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基于還原態(tài)DES熒光特性測定槐米中槲皮素含量*

2021-06-21 03:52:06李祥昀侯夢園李培培劉艷菊
中醫(yī)學(xué)報(bào) 2021年6期
關(guān)鍵詞:槐米項(xiàng)下槲皮素

李祥昀,侯夢園,李培培,劉艷菊

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,河南 鄭州450008;2.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州450046

槐米又名白槐、槐花,是豆科植物槐的干燥花蕾?!渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品,其藥性苦,微寒,歸肝、大腸經(jīng),具有涼血止血、清肝瀉火等功效?;泵字兄饕钚猿煞譃辄S酮類物質(zhì),如蘆丁、槲皮素等。槲皮素作為黃酮醇類代表性化合物,具有很高的藥用價(jià)值,能夠抗癌[1-3]、抗炎[4-5]、抗病毒[6]、保護(hù)心腦血管[7]、抗氧化[8]和抑制黑色素生成[9]。因此,快速、準(zhǔn)確測定槐米中槲皮素的含量具有重要意義。文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素含量測定的方法主要有高效液相色譜法[10-13]、化學(xué)修飾電極法[14]、薄層掃描色譜法[15]、高效毛細(xì)管電泳法[16]等。熒光分光光度法因具有簡便、快速、專屬性好等特點(diǎn)得到了眾多學(xué)者的關(guān)注。目前,基于還原態(tài)DES(4,4′-二疊氮二苯乙烯-2,2′-二磺酸二鈉四水合物)的熒光特性,利用熒光分光光度法測定槐米中槲皮素含量的研究未見報(bào)道。

前期研究發(fā)現(xiàn)DES自身沒有熒光,但其還原產(chǎn)物具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射?;泵字械幕钚猿煞珠纹に鼐哂休^強(qiáng)的抗氧化能力,可以還原DES,生成還原態(tài)DES,發(fā)出較強(qiáng)的熒光。本研究通過改變?nèi)芤旱膒H值、槲皮素濃度及槲皮素與DES反應(yīng)的時(shí)間等條件,對(duì)該方法的檢測性能進(jìn)行分析,建立一種簡單、準(zhǔn)確、快速定量檢測槲皮素的熒光分光光度法,可用于槐米中槲皮素含量的檢測,為槐米的綜合開發(fā)及臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

FLS 1000熒光分光光度計(jì)(Edinburgh公司,英國),超純水儀(默克化工技術(shù)有限公司,上海)。

槐米購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥房(產(chǎn)地:安徽亳州,批號(hào):190601),經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院謝小龍博士鑒定為豆科植物槐的干燥花蕾。槲皮素對(duì)照品(批號(hào):150803),購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。DES(4,4′-二疊氮二苯乙烯-2,2′-二磺酸二鈉四水合物),購自阿拉丁試劑有限公司。三(羥甲基)氨基甲烷(Tris),購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取槲皮素對(duì)照品適量,用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液溶解,得到4 mmol·L-1的槲皮素對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備取槐米粉末4 g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇100 mL。水浴加熱至87℃,保持微沸回流120 min后趁熱過濾,然后用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇定容至100 mL,即得[17-19]。

2.3 檢測方法取4 mmol·L-1槲皮素對(duì)照品溶液20μL和DES(15 mmol·L-1)溶液50μL,室溫反應(yīng)5 min后,加入530μL Tris-HCl(0.1 mol·L-1,pH=6)緩沖溶液,在激發(fā)波長(Ex)為383 nm,狹縫寬度2 nm的條件下,測試溶液的熒光發(fā)射光譜。

2.4 可行性分析以Tris-HCl(0.1 mol·L-1,pH=6)溶液為參比溶液,試驗(yàn)組溶液為:①槲皮素(20μL,1 mmol·L-1)+DES(50μL,15 mmol·L-1)+Tris-HCl(530μL,0.1 mol·L-1,pH=6);②槲皮素(20μL,1 mmol·L-1)+Tris-HCl(580μL,0.1 mol·L-1,pH=6);③DES(50μL,15 mmol·L-1)+Tris-HCl(550μL,0.1 mol·L-1,pH=6)。使用2.3項(xiàng)下的方法,測試上述3種混合溶液的熒光發(fā)射光譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示,槲皮素、DES溶液均未有明顯的熒光發(fā)射,而槲皮素和DES的混合溶液具有較強(qiáng)的熒光信號(hào),產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是DES的共軛結(jié)構(gòu)兩端吸電子性的疊氮基被還原為給電子性的氨基,氨基的給電子能力提高了分子的最高占有軌道能級(jí),能級(jí)間隙減小,使得溶液在紫外光照射下發(fā)出強(qiáng)烈的熒光[20]。因此基于槲皮素的抗氧化性與DES還原產(chǎn)物的熒光特性所建立的槲皮素含量測定方法是可行的。

圖1 可行性實(shí)驗(yàn)的熒光光譜圖

2.5 條件優(yōu)化

2.5.1 pH值優(yōu)化槲皮素結(jié)構(gòu)受pH值影響較大,在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變[21]。在pH為4、5、6、7、8、9的條件下,分別測定反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度。如圖2-A所示,pH值從4至6時(shí)溶液熒光強(qiáng)度逐漸增大,在pH=6時(shí)溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度達(dá)到最大,當(dāng)pH值超過6時(shí)熒光強(qiáng)度逐漸減弱。因此選擇pH=6的緩沖溶液進(jìn)行熒光測定。

2.5.2 時(shí)間優(yōu)化測試槲皮素和DES在反應(yīng)時(shí)間為5 min,10 min,15 min,20 min,25 min,30 min時(shí)溶液的熒光強(qiáng)度。如圖2-B所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明混合溶液熒光強(qiáng)度在5~30 min內(nèi)幾乎不隨反應(yīng)時(shí)間而變化。選擇槲皮素與DES反應(yīng)5 min后測試溶液的熒光光譜。

3 槐米中槲皮素的含量測定

3.1 線性關(guān)系考察精密稱取槲皮素對(duì)照品適量,用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解,配制0.25 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.75 mmol·L-1、1.00 mmol·L-1、2.00 mmol·L-1、4.00 mmol·L-1的槲皮素對(duì)照品溶液。根據(jù)2.3項(xiàng)下方法測試熒光光譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,槲皮素濃度為0.25~4.00 mmol·L-1的范圍內(nèi),溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度與槲皮素濃度的對(duì)數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系,線性方程為Y=104 119.79 X+84 927.823(X代表槲皮素濃度的對(duì)數(shù)值,Y代表DES還原產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度),R2=0.999 6。見圖3。

圖2 槲皮素測試條件優(yōu)化的熒光光譜圖

圖3 不同槲皮素溶液濃度對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度

3.2 共存物質(zhì)的影響常見的金屬陽離子、銨根離子以及Glc(葡萄糖)可能會(huì)影響槲皮素檢測的準(zhǔn)確性[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在槲皮素濃度為1.00 mmol·L-1條件下,50倍濃度的K+、Ca+、Zn2+、Mg2+、NH4+以及Glc對(duì)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度沒有明顯影響,表明該方法的選擇性良好。見圖4。

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取5份槐米樣品,根據(jù)2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按照2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行熒光檢測。根據(jù)對(duì)照品線性回歸方程,得到樣品中槲皮素含量的平均值為0.1325 mg·g-1,RSD為2.2%,表明測定方法的重復(fù)性較好。

3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取9份已知含量(槲皮素0.132 5 mg·g-1)的槐米粗粉,3份一組,分別按照0.8倍、1.0倍、1.2倍加樣量加入槲皮素對(duì)照品,按照2.2項(xiàng)下的方法制備待測樣品溶液。按照2.3項(xiàng)下的方法測定溶液的熒光強(qiáng)度,并根據(jù)線性方程計(jì)算出槲皮素含量的理論值,結(jié)果列于表1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到槲皮素的平均回收率為98.47%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.51%(n=9)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法符合定量分析的要求。

圖4 共存物質(zhì)對(duì)檢測結(jié)果影響的熒光光譜圖

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果

4 結(jié)論

基于槲皮素的強(qiáng)抗氧化性與DES還原產(chǎn)物的熒光特性,對(duì)槐米中槲皮素含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明,體系的最佳pH值為6,在5~30 min內(nèi)槲皮素與DES混合溶液的熒光強(qiáng)度無明顯變化。在最佳條件下,槲皮素濃度為0.25~4.00 mmol·L-1時(shí),槲皮素的濃度與還原態(tài)DES的熒光強(qiáng)度之間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,檢測限為5.45×10-3mmol·L-1,R2=0.999 6。常 見金屬離子(K+、Ca+、Zn2+、Mg2+),NH4+和Glc對(duì)測定結(jié)果無明顯干擾。該方法操作簡便,具有良好的抗干擾性、重現(xiàn)性,可為槐米藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

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