陳愛(ài)華，佟立君，馮磊*,宋金柱

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157010；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150081；3.哈爾濱市丹青河實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，哈爾濱 154800)

龍牙楤木(Araliaelata(Miq.)Seem.)，是中國(guó)傳統(tǒng)的食藥兼用植物，多年生落葉小喬木或灌木，又名刺嫩芽、遼東楤木、刺老鴉等，屬于五加科(Araliaceae)楤木屬(AraliaLinn.)[1]。龍牙楤木嫩莖葉鮮嫩清香可食，含有多種氨基酸和人體必需的微量元素[2]；其根皮制藥可用于治療神經(jīng)衰弱、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、肝炎和慢性胃炎等疾病[3]，多年來(lái)深受?chē)?guó)內(nèi)和東南亞國(guó)家消費(fèi)者的青睞。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)刺嫩芽在藥用成分的提取、藥理作用和經(jīng)濟(jì)林營(yíng)建幾個(gè)方面，已經(jīng)取得了很多的成果[5-6]。在組織培養(yǎng)方面，2011年由香玲等經(jīng)過(guò)分化產(chǎn)生體細(xì)胞胚，繼而萌發(fā)成體胚苗[7]，《龍牙楤木組織培養(yǎng)和快速繁殖的研究》[8]指出不同取材、培養(yǎng)方法及培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率、增值率及再生率有顯著影響。但是從前人的研究中[9]，不難看出，普遍添加的外源激素種類(lèi)較多，步驟稍顯復(fù)雜，不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。因而，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并優(yōu)化龍牙楤木組培的新方案，力求簡(jiǎn)單快速，以克服龍牙楤木細(xì)胞工程育種技術(shù)的不足，為龍牙楤木苗木產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料前處理。龍牙楤木萌動(dòng)枝條采自黑龍江省林副特產(chǎn)研究所的10株優(yōu)樹(shù)，采集時(shí)間為2015年的3月上旬(10日)，室溫水培3 d，每株樹(shù)采3～5個(gè)頂芽，切下葉片、葉柄分類(lèi)放入兩瓶滅菌水中浸泡2 h。

1.1.2 外植體。取龍牙楤木幼嫩的葉片、葉柄用75 %酒精消毒30 s，沖洗一次后放入1 %次氯酸鈉溶液消毒10 min，無(wú)菌水沖洗3 次，在超凈臺(tái)內(nèi)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中；葉片切去邊緣胚，葉片表面輕劃3刀，水平接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；葉柄同樣方法。每瓶中接種4至5個(gè)外植體，一種外植體一個(gè)激素濃度是一個(gè)處理，每種處理接種5瓶，重復(fù)3 次，24±1 ℃下暗培養(yǎng)。在胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段的激素濃度篩選按株系等比混合隨機(jī)選取。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，激素類(lèi)采用的是2,4-D，濃度為0～3.0 mg/L五個(gè)濃度梯度，生長(zhǎng)素濃度與材料種類(lèi)之間采用的是正交組合設(shè)計(jì)。整個(gè)培養(yǎng)基要加入蔗糖20 g/L，凝膠強(qiáng)度為1200 g/m3的瓊脂5.5 g/L，pH值調(diào)至5.8。

1.2.2 愈傷組織保持與增殖培養(yǎng)基。胚性愈傷組織保持與增殖培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，2,4-D濃度為1.0 mg/L。整個(gè)培養(yǎng)基要加入蔗糖20 g/L，凝膠強(qiáng)度為1200 g/m3的瓊脂5.5 g/L，pH值用NaOH或HCL調(diào)至5.8。繼代轉(zhuǎn)接時(shí)，挑取最新分化的胚性愈傷組織，平鋪開(kāi)(直徑為0.6 cm左右)，每瓶放入5份。15 d 左右繼代一次，24±1 ℃下暗培養(yǎng)。

1.2.3 成熟體細(xì)胞胚的培養(yǎng)。將胚性愈傷組織在添加IBA濃度為0～3.0 mg/L，蔗糖20 g/L，瓊脂5.5 g/L的1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到成熟體細(xì)胞胚。在胚性愈傷組織誘導(dǎo)至體細(xì)胞胚成熟等各個(gè)階段，在超凈臺(tái)中用電子天平稱(chēng)胚性愈傷組織重量。

1.2.4 再生植株的誘導(dǎo)。當(dāng)體細(xì)胞胚，整個(gè)胚由淺白色變?yōu)闇\黃色時(shí)，轉(zhuǎn)入體細(xì)胞萌發(fā)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)植株再生。體細(xì)胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，IBA濃度為0.5～3.0 mg/L，附加蔗糖20 g/L ，瓊脂5.5 g/L，pH調(diào)至5.8。

1.2.5 再生植株生根。將再生植株轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)生根，培養(yǎng)基中附加蔗糖20 g/L，瓊脂5.5 g/L，pH調(diào)至5.8。繼代培養(yǎng)。

1.2.6 組培苗移栽。(1)將生根后的培養(yǎng)瓶中的龍牙楤木再生植株，開(kāi)瓶煉苗可以分階段進(jìn)行，即首先松蓋(或塞)1～2 d，然后部分開(kāi)蓋1～2 d，最后完全揭去蓋。在自然光下進(jìn)行開(kāi)瓶練苗，注意預(yù)防幼苗被灼傷。(2)取相同體積的腐殖土、草炭土或蛭石鋪在多穴插秧盤(pán)中，用稀釋10倍的MS培養(yǎng)液澆透。將組培苗用鑷子夾出，自來(lái)水沖洗干凈，避免傷根，栽植于穴盤(pán)中，1株/穴。將植入組培苗的插秧盤(pán)放入濕度為70%～90%，遮陽(yáng)網(wǎng)覆蓋的大棚里，遮陽(yáng)率在40%～60%，兩側(cè)自然通弱風(fēng)，兩周后，隨機(jī)選擇100株左右，統(tǒng)計(jì)成活率和平均苗高，移栽到苗圃中。

2 結(jié)果

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

試驗(yàn)中采用的龍牙楤木外植體葉片和葉柄，都是水培后新發(fā)的幼嫩組織，在誘導(dǎo)第10 d隨機(jī)抽取5瓶，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，從下表1可以看出，在添加不同濃度梯度2,4-D的培養(yǎng)基中，都可以獲得愈傷組織，但是效率不同，整體上來(lái)說(shuō)，葉柄作為外植體誘導(dǎo)效率高且快速，當(dāng)2,4-D濃度為1.0 mg/L，出愈率達(dá)到了100%，這說(shuō)明龍牙楤木葉柄具有很好的再分化能力。葉片作為外植體，在2,4-D濃度為2.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)效率達(dá)到最高，為96%。從這些結(jié)果中可見(jiàn)，龍牙楤木的再分化能力較其他物種更強(qiáng)。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)情況

2.2 愈傷組織保持與增殖培養(yǎng)基

從愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果表2中，我們看到，葉柄愈傷組織具有更好的再分化能力，因此我們選用葉柄的愈傷組織，繼續(xù)在含有2,4-D濃度為1.0 mg/L的1/2MS培養(yǎng)基中增值培養(yǎng)，15 d時(shí)隨機(jī)挑選5瓶統(tǒng)計(jì)，用天平稱(chēng)重，我們看到平均增殖重量達(dá)到了1.2666 g，平均增殖達(dá)到了4.583倍。

表2 愈傷組織增殖情況

2.3 成熟體細(xì)胞胚的培養(yǎng)和不定芽的誘導(dǎo)

將增殖的愈傷組織放于含有IBA的培養(yǎng)基培養(yǎng)上1周后，愈傷組織顏色由白變黃，鏡下觀(guān)察可見(jiàn)心形胚、魚(yú)雷形胚和球形胚，標(biāo)志著胚性愈傷組織的成熟，這與前人研究的結(jié)果相似。成熟的胚繼續(xù)培養(yǎng)1周，開(kāi)始生出不定芽。表3，是在含有IBA的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果，我們看到在添加IBA3.0 mg/L的培養(yǎng)基中成熟的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)出最多的不定芽，誘導(dǎo)率達(dá)到80%以上。用SPSS 16.0在0.05水平上進(jìn)一步分析結(jié)果差異的顯著性，見(jiàn)表4，我們看到不同IBA的濃度對(duì)不定芽的誘導(dǎo)率具有顯著的影響，不同濃度之間也具有顯著差異，而其中IBA 3.0 mg/L的效果最好。

表4 IBA濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)率影響的方差分析

而在不定發(fā)生時(shí)間上，SPSS統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表3、表5)分析顯示，總體上來(lái)說(shuō)IBA的濃度對(duì)不定的發(fā)生時(shí)間的影響并不顯著，但有趣的是，當(dāng)IBA濃度為1.0 mg/L時(shí)，與IBA濃度為3.0 mg/L時(shí)對(duì)不定芽發(fā)生的影響之間的差異時(shí)顯著的，也就是說(shuō)IBA濃度為3.0 mg/L誘導(dǎo)不定芽發(fā)生更快速，而IBA濃度為1.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)不定芽較慢。

表5 不同濃度IBA對(duì)不定芽發(fā)生時(shí)間的影響的顯著性分析

2.4 組培苗移栽基質(zhì)的優(yōu)化選擇

不定芽在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)5 d左右生根，當(dāng)根長(zhǎng)為2 cm左右即可移栽到滅菌基質(zhì)，將組培苗移栽到不同培養(yǎng)基上，當(dāng)長(zhǎng)出第一片新葉認(rèn)為已經(jīng)成活，一般需要一周左右，之后統(tǒng)計(jì)成活率。從下表6和表7顯著性分析表明，不同的基質(zhì)類(lèi)型對(duì)組培苗成活率的影響是極顯著的，而當(dāng)基質(zhì)為V腐殖土∶V蛭石=2∶3時(shí)，成活率最高達(dá)到97%。但是移栽入基質(zhì)的組培苗在最初時(shí)生長(zhǎng)速度很慢，但在移栽到室外大田時(shí)則生長(zhǎng)迅速。

表6 不同基質(zhì)對(duì)成活率及苗高的影響

表7 不同類(lèi)型基質(zhì)對(duì)植株生活率的影響顯著性分析

續(xù)表7

A為葉柄胚性愈傷組織的誘導(dǎo)；B為葉片胚性愈傷組織的誘導(dǎo)；C為龍牙楤木胚性愈傷組織的增殖和成熟；D 體胚誘導(dǎo)出不定芽；E再生植株生根。F為龍牙楤木組培苗移栽入基質(zhì)。

3 結(jié)論

植物組織培養(yǎng)，也叫離體培養(yǎng)，利用的是德國(guó)著名植物學(xué)家Gcrtlieb Haberland 1902年提出的“細(xì)胞全能性”的理念,1958年，由Reinnert和Steward加以驗(yàn)證。目前有許多組織培養(yǎng)的苗木品種進(jìn)入市場(chǎng)，比如說(shuō)馬鈴薯和鐵皮石斛、草莓、葡萄、枸杞等等。組織培養(yǎng)的主要影響因素是外植體類(lèi)型和外源激素的使用。外植體的選用，一般要選去分化和再分化能力強(qiáng)的幼嫩材料，同時(shí)容易進(jìn)行脫毒處理，一些植物材料，比如蛇足石衫但由于其有很多種的共生菌而很難進(jìn)行組織培養(yǎng)。外源激素種類(lèi)的添加直接影響再分化進(jìn)程。組織培養(yǎng)是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，通常認(rèn)為劃分為幾個(gè)階段(圖1)，實(shí)驗(yàn)選取了幼嫩的葉片和葉柄來(lái)進(jìn)行，外源激素的選擇也為常見(jiàn)的2,4-D和IBA，既經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便又高效，最終確定了最優(yōu)的技術(shù)方案為：以葉柄為外植體，在添加2,4-D 1.0 mg/L的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織，在含有IBA 3.0 mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織成熟和不定芽的產(chǎn)生，在不添加任何外源激素的1/2MS培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，生根率達(dá)100%，然后經(jīng)過(guò)半開(kāi)瓶和全開(kāi)瓶煉苗共計(jì)5 d左右，室外移栽，在V腐殖土∶V蛭石=2∶3時(shí)生活率高達(dá)97%。