姚冬梅，張樹林，張達(dá)娟，張迎

(天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

目前，藍(lán)藻水華問題日趨突出，其暴發(fā)時(shí)不僅對水質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，且有些藍(lán)藻種類可產(chǎn)生一系列毒性較強(qiáng)的次級代謝產(chǎn)物，對水生動物及人類健康造成潛在或直接的危害。中國水華藍(lán)藻共有26種，其中微囊藻屬M(fèi)icrocystis和魚腥藻屬Anabaena十分常見[1]，隨著富營養(yǎng)化水平的加劇，淡水養(yǎng)殖水體水華優(yōu)勢種逐漸演變?yōu)槲⒛以鍖僖活?，且發(fā)生面積及頻率呈逐年上升趨勢。萬蕾等[2]研究表明，銅綠微囊藻是引起淡水水華的主要優(yōu)勢種。溫度、光照等物理因素通常被認(rèn)為是水華季節(jié)演替的原因，但水華的頻繁暴發(fā)主要還是歸因于水體中氮負(fù)荷的加劇所造成的水體富營養(yǎng)化[3]。

目前，關(guān)于有機(jī)氮對藻類生長影響的相關(guān)研究較少，且多是對尿素氮相關(guān)研究的報(bào)道。如黃文敏等[8]研究表明，銅綠微囊藻能有效吸收利用尿素作為氮源，且高濃度的尿素氮促進(jìn)其生長。但也有研究發(fā)現(xiàn)，有些藻類不能利用尿素氮生長，如Yamaguchi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，卵圓卡盾藻Chattonellaovata不能利用尿素形態(tài)的有機(jī)氮，推測其原因可能與該藻細(xì)胞內(nèi)缺少尿素酶有關(guān)。而氨基酸作為有機(jī)氮的主要存在形式，在水體氮循環(huán)中扮演著重要角色[10]，但其在淡水生態(tài)系統(tǒng)中的濃度分布有較大差異，如日本琵琶湖氨基酸濃度為4.0～7.2 μmol/L[11]，美國佐治亞洲Satilla河水為59.0 μmol/L[12]，而在以銅綠微囊藻為優(yōu)勢種的太湖中，氨基酸濃度在春季為40.9～60.4 μmol/L，秋季為75.38～93.96 μmol/L[13]。近年來，關(guān)于氨基酸方面的研究多為其在自然水體中的釋放機(jī)制，而通過人為控制其種類和濃度對銅綠微囊藻的研究鮮有報(bào)道，如吳軒浩等[4]研究了不同濃度下丙氨酸對銅綠微囊藻生長和產(chǎn)毒的影響，Dai等[14]研究了單一高濃度下6種氨基酸對銅綠微囊藻生長和產(chǎn)毒的影響。這些前期相關(guān)研究中，一方面缺乏對自然水體中氨基酸濃度范圍的合理選擇，另一方面缺乏其對銅綠微囊藻生長產(chǎn)生影響時(shí)，葉綠素a含量和相關(guān)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化情況。

本研究中，通過銅綠微囊藻的分子結(jié)構(gòu)和氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)極性進(jìn)行劃分[15-16]，選擇了天門冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)等6種不同種類的氨基酸，以自然水體中氨基酸濃度范圍為界，研究其作為培養(yǎng)基中的唯一添加氮源時(shí)，與無氮培養(yǎng)基(不添加氮源)為空白對照時(shí)對銅綠微囊藻生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，以期為控制自然水體中藍(lán)藻水華暴發(fā)的機(jī)制提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用藻種銅綠微囊藻(FACHB-905)購自中國科學(xué)院水生生物研究所。在BG11 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(30±1)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx ，光暗周期為12L∶12D。

試驗(yàn)所用藻種在接種之前需進(jìn)行預(yù)處理，在其生長至對數(shù)期時(shí)，取適量藻種離心濃縮，用無菌蒸餾水洗滌2～3次后接種于無氮培養(yǎng)基BG11中先饑餓培養(yǎng)3 d，使得藻細(xì)胞內(nèi)氮?dú)獗幌拇M。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將經(jīng)過饑餓培養(yǎng)后的銅綠微囊藻分別接種到以天門冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)、 丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)作為唯一添加氮源的培養(yǎng)基中，以無氮培養(yǎng)基作為空白對照，研究6種氨基酸分別在12、25、50、75、100 μmol/L 5個(gè)濃度(各氨基酸濃度以氮元素的質(zhì)量濃度為準(zhǔn))下對銅綠微囊藻生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。

各組培養(yǎng)基初始體積均為200 mL，初始接種藻密度約為2×106cells/mL，試驗(yàn)期間，每天搖動藻液，以防止藻細(xì)胞貼壁下沉。試驗(yàn)周期為16 d，每組設(shè)3個(gè)平行，每隔2 d測定藻細(xì)胞數(shù)量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等相關(guān)指標(biāo)，并對以上指標(biāo)進(jìn)行處理分析，以探明不同種類、不同濃度的氨基酸對銅綠微囊藻生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。

1.2.2 指標(biāo)測定與計(jì)算

1) 藻密度。取少量混合均勻的藻液，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板對藻細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù)兩次。若兩次相差超過 20%，則需進(jìn)行第 3 次計(jì)數(shù)。

2) 葉綠素?zé)晒鈪?shù)。利用浮游植物熒光儀(PHYTO-PAM) 測定銅綠微囊藻藻液中葉綠素a (Chl-a)含量、葉綠素?zé)晒饣A(chǔ)參數(shù)及光反應(yīng)中心PSⅡ光合電子的傳遞速率(electron transfer rate，ETR)，具體測定參見劉忠榮、游波等[10-12]的方法。根據(jù)檢測所得葉綠素?zé)晒饣A(chǔ)參數(shù)(F0、Fm)計(jì)算可得到光反應(yīng)中心 PSⅡ的最大量子產(chǎn)量(即最大光能轉(zhuǎn)化效率,Fv/Fm),其計(jì)算公式為

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm。

其中：F0為初始熒光值(minimal fluorescence)；Fm為最大熒光值(maximal fluorescence)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用 SPSS 20.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠微囊藻的生長變化

控制對照組和各試驗(yàn)組的初始接種藻細(xì)胞數(shù)量為2×106cells/mL。從圖1可見：在試驗(yàn)期間，對照組的藻細(xì)胞數(shù)量在第2～6 天時(shí)略有上升，但始終低于各氨基酸試驗(yàn)組，約為各氨基酸試驗(yàn)組最低濃度時(shí)平均藻細(xì)胞數(shù)量的2/3；各氨基酸試驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)量在不同濃度下存在顯著性差異(P<0.05)。

隨著氨基酸濃度的升高，各氨基酸試驗(yàn)組平均藻細(xì)胞數(shù)量發(fā)生明顯的變化，其中，谷氨酸試驗(yàn)組平均藻細(xì)胞數(shù)量呈先上升后下降的趨勢，在氨基酸濃度為75 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值3.78×106cells/mL；除谷氨酸試驗(yàn)組外，其他5種氨基酸試驗(yàn)組平均藻細(xì)胞數(shù)量均呈上升趨勢，在氨基酸濃度為100 μmol/L時(shí)均達(dá)到最高值(圖1)。

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，除谷氨酸試驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)量波動較明顯以外，其他5種氨基酸試驗(yàn)組藻細(xì)胞生長整體均呈先上升后下降趨勢，除丙氨酸試驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)量于第4天時(shí)出現(xiàn)最大值外，其他5種氨基酸試驗(yàn)組藻細(xì)胞數(shù)量最大值均出現(xiàn)在第8天(圖1)。

圖1 氨基酸對銅綠微囊藻生長的影響

2.2 氨基酸對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

從表1可見：各氨基酸試驗(yàn)組不同濃度下Chl-a含量均存在明顯差異，隨著氨基酸濃度的升高，各氨基酸試驗(yàn)組平均Chl-a含量總體上呈上升趨勢；天門冬氨酸濃度為100 μmol/L時(shí)，分別在第2、4、10、12、14、16天時(shí)達(dá)到最高值，絲氨酸濃度為100 μmol/L時(shí)各培養(yǎng)時(shí)間下均達(dá)到最高值，精氨酸濃度為100 μmol/L時(shí)，除第2天外，其余各時(shí)間點(diǎn)均達(dá)到最大值，谷氨酸濃度為100 μmol/L時(shí)，分別在第8、10、12、14天時(shí)達(dá)到最大值。

隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，對照組的Chl-a含量總體呈下降趨勢；除谷氨酸試驗(yàn)組波動較明顯以外，其他5種氨基酸試驗(yàn)組在不同濃度下的Chl-a含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，總體上均呈先上升后下降的趨勢，Chl-a含量最大值均出現(xiàn)在培養(yǎng)的第8天；各氨基酸試驗(yàn)組Chl-a含量變化情況總體上為天門冬氨酸試驗(yàn)組中的Chl-a含量最高，其次為絲氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸，其中，甘氨酸試驗(yàn)組的Chl-a含量最低，且高濃度(50、75、100 μmol/L)試驗(yàn)組中的Chl-a含量明顯高于低濃度(12、25 μmol/L)試驗(yàn)組(表1)。

表1 氨基酸對銅綠微囊藻Chl-a含量的影響

2.3 氨基酸對銅綠微囊藻Fv/Fm 的影響

從表2可見：各氨基酸試驗(yàn)組不同濃度下Fv/Fm值均存在明顯差異，隨著氨基酸濃度的升高，各氨基酸試驗(yàn)組Fv/Fm值總體上均呈上升趨勢；天門冬氨酸濃度為100 μmol/L時(shí)，在第8天達(dá)時(shí)到最高值，絲氨酸濃度為100 μmol/L時(shí)，分別在第10、12、14、16天時(shí)達(dá)到最高值，丙氨酸濃度為100 μmol/L時(shí)，分別在第6、8、10、12、16天時(shí)達(dá)到最高值。

表2 氨基酸對銅綠微囊藻Fv/Fm的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，對照組的Fv/Fm值總體上呈下降趨勢；除谷氨酸試驗(yàn)組波動較明顯以外，其他5種氨基酸試驗(yàn)組在不同濃度下的Fv/Fm值總體上均呈先上升后下降的趨勢，F(xiàn)v/Fm值最大值均出現(xiàn)在培養(yǎng)的第8天，各氨基酸試驗(yàn)組Fv/Fm值變化情況總體上為天門冬氨酸試驗(yàn)組中的Fv/Fm值最高，其次為絲氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸，其中，甘氨酸試驗(yàn)組的Fv/Fm值最低。

2.4 氨基酸對銅綠微囊藻ETR的影響

從表3可見：各氨基酸試驗(yàn)組不同濃度下ETR值均存在明顯差異，隨著氨基酸濃度的升高，各氨基酸試驗(yàn)組平均ETR值總體上呈上升趨勢；天門冬氨酸濃度為100 μmol/L時(shí)，分別在第2、8天時(shí)達(dá)到最高值，絲氨酸濃度為100 μmol/L時(shí)，除第16天外其余各時(shí)間點(diǎn)均達(dá)到最高值，丙氨酸濃度為100 μmol/L時(shí)，分別在2、4、6天時(shí)達(dá)到最高值，甘氨酸濃度為100 μmol/L時(shí)，分別在第4、10、12、14、16天時(shí)達(dá)到最高值。

表3 氨基酸對銅綠微囊藻ETR的影響

隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，對照組的ETR值總體上呈下降趨勢；除谷氨酸試驗(yàn)組波動較明顯以外，其他5種氨基酸試驗(yàn)組在不同濃度下的ETR隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長總體上均呈先上升后下降的趨勢，ETR最大值均出現(xiàn)在培養(yǎng)的第6～8 天，各氨基酸試驗(yàn)組ETR變化情況總體上為天門冬氨酸試驗(yàn)組中的ETR最高，其次為絲氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸，其中，甘氨酸試驗(yàn)組的ETR最低。

3 討論

3.1 氨基酸對銅綠微囊藻生長及葉綠素a含量的影響

氮濃度和氮的存在形態(tài)均會對銅綠微囊藻生長繁殖起到至關(guān)重要的作用，氨基酸作為小分子，能夠通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式被藻細(xì)胞吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高微囊藻對其的吸收效率，進(jìn)而影響微囊藻的生長繁殖[4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除谷氨酸試驗(yàn)組外，其他5種氨基酸試驗(yàn)組平均藻細(xì)胞數(shù)量隨著氨基酸濃度的升高均呈上升趨勢，且多種氨基酸在濃度為100 μmol/L時(shí)達(dá)到最高值，表明這5種氨基酸均能支持銅綠微囊藻的持續(xù)生長，而銅綠微囊藻細(xì)胞對氨基酸的利用程度依次為為天門冬氨酸> 絲氨酸>精氨酸>谷氨酸>丙氨酸>甘氨酸，這表明天門冬氨酸、絲氨酸對銅綠微囊藻的促生長效應(yīng)最高。Dai 等[14]研究表明，銅綠微囊藻在丙氨酸、亮氨酸和精氨酸作為單一氮源時(shí)生長良好，而在谷氨酸和天冬氨酸存在下銅綠微囊藻生長最快卻不能支持其持續(xù)生長，此結(jié)果與本研究結(jié)果有明顯差異，這是因?yàn)镈ai等僅監(jiān)測了銅綠微囊藻240 h的生長情況，而忽略了銅綠微囊藻的生長周期，同時(shí)，光照強(qiáng)度為400～650 lx和培養(yǎng)溫度為26 ℃均不是銅綠微囊藻適宜的生長條件，存在一定局限性，而本研究中以銅綠微囊藻的生長曲線和最適生長條件為基礎(chǔ)，能突出氨基酸對銅綠微囊藻生長的周期變化。而本研究中谷氨酸培養(yǎng)基中藻細(xì)胞數(shù)量在試驗(yàn)前期持續(xù)降低，并于第8天時(shí)藻密度突然開始增高的現(xiàn)象仍需進(jìn)一步研究。

銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)的Chl-a主要位于光合系統(tǒng)Ⅱ(SPⅡ)的核心復(fù)合體上，能吸收能量傳遞到反應(yīng)中心進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)[17]，當(dāng)藻細(xì)胞受到環(huán)境脅迫時(shí)，會直接或間接地影響到Chl-a含量，因而Chl-a含量變化可以作為藻類受到脅迫的生理反應(yīng)指標(biāo)[18]。本研究中，對照組Chl-a含量總體上呈下降趨勢，一方面與藻細(xì)胞數(shù)量的變化有關(guān)，另一方面是藻類處于無氮狀態(tài)受到環(huán)境脅迫所致。甘小蓉等[19]在研究化學(xué)物質(zhì)對銅綠微囊藻生長和葉綠素?zé)晒鈪?shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Chl-a含量的變化符合藻細(xì)胞數(shù)量的變化特征，而本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，Chl-a含量變化和藻細(xì)胞數(shù)量變化特征相符合，這表明添加不同濃度、不同種類的氨基酸對藻細(xì)胞數(shù)量造成影響時(shí)，Chl-a含量也會隨之變化。華汝成[20]和張亞麗等[21]關(guān)于無機(jī)氮的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度氮對Chl-a有抑制作用，高濃度氮對Chl-a有促進(jìn)作用，在一定濃度范圍內(nèi)Chl-a含量隨著氮濃度的增大而升高，與本研究中低濃度氮對Chl-a仍有促進(jìn)作用的結(jié)果不同，由于葉綠素a含量還會受光合營養(yǎng)條件的影響[22]，因此，這可能是無機(jī)氮和有機(jī)氮參與葉綠素合成機(jī)制的不同所導(dǎo)致的。相關(guān)研究中，應(yīng)當(dāng)模擬自然水體藍(lán)藻暴發(fā)期夏季涉及的所有溫度、光照強(qiáng)度等條件，通過響應(yīng)面分析氨基酸在多種條件下對銅綠微囊藻Chl-a的作用機(jī)制，從而進(jìn)一步了解藍(lán)藻暴發(fā)期的藻細(xì)胞生長和Chl-a的變化特征。

3.2 氨基酸對銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm通常用來判斷植物是否受到條件抑制，它反映了光反應(yīng)中心 PSⅡ的最大量子產(chǎn)量(即最大光能轉(zhuǎn)化效率)，該值下降則表明植物受到了環(huán)境脅迫[21]。本研究中，對照組的Fv/Fm值整體呈下降趨勢，與對照組處于無氮狀態(tài)受到環(huán)境脅迫的表現(xiàn)相對應(yīng)，表明無氮脅迫下銅綠微囊藻PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率下降，PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額降低，會進(jìn)一步導(dǎo)致ETR值的下降，這是缺乏氮源時(shí)葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm值的正常變化[23]。本研究中，隨著氨基酸濃度的升高，各氨基酸試驗(yàn)組平均Fv/Fm值均呈上升趨勢，這是由于氮元素是蛋白質(zhì)、葉綠素與光合作用有關(guān)的酶的必要組成成分，隨著氮濃度的升高，PSⅡ需求的光能大于吸收的光能，其活性反應(yīng)中心活躍，光能轉(zhuǎn)化效率提高，從而導(dǎo)致Fv/Fm值升高[24-25]。Fv/Fm值的總體變化趨勢與Chl-a含量的變化相似，Chl-a和Fv/Fm均反映了光合速率變化的特征，以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)對轉(zhuǎn)能效率的影響[26]。

ETR表示光反應(yīng)中心 PSⅡ光合電子的傳遞速率[27]，其傳遞效率的狀態(tài)可反映光合作用的動態(tài)變化及各種外界因素對藻類的微妙影響[28-29]，如王昭玉[30]利用葉綠素?zé)晒鈪?shù)ETR對氮指標(biāo)的響應(yīng)判斷山東青島近海氮的反應(yīng)情況。本研究中，對照組的ETR值總體呈下降趨勢，與各葉綠素?zé)晒鈪?shù)表現(xiàn)的結(jié)果一致，是光合作用各反應(yīng)受到抑制的表現(xiàn)，與其受到環(huán)境脅迫的影響密不可分[27]。

本研究中，隨著氨基酸濃度的升高，各氨基酸試驗(yàn)組平均ETR值大致呈上升趨勢。ETR值的顯著升高與氮濃度的升高密不可分，是活性反應(yīng)中心活躍、電子傳遞效率提高的正?，F(xiàn)象[24-25]。ETR值的整體變化趨勢與相關(guān)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的表現(xiàn)相似，是光合作用中光能吸收、光化學(xué)反應(yīng)、電子傳遞共同表現(xiàn)的結(jié)果，反映了葉綠素?zé)晒鈪?shù)的重要作用[27]，與其他氨基酸相比，不同濃度的谷氨酸對銅綠微囊藻生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響有較大差異，表明銅綠微囊藻生長過程中對不同濃度谷氨酸氮吸收是不穩(wěn)定的。

4 結(jié)論

1) 在所設(shè)置氨基酸濃度(12、25、50、75、100 μmol/L) 范圍內(nèi)，各氨基酸試驗(yàn)組在不同濃度下藻細(xì)胞數(shù)量、Chl-a含量、Fv/Fm及ETR值均存在明顯差異，其反映的結(jié)果基本符合銅綠微囊藻生長過程中的延滯期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的規(guī)律。

2) 從4種測定指標(biāo)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無氮對照組數(shù)值顯著低于各氨基酸試驗(yàn)組，一定程度上反映了環(huán)境脅迫下藻細(xì)胞數(shù)量及相關(guān)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的下降是銅綠微囊藻在逆境條件下的正常反應(yīng)。

3) 隨著氨基酸濃度的升高，天門冬氨酸、絲氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸及甘氨酸均能逐漸促進(jìn)銅綠微囊藻的生長及相關(guān)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的提高，且葉綠素?zé)晒鈪?shù)與藻細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系。

4) 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，銅綠微囊藻在天門冬氨酸、絲氨酸試驗(yàn)組中生長狀況最好，在甘氨酸試驗(yàn)組生長狀況較差，相關(guān)葉綠素?zé)晒鈪?shù)也隨之產(chǎn)生相應(yīng)的變化，這充分反映出氮對銅綠微囊藻的分裂增殖及其正常代謝過程的控制作用，以及Fv/Fm等葉綠素?zé)晒鈪?shù)作為銅綠微囊藻氮監(jiān)測的響應(yīng)指示作用。

5) 本研究中設(shè)定的氨基酸濃度，覆蓋了自然水體中已知的氨基酸含量范圍，較好地模擬了自然水體中銅綠微囊藻的生長、葉綠素a含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的動態(tài)變化，研究結(jié)果可為控制自然水體中藍(lán)藻水華暴發(fā)的機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。