lián)氣相色譜儀（GC-FID/TCD，Trace GC Ultra型，Thermo）。色 譜 柱 為HP-PLOT/Q（30m×0.32 mm×20 μm），載氣He（99.999%）。儀器參數(shù)為：進(jìn)樣口溫度200 ℃，分流比10:1，柱流速3 mL/min，柱箱溫度140 ℃（維持4min）。FID溫度280 ℃，氫氣、空氣、尾吹氣流速分別為40、450、40mL/min。氣體測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～5.0%，方法檢出限為0.0003～0.046 mol/mol。依據(jù)檢測(cè)得到的氣體百分比例（mol%）、體系壓力值、溫度值、血清瓶頂空體積等參數(shù)代入理想氣體狀態(tài)方程，計(jì)算得出CH4、CO2的氣體含量（μmol）。

1.3.2 甲烷好氧氧化速率計(jì)算

甲烷好氧氧化化學(xué)反應(yīng)方程式：

甲烷好氧氧化速率（methane oxidation rate，MOR）計(jì)算公式為：

其中，t為本次取樣與前一次取樣的時(shí)間間隔（d），i為本次取樣時(shí)刻對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)天數(shù)，[CH4]i為第i天的頂空CH4含量（μmol），[CH4]i-t為前一次取樣獲得的CH4含量，dw為實(shí)驗(yàn)體系中的沉積物干重（g）。以上所采用的MOR計(jì)算方法與Wegener 和Boetius[19]類似。經(jīng)樣品烘干稱重，計(jì)算獲得沉積物含水率為17.5%。

表1 甲烷好氧氧化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Experimental design for aerobic methane oxidation

1.4 微生物群落分析

1.4.1 沉積物總DNA抽提

對(duì)初始樣品及不同實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)后樣品的甲烷好氧氧化菌開(kāi)展高通量測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量（qPCR），對(duì)比微生物群落組成變化及生長(zhǎng)繁殖情況。首先，分別對(duì)初始樣品及實(shí)驗(yàn)開(kāi)展后的沉積物樣品進(jìn)行取樣，取樣量為3～5 g。其中實(shí)驗(yàn)開(kāi)展后的沉積物樣品由沉積物-培養(yǎng)液的混合泥漿離心獲得（9000 r·min?1，10min）。沉積物樣品保存在?20 ℃待測(cè)。

沉積物總DNA抽提采用E.Z.N.A@Soil DNA提取試劑盒（Omega Biotech，美國(guó)），抽提步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。總DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用Nano Drop 2000（Thermo）對(duì)DNA純度及濃度進(jìn)行檢測(cè)，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 微生物高通量測(cè)序

利用ABI GeneAmp ? 9700型PCR擴(kuò)增儀對(duì)甲烷好氧氧化菌pmoA功能基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體 系 為20 μL，包 括5×FastPfu Bulfer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，上游和下游引物（5 μM）各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，Bovine Serum Albumin Solution（BSA）0.2 μL，模板 DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。甲烷氧化菌pmoA功能基因采用引物為189F和mb661[20]。甲烷氧化菌16S rRNA擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃變性3 min，40個(gè)循環(huán)：95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，最后72 ℃延伸 10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收（AXYGEN公司，美國(guó)），Tris-HCl洗脫，隨后采用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用Illumina-Miseq平臺(tái)（PE300）進(jìn)行高通量測(cè)序分析。使用Uparse軟件，在97%的相似水平下對(duì)甲烷氧化菌pmoA基因序列進(jìn)行OTU聚類，選取OTU中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs代表性核酸序列，將這些核酸序列轉(zhuǎn)化為蛋白序列后，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋，統(tǒng)計(jì)各樣本在屬分類水平上甲烷好氧氧化菌群落組成及相對(duì)豐度等信息。本研究所測(cè)定的甲烷好氧氧化菌pmoA基因序列的登錄號(hào)為SRP189409。

1.4.3 微生物qPCR定量

甲烷好氧氧化菌pmoA基因拷貝數(shù)由實(shí)時(shí)熒光定量qPCR測(cè)試技術(shù)獲得（Real-time PCR，博日9600plus型熒光定量PCR儀），pmoA基因qPCR所用引物與PCR擴(kuò)增引物相同。采用MG96+ PCR儀進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，將qPCR產(chǎn)物進(jìn)一步純化后與質(zhì)粒載體Pmd18-T連接，藍(lán)白斑篩選法選取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒。以10倍稀釋構(gòu)建好的各質(zhì)粒（90 μL稀釋液+10 μL質(zhì)粒），通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)分別選取標(biāo)準(zhǔn)品的10?2～10?7稀釋液用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以梯度稀釋的16S rRNA基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。定量PCR試劑為ChamQ SYBR color qPCR Master Mix（2X），反應(yīng)體系20 μL:2X ChamQ SYBR Color Qpcr Master Mix 10 μL，上游和下游引物（5 μM）各0.8 μL，模板DNA 2 μL。熒反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min，40個(gè)循環(huán)：95 ℃變性 5 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算pmoA基因拷貝數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 氣體氧化特征

2.1.1 氣體組分變化

實(shí)驗(yàn)測(cè)得的頂空CH4（μmol%）和CO2（μmol）的含量數(shù)據(jù)顯示，各平行實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)平行性良好，為方便對(duì)比，我們采用各平行實(shí)驗(yàn)組的平均值來(lái)呈現(xiàn)不同氧濃度下氣體含量的變化趨勢(shì)（圖1）。

其中，實(shí)驗(yàn)i（0%O2）頂空CH4含量變化較少，CH4含量減少量約為4.0 μmol%，且主要發(fā)生在實(shí)驗(yàn)前期，后期CH4含量幾乎未變化。另外3組實(shí)驗(yàn)中CH4含量變化則相對(duì)較為明顯，且顯示出相似的變化趨勢(shì)，大致可分為兩個(gè)階段（圖1）：初期快速變化階段，甲烷含量急劇減少，對(duì)應(yīng)了3個(gè)甲烷消耗過(guò)程的疊加，即CH4的快速溶解、沉積物吸附以及微生物好氧氧化作用；后期平穩(wěn)變化階段，甲烷減少幅度趨于平穩(wěn)，對(duì)應(yīng)了甲烷微生物好氧氧化過(guò)程。這一變化趨勢(shì)在CH4的含量變化速率數(shù)據(jù)中體現(xiàn)得更為直觀（表2），因此，初期快速變化階段甲烷的消耗速率不能代表甲烷氧化菌所產(chǎn)生的氧化速率，實(shí)驗(yàn)中甲烷好氧氧化速率由甲烷含量進(jìn)入后期平穩(wěn)變化階段獲得。

圖1 甲烷好氧氧化過(guò)程中CH4和CO2含量變化趨勢(shì)圖a.0%O2實(shí)驗(yàn)組和空白組，b.1%O2實(shí)驗(yàn)組，c.10%O2實(shí)驗(yàn)組，d.50%O2實(shí)驗(yàn)組。Fig.1 Tendency diagrams of content variations of CH4 (μmol%) and CO2 (μmol) from aerobic methane oxidationa.0%O2 treatment and the blank,b.1%O2 treatment,c.10%O2 treatment,d.50%O2 treatment.

表2 不同氧濃度實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的甲烷氧化速率Table 2 Methane reduction rate from each experiment at different oxygen concentrationsμmol/gdw/d

好氧氧化產(chǎn)物CO2含量的增長(zhǎng)趨勢(shì)與CH4百分含量降低趨勢(shì)相對(duì)應(yīng)（圖1），側(cè)面反映了各實(shí)驗(yàn)組甲烷的好氧氧化情況。首先，空白組（50%O2無(wú)CH4）中所測(cè)得CO2的最終產(chǎn)生量為240 μmol，來(lái)自于沉積物有機(jī)質(zhì)發(fā)生的完全氧化作用，實(shí)驗(yàn)組所測(cè)得的CO2均由有機(jī)質(zhì)氧化作用與甲烷好氧氧化作用疊加產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)組CO2含量結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)i（0%O2）的CO2增加量較少（29.1 μmol），甚至少于空白組，可見(jiàn)無(wú)氧環(huán)境下有機(jī)質(zhì)與甲烷的氧化作用微乎其微。其次為實(shí)驗(yàn)iv（50%O2），由于CH4未完全氧化，其CO2產(chǎn)生量也相對(duì)較少，僅為210 μmol。實(shí)驗(yàn)ii（1%O2）與實(shí)驗(yàn)iii（10%O2）CH4均完全氧化，其CO2產(chǎn)量相對(duì)最多。其中實(shí)驗(yàn)iii（10%O2）的CO2產(chǎn)生量最大（1518 μmol），略高于實(shí)驗(yàn)ii（1%O2）的CO2產(chǎn)生量（1246 μmol），可能是由于實(shí)驗(yàn)iii（10%O2）中氧氣含量相對(duì)充足，有機(jī)質(zhì)氧化作用產(chǎn)生的CO2量偏多。

2.1.2 甲烷氧化速率

由甲烷含量進(jìn)入平穩(wěn)變化階段的MOR計(jì)算結(jié)果顯示（表2，圖2），不同氧濃度下的平行實(shí)驗(yàn)組平行性良好。其中，實(shí)驗(yàn)i（0%O2）CH4含量的平穩(wěn)變化階段中，CH4含量幾乎未變化，MOR可視為零，即未發(fā)生微生物好氧氧化過(guò)程。實(shí)驗(yàn)ii（1%O2）兩組平行實(shí)驗(yàn)中MOR 在2.36～7.54 μmol/gdw/d范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)iii（10% O2）MOR為0.18～5.28 μmol/gdw/d，實(shí)驗(yàn)iv（50% O2）AeOM（CH4）為0.08～0.44 μmol/gdw/d。由此獲得實(shí)驗(yàn)ii（1%O2）兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組的平均MOR相對(duì)最高，分別為3.33和4.20 μmol/gdw/d，相對(duì)而言，實(shí)驗(yàn)iii（10%O2）的MOR較低（2.32和3.00 μmol/gdw/d），實(shí)驗(yàn)iv（50%O2）的MOR則相對(duì)最低，平均值分別為0.20和0.29 μmol/gdw/d。

圖2 不同氧濃度實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的甲烷好氧氧化速率Fig.2 Methane reduction rate from each experiment at different oxygen concentrations

各實(shí)驗(yàn)組的甲烷氧化情況從氧化結(jié)束時(shí)間上也有所體現(xiàn)。首先，在實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)i（0%O2）和實(shí)驗(yàn)iv（50%O2）中CH4均未完全消耗，而實(shí)驗(yàn)ii（1%O2）和實(shí)驗(yàn)iii（10%O2）中CH4已消耗殆盡。但是，與MOR結(jié)果相反，實(shí)驗(yàn)iii（10%O2）的CH4完全氧化結(jié)束時(shí)間最短（37 d），實(shí)驗(yàn)ii（1%O2）氧化結(jié)束時(shí)間為58 d。這是由于實(shí)驗(yàn)iii（10%O2）在初期快速變化階段的CH4減少量（61.5%和46.8%）明顯高于實(shí)驗(yàn)ii（1%O2）（17.0%和14.2%），使得實(shí)驗(yàn)iii（10%O2）在后期氧化階段實(shí)際發(fā)生氧化的CH4總量偏少，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)iii（10%O2）在氧化結(jié)束時(shí)間上快于實(shí)驗(yàn)ii（1%O2）。

2.2 微生物演化特征

2.2.1 甲烷氧化菌群落組成

尾氣處理單元加氫爐采用在線制氫工藝，在低負(fù)荷工況下，風(fēng)氣比7∶1，加氫爐燃燒穩(wěn)定，所產(chǎn)生的還原性氣體能夠?qū)⒖藙谒瓜到y(tǒng)帶來(lái)的硫蒸氣、SO2氣體轉(zhuǎn)化為H 2 S，急冷水p H值、急冷塔塔頂H 2體積分?jǐn)?shù)滿足工藝控制指標(biāo)要求，見(jiàn)圖5。

甲烷好氧氧化菌pmoA基因Illumina高通量測(cè)序共獲得了89693條高質(zhì)量序列，以97%相似度劃分得到共176個(gè)OTUs。α-多樣性分析結(jié)果顯示（表3），各樣品文庫(kù)的覆蓋率（Coverage）均高于99.99%，意味著該測(cè)序結(jié)果包含了大部分的甲烷氧化菌群落，能夠體現(xiàn)不同樣品中甲烷氧化菌群落的真實(shí)情況。其中，Chao1指數(shù)與OTU數(shù)量對(duì)應(yīng)相等，數(shù)據(jù)顯示，除了空白組（50% O2無(wú)CH4）對(duì)應(yīng)樣品中OTU數(shù)量略高于初始樣品外，其余實(shí)驗(yàn)組結(jié)束后OTU數(shù)量（＜10）均較實(shí)驗(yàn)前明顯減少，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)i—iv樣品中甲烷好氧氧化菌豐度相對(duì)較低。Shannon指數(shù)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)i與空白組樣品的Shannon指數(shù)（＞1）高于初始樣品（0.8），而實(shí)驗(yàn)ii—iv樣品的Shannon指數(shù)（＜1）卻較初始樣品變小，反映了實(shí)驗(yàn)ii—iv氧化結(jié)束后甲烷好氧氧化菌多樣性趨于降低的特征。

如圖3所示，將相對(duì)豐度高于1%的13個(gè)OTUs的代表序列進(jìn)行屬和種水平的物種注釋。本研究中所測(cè)得的甲烷氧化菌包括Methylocystis、Methylobacter和Methlocaldum3種類型，其中Methylocystis隸屬于II型甲烷氧化菌（α-Proteobacteria），Methylobacter和Methylocaldum屬于I型甲烷氧化菌（γ- Proteobacteria）。初始樣品pmoA序列中II型甲烷氧化菌Methlocystis（OTU93）的占比僅為1.9%，其余的則為非甲烷氧化菌（例如Rhodospirillaceae等）或其他在目前數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)法注釋的序列。甲烷好氧氧化發(fā)生后，實(shí)驗(yàn)i—iv中所有pmoA序列都一致隸屬于I型甲烷氧化菌Methylobacter屬，其中實(shí)驗(yàn)i（0%O2）中包含了Methylobacter luteus（OTU4、5）和Methylobacter whittenburyi（OTU6、7、8）兩個(gè)菌種類型，兩個(gè)類型的所占比例較為接近，分別為48.5%和51.0%。但在實(shí)驗(yàn)ii—iv中兩種類型的占比優(yōu)勢(shì)相差較大，其中實(shí)驗(yàn)ii（1%O2）中Methylobacter luteus則為優(yōu)勢(shì)菌種，所占比例為87.8%實(shí)驗(yàn)iii（10%O2）和實(shí)驗(yàn)iv（50%O2）中Methylobacter whittenburyi分別高達(dá)80.9%和99.1%。另外，空白組中除了包含Methylobacter之外，還包含Methlocaldum屬，與實(shí)驗(yàn)組相似的是，Methylobacter屬占比相對(duì)較高（80.1%），Methlocaldum屬含量?jī)H為2.3%。

表3 甲烷好氧氧化菌pmoA基因α-多樣性指數(shù)分析Table 3 Analysis of α-diversity index of pmoA gene of methanotrophs

圖3 不同氧濃度甲烷好氧氧化過(guò)程中甲烷氧化菌群落組成Fig.3 Methanotrophic community from aerobic methane oxidation at different oxygen concentrations

2.2.2 甲烷氧化菌豐度

qPCR測(cè)定結(jié)果顯示，每個(gè)樣品中pmoA基因拷貝數(shù)的3個(gè)測(cè)定結(jié)果平行性良好，取其平均值作為甲烷氧化菌總豐度進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，與初始樣品相比（4.2×104copies g?1），實(shí)驗(yàn)ii—iv中pmoA基因的豐度呈現(xiàn)出不同程度的增加態(tài)勢(shì)（圖4，表4）。其中，實(shí)驗(yàn)ii（1% O2）中甲烷氧化菌豐度最高，pmoA基因拷貝數(shù)為1.9×109copies g?1，其次是實(shí)驗(yàn)iii（10% O2），其pmoA基因拷貝數(shù)為2.3×108copies g?1，實(shí) 驗(yàn)iv（50% O2）中pmoA基 因 拷 貝 數(shù)（4.1×107copies g?1）較初始樣品增長(zhǎng)了,3個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，實(shí)驗(yàn)i（0% O2）與空白組（50% O2無(wú)CH4）中pmoA基因拷貝數(shù)相近，分別為3.2×105和1.7×105copies g?1，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后pmoA增長(zhǎng)程度十分微弱。

3 討論

首先，所有實(shí)驗(yàn)組i—iv中甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生了一致性的變化，即氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，樣品中甲烷氧化菌的多樣性明顯降低，表明不同反應(yīng)條件下均存在具有明顯優(yōu)勢(shì)的氧化菌菌群，并且優(yōu)勢(shì)菌群均由初始樣品的II型氧化菌（Methylocystis屬）轉(zhuǎn)變?yōu)镮型氧化菌（Methylobacter屬），意味著在本研究的甲烷好氧氧化過(guò)程中，II型甲烷氧化菌并不具有甲烷氧化活性，而是由I型甲烷氧化菌從初始休眠狀態(tài)的極低含量值迅速生長(zhǎng)繁殖成為優(yōu)勢(shì)氧化菌菌群，這一現(xiàn)象在前人對(duì)稻田土好氧-厭氧界面甲烷好氧氧化菌pmoA基因轉(zhuǎn)錄組研究中也有相似發(fā)現(xiàn)[21]，可能與低氧條件下I型甲烷氧化菌的發(fā)酵代謝密切相關(guān)[10,22]。

將氣體測(cè)定結(jié)果與微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析表明，甲烷氧化速率與甲烷氧化菌生長(zhǎng)繁殖情況對(duì)應(yīng)較好，從不同角度反映了各實(shí)驗(yàn)組的甲烷氧化情況（表4）。其中，實(shí)驗(yàn)i（0%O2）樣品與初始樣品相比，甲烷組分變化量和甲烷氧化菌pmoA基因豐度數(shù)據(jù)都顯示出較為微弱的變化，但甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)顯示，實(shí)驗(yàn)i（0%O2）中甲烷氧化菌的群落組成與其他實(shí)驗(yàn)組相似，均由初始樣品的II型氧化菌轉(zhuǎn)變?yōu)镮型氧化菌。在實(shí)驗(yàn)i（0%O2）初期，沉積物與無(wú)色培養(yǎng)液混合后上清液迅速變?yōu)榉凵瑤滋旌笾饾u恢復(fù)無(wú)色，這意味著沉積物樣品可能本身攜帶了微量氧，這些微量氧能夠?yàn)檠趸峁┒虝旱膹?fù)活時(shí)間，進(jìn)而使得實(shí)驗(yàn)結(jié)束后氧化菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。但是由于實(shí)驗(yàn)i后續(xù)近30 d的實(shí)驗(yàn)中頂空甲烷含量始終趨于穩(wěn)定，且氧化菌pmoA基因豐度（3.2×105copies/g soil）與空白對(duì)照組（1.7×105copies/g soil）相近，較初始樣品（4.2×104copies/g soil）來(lái)說(shuō)變化十分微弱，因此，我們推測(cè)在0%O2無(wú)氧體系中并未發(fā)生甲烷好氧氧化反應(yīng)。

圖4 不同氧濃度甲烷好氧氧化過(guò)程中的甲烷氧化菌豐度變化情況標(biāo)注數(shù)字為不同氧化實(shí)驗(yàn)后pmoA基因拷貝數(shù)的增加量。Fig.4 Abundances of methanotrophs from aerobic methane oxidation at different oxygen concentrationsThe marked number is the increased copies of pmoA gene after different oxidation experiments.

表4 不同實(shí)驗(yàn)組的甲烷氧化菌總豐度、各菌種的絕對(duì)豐度#和平均MOR＊Table 4 Abundances of methanotrophs,each species# and average MOR*

將1%O2、10%O2和50%O2實(shí)驗(yàn)體系中的MOR和甲烷氧化菌pmoA基因豐度數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)（表4），MOR隨氧濃度增加逐漸減弱，MOR（1%O2）與MOR（50%O2）相差近15倍。相應(yīng)地，甲烷氧化菌豐度亦與氧濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，3個(gè)氧濃度梯度下pmoA基因拷貝數(shù)均差一個(gè)數(shù)量級(jí)，綜合判定表明1%O2體系中甲烷好氧氧化作用最為強(qiáng)烈，其次為10%O2和50%O2體系。甲烷氧化菌群落組成結(jié)果表明，在屬分類水平上，1%O2、10%O2和50%O2體系氧化菌組成較為一致，均為Methylobacter屬，比例分別為99.9%、99.6%和99.9%。但在種分類水平上，3組實(shí)驗(yàn)的氧化菌組成差異較大。其中，1%O2體系甲烷氧化菌Methylobacter leteus（OTU4、5）比例（87.8%）明顯高于10%O2體系（18.7%），而1%O2體系Methylobacter whittenburyi（OTU6、7、8）比例（12.2%）則明顯低于10%O2體系（80.9%），而Methylobacter whittenburyi在50%O2體系下的占比可達(dá)99.1%。整體來(lái)看，Methylobacter leteus的占比隨氧濃度升高逐漸減少，而Methylobacter whittenburyi與之相反，其占比反而隨氧濃度升高而增加，顯然Methylobacter leteus的變化趨勢(shì)與MOR較為一致。不同菌種的絕對(duì)豐度（表4）對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，Methylobacter leteus比例雖與氧濃度呈正相關(guān)關(guān)系，但其絕對(duì)豐度隨氧濃度增加呈現(xiàn)出明顯降低趨勢(shì)，這是由于3個(gè)氧濃度體系中氧化菌總豐度不同所導(dǎo)致的。經(jīng)前人驗(yàn)證，在各樣本間進(jìn)行微生物數(shù)據(jù)對(duì)比分析時(shí)，尤其是微生物總豐度相差較大的情況下，需將測(cè)序與定量結(jié)果相結(jié)合，估算并采用各菌種的絕對(duì)豐度進(jìn)行分析[23-24]。由此看來(lái)，與Methylobacter leteus相同，Methylobacter whittenburyi的生長(zhǎng)繁殖情況與不同氧濃度下MOR的變化趨勢(shì)也是一致的。綜上所述，MOR和甲烷氧化菌的生長(zhǎng)繁殖情況將隨氧濃度增加呈現(xiàn)明顯降低趨勢(shì)，氧濃度越高，氧化菌生長(zhǎng)繁殖越慢，所產(chǎn)生的甲烷氧化作用愈為微弱。

從各實(shí)驗(yàn)體系中甲烷氧化菌群落組成特征分析發(fā)現(xiàn)，海洋生境中的甲烷好氧氧化作用對(duì)氧濃度的響應(yīng)特征可能具有某些特殊性。本實(shí)驗(yàn)中不同氧濃度體系下Methylobacter leteus是主要的優(yōu)勢(shì)菌群，甲烷氧化作用在不同氧濃度下的表現(xiàn)與Methylobacter leteus生理生態(tài)特征的關(guān)系最為緊密。前人曾報(bào)道低氧生境常見(jiàn)甲烷氧化菌之一Methylobacter leteus的最適氧濃度區(qū)間為5%～20%，其氧化活性將隨氧濃度的降低受到明顯的抑制[10]。然而，本次研究中Methylobacter leteus則表現(xiàn)不同，在1%O2微量氧條件下的菌落活性明顯優(yōu)于10%O2和50%O2富氧環(huán)境條件，而1%O2氧濃度體系與樣品取樣位置的原位氧濃度環(huán)境最為接近，這意味著來(lái)自海洋低氧生境的Methylobacter leteus在與原位生境接近的微量氧條件下發(fā)揮出相對(duì)較大的甲烷氧化活性。這可能是由于在海底低氧疊加高鹽、低溫、高壓等特殊海洋生境的長(zhǎng)期馴化下[25]，Methylobacter leteus可能表現(xiàn)出不同的生理生態(tài)特征，從而導(dǎo)致并未在其最適氧濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出最佳氧化活性。但需要注明的是，實(shí)驗(yàn)可能存在實(shí)施時(shí)間或?qū)嵤┝康某叨葐?wèn)題，如果在給定條件下實(shí)施更為長(zhǎng)期的氧化實(shí)驗(yàn)對(duì)甲烷氧化菌進(jìn)行馴化，那么實(shí)驗(yàn)給定條件可能將成為下一個(gè)所謂的“原始生境”。同時(shí)，在50%O2較高氧濃度條件下氧化作用較為微弱的原因還可能是充足的氧供給使得甲烷氧化過(guò)程的中間產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物（例如甲醇、甲醛等）濃度過(guò)高，以致具有“毒性”，從而抑制了甲烷氧化菌的生長(zhǎng)繁殖[17]。此外，前人曾提到氧濃度對(duì)MOR的影響是非常復(fù)雜的，可能受到營(yíng)養(yǎng)源濃度、甲烷濃度等其他環(huán)境因子的影響[12,26]，但本次實(shí)驗(yàn)中并未涉及這些變量，在對(duì)于海洋生境甲烷好氧氧化作用的進(jìn)一步研究中應(yīng)加強(qiáng)這方面的實(shí)驗(yàn)工作。

4 結(jié)論

（1）完全無(wú)氧條件（0%O2）中不能發(fā)生甲烷好氧氧化作用，甲烷氧化速率及甲烷氧化菌總豐度隨氧濃度升高而降低，當(dāng)氧濃度由1%升高至50%時(shí)，甲烷氧化速率減弱了約15倍，甲烷氧化菌總豐度降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。

（2）甲烷氧化菌優(yōu)勢(shì)菌種為I型氧化菌Methylobacter leteus和Methylobacter whittenburyi。氧濃度由1%升高至50%時(shí)，Methylobacter leteus的占比由87.8%降低為0.8%，Methylobacter whittenburyi則相反，從18.7%升至99.1%。但兩者的絕對(duì)數(shù)量均隨著氧濃度增加呈現(xiàn)出不同程度的降低態(tài)勢(shì)。

（3）本實(shí)驗(yàn)中甲烷好氧氧化作用的最適氧濃度條件為1%O2體系，該條件與采樣位置的原始生存環(huán)境最為接近，但與優(yōu)勢(shì)氧化菌Methylobacter屬的已知最適氧濃度（5%～20%）并不一致。原因可能是在海底低氧條件疊加低溫、高壓等特殊生境的長(zhǎng)期馴化下，甲烷氧化菌的最適氧濃度條件將發(fā)生變化，逐漸趨于其原始生存環(huán)境。