王毛毛，張瑤瑤，+，姚宏亮，劉 麗，*，JOSEF Voglmeir，*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京210095;2.金陵科技學院動物科學與技術學院食品科學系，江蘇南京210038)

唾液酸(Sialic acid，Sia)，又稱神經(jīng)氨酸(Neuraminic acid，Neu)，是一系列含有九個碳原子的羥基化單糖?；苌锏慕y(tǒng)稱，通常位于高等動物糖蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂及多糖胺等寡糖鏈的末端［1］，通過α－2，3/6鍵連接在半乳糖(Gal)/N－乙酰半乳糖胺(GalNAc)上或α－2，8鍵連接到其他種類的唾液酸上［2］。唾液酸家族種類繁多，目前已經(jīng)鑒定出50多種天然存在的唾液酸衍生物［3］，其核心結(jié)構(gòu)分為酮基－脫氧壬酮糖(Kdn)和神經(jīng)氨酸(Neu)兩大類［4］。常見兩種構(gòu)型為N－乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)和N－羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)［5］，其中研究最多、最深入的唾液酸是Neu5Ac，它是合成其他種類唾液酸的前體［6］。唾液酸作為糖綴合物的重要組成部分，其所攜帶的負電荷能促進細胞之間的相互排斥，起到穩(wěn)定細胞膜、增加偶聯(lián)糖蛋白粘度的作用［7］。唾液酸還是重要的生物信息傳遞分子，如參與識別宿主與病原體之間以及細胞之間的反應［8－9］、參與衰老紅細胞的觸發(fā)和吞噬等［10］。另外，唾液酸與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都有著密切的關聯(lián)［11－12］。研究發(fā)現(xiàn)唾液酸在腦中的含量很高，它能促進神經(jīng)細胞的發(fā)育、分化和再生，并參與記憶和學習功能［13］。嬰幼兒自身合成的唾液酸并不能滿足機體需要，研究發(fā)現(xiàn)可以通過飲食補充外源性唾液酸以增加腦部唾液酸的含量。因此很有必要開發(fā)一種能夠用于食品中唾液酸含量的準確定量方法，為嬰幼兒膳食營養(yǎng)補充提供有力的依據(jù)。

Warren等［14］開發(fā)出一種用于唾液酸含量測定的比色法，但該方法的特異性差。隨著分析技術的穩(wěn)定和完善，如高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)和質(zhì)譜的聯(lián)用等分析技術使人們對唾液酸的結(jié)構(gòu)有了更加清晰的認識。Koketsu等［15］應用高效液相色譜技術測定了烏雞蛋中唾液酸的含量。但該方法的缺點是生物樣品的基質(zhì)效應使得唾液酸的檢測結(jié)果準確度不高。為了解決這一問題，本實驗室在前期研究中以X－Gal－α－2，6－Neu5Prop為內(nèi)標，與紅肉樣品同時進行酸水解使分析物與內(nèi)標物處于相同的基質(zhì)背景，從而消除基質(zhì)效應［16］。游離唾液酸經(jīng)熒光標記物鄰苯二胺衍生后采用HPLC－FLD進行檢測［16－18］，實現(xiàn)了紅肉中唾液酸的準確定量。

膳食中Neu5Ac的主要來源之一是雞蛋，研究發(fā)現(xiàn)雞蛋中含有大量的Neu5Ac，尤其是蛋黃中含量更高(0.95 g/kg)［19］，且不含其他種類的唾液酸［20］。雞蛋作為Neu5Ac的飲食和工業(yè)來源具有巨大的潛力［21］。而其他種類禽蛋如鵪鶉蛋、鵝蛋、鴨蛋等卻鮮有研究，因此本研究擬以化學酶法合成的X－Gal－α－2，6－Neu5Prop為內(nèi)標并結(jié)合HPLC－FLD對9種禽類蛋黃和蛋清中Neu5Ac的含量進行測定，從而為膳食營養(yǎng)的攝入提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮禽蛋(雞，鵪鶉、鵝、珍珠雞、鴕鳥、鴨、鴿子、烏雞和火雞)購自江蘇蘇果超市和南京家禽養(yǎng)殖場;N－乙酰神經(jīng)氨酸 分析純，上海德默醫(yī)藥科技有限公司;NaHSO3、NaCl、冰醋酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司;鄰苯二胺(OPD)分析純，百靈威科技有限公司;甲醇、乙腈 色譜純，默克公司;N－氨基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、乙酸乙酯、三乙胺(Et3N)、甲醇、氯化鎂、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X－Gal)、2－(N－嗎啡啉)、乙磺酸(MES)、三磷酸胞苷(CTP)、甘露糖胺 分析純，南京壽德公司;所有分離用有機溶劑 均為國產(chǎn)分析純;唾液酸轉(zhuǎn)移酶(～0.02 U)、CMP－唾液酸合成酶(～0.02 U)、唾液酸醛縮酶(≥13 mU)南京格萊克生物科技有限公司;乳糖酶(～10 U) 德國Pronatura公司。

1416R型高速冷凍離心機 珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司;GRP－9160型恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司;LNG－T12真空離心濃縮干燥儀 太倉市華利達實驗設備有限公司;Shimadzu LC－30AD型超高效液相色譜配有SPD－20A型紫外檢測器以及RF－20Axs型熒光檢測器、SIL－30AC型自動進樣器、CO－2000型柱溫箱(恒溫儀器)、LCMS－2020型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀、LC solution工作站 島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司;UltrafileXtreme MALDI－TOF質(zhì)譜儀 德國Bruker公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司(江蘇)。

1.2 實驗方法

1.2.1 X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的合成、純化與檢測 生物樣品中唾液酸通常以糖綴合物的形式存在于糖脂和糖蛋白上與半乳糖殘基相連。因此本文選擇了X－Gal－α－2，6－Neu5Ac作為生物樣品唾液酸糖綴合物的模型，并研究X－Gal－α－2，6－Neu5Ac在酸性條件下的水解特性以確定生物樣品中唾液酸糖綴合物解離為游離唾液酸的最佳反應時間，同時跟內(nèi)標物在酸性條件下水解特性進行比較，以判斷X－Gal－α－2，6－Neu5Prop是否能作為合適的內(nèi)標。

1.2.1.1 X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的合成 以Neu5Ac和X－Gal為起始物，酶法合成X－Gal－α－2，6－Neu5Ac［22－25］，將MES緩沖液(4 mL，0.5 mol/L，pH6.5)、MgCl2(80μL，1 mol/L)、胞苷三磷酸(5.52 mL，80 mmol/L)、Neu5Ac(0.92 mL，0.2 mol/L)、X－Gal(0.6 mL，61 mmol/L)、唾液酸轉(zhuǎn)移酶(19.68 mL)和CMP－唾液酸合成酶(9.2 mL)混合后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應。在10 min、30 min、1 h、2 h、3 h等反應時間點取樣并用HPLC實時監(jiān)測X－Gal－α－2，6－Neu5Ac的轉(zhuǎn)化率，待轉(zhuǎn)化率達到95%時加入乳糖酶(1 mL)，繼續(xù)反應1 h以除去過量的X－Gal。

以甘露糖胺為底物采用化學酶法合成X－Gal－α－2，6－Neu5Prop［16，25］(X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的合成流程及應用如圖1所示)。將反應體系置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應，利用HPLC實時檢測轉(zhuǎn)化率，待轉(zhuǎn)化率≥80%時加入乳糖酶(～10 U)，37℃反應30 min以除去過量的X－Gal。

1.2.1.2 X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的純化 將1.2.1.1中X－Gal－α－2，6－Neu5Ac的反應體系先經(jīng) C18固相萃取柱(SupelcleanTM ENVITM－18 SPE，45μm平均孔徑，500 mg/3 mL)純化，上樣后用4 mL水平衡柱子，然后分別用10 mL 10%、40%、100%的乙腈－水溶液(v/v)梯度洗脫并收集樣品洗脫下來的樣品，每管收集2 mL，利用HPLC在300 nm的波長下檢測收集到的組分并將含有X－Gal－α－2，6－Neu5Ac的組分合并。將合并后的初提純品減壓真空濃縮干燥(28 Pa，1500 r/min，常溫)后用硅膠柱進行二次純化，硅膠柱采用濕法裝柱，硅膠粉用量為樣品量的30倍左右，待硅膠柱壓實后將X－Gal－α－2，6－Neu5Ac的初提純品加入硅膠柱的最上端，經(jīng)乙酸乙酯∶甲醇∶水(12∶8∶1，v/v/v)混合溶劑洗脫，并收集洗脫液。用HPLC對收集到的樣品進行再次檢測，將含有X－Gal－α－2，6－Neu5Ac的洗脫組分合并，采用真空濃縮除去溶劑，得到10 mg X－Gal－α－2，6－Neu5Ac的純品(產(chǎn)率為39%，產(chǎn)物的摩爾質(zhì)量/底物的摩爾質(zhì)量×100)。X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的純化方式與上述相同。

1.2.1.3 X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的檢測 X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的HPLC檢測洗脫程序如下:反相色譜柱:Phenomenex Hyperclone 5μm ODS C18，250 mm×4.60 mm。流動相A:50 mmol/L甲酸銨(p H4.5);流動相B:乙腈;流速1.0 mL/min;紫外檢測波長:300 nm;進樣量:10μL;柱溫常溫。洗脫程序:0～5 min B 10%～60%，5～6 min B 60%～90%，6～8 min B 90%，8～9 min B 90%～10%，9～15 min B 10%。

圖1 以甘露糖胺為底物化學酶法合成X－Gal－α－2，6－Neu5Prop及其作為內(nèi)標檢測禽蛋樣品中Neu5Ac含量的流程圖Fig.1 The route of synthesis of X－Gal－α－2，6－Neu5Prop from mannosamine and determination of Neu5Ac content in poultry egg samples

對純化后的X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop用高效液相色譜－質(zhì)譜(HPLC－MS)檢測后，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI－ToF－MS)對這兩種物質(zhì)進一步驗證以確定其準確性。質(zhì)譜檢測參數(shù):電噴霧離子源，脫溶劑管溫度250℃，霧化器流速3 L/min，干燥器流速15 L/min。MALDI－ToF－MS質(zhì)譜條件為:離子加速電壓20 k V，質(zhì)荷比掃描范圍m/z 300～1500，采集數(shù)據(jù)所用激光的能量為6000，采用Bruker Flexanalysis 3.3分析軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理。

1.2.2 X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop水解特性研究 為了確定生物樣品中唾液酸糖綴合物解離為游離唾液酸的最佳反應時間，并進一步驗證X－Gal－α－2，6－Neu5Prop能否作為禽蛋Neu5Ac定量檢測的合適內(nèi)標物，本文研究了X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop在酸性條件下的水解特性。分別取4、20、100μL 1.2.1中合成的X－Gal－α－2，6－Neu5Prop或X－Gal－α－2，6－Neu5Ac溶 液(0.4 mmol/L)，醋 酸 溶 液(100μL，2 mol/L)和水(總體積200μL)加入到1.5 mL離心管中，80℃水浴下進行反應。在反應0、10、20、30、60、90、120、150、180 min時分別取4μL反應上清液，冰浴并用水稀釋至20μL過濾膜，采用HPLC檢測不同時間點的樣品。高效液相色譜檢測條件與1.2.1.3中相同。并根據(jù)下列公式計算水解程度:

水解程度(%)=(水解前的樣品量－水解后的樣品量)/水解前的樣品量×100

1.2.3 Neu5Ac和Neu5Prop在酸性條件下的穩(wěn)定性研究 為了檢驗唾液酸在酸性條件下的穩(wěn)定性，將1.2.1.1中合成的X－Gal－α－2，6－Neu5Prop或X－Gal－α－2，6－Neu5Ac(4μL，0.4 mmol/L)，冰醋酸(100μL，2 mol/L)和水(96μL)混勻后于80℃水浴中反應，在反應0、10、30 min，1、2、3、4、5、6、8、10、12、15 h時取反應上清液并迅速冰浴冷卻以終止反應，將反應上清液減壓真空濃縮干燥(28 Pa，1500 r/min，常溫)并參照1.2.6中描述的方法進行檢測。

1.2.4 Neu5Ac和Neu5Prop的濃度與色譜峰面積之間的線性關系考察 為了考察分析方法的準確性，本文研究了不同濃度的Neu5Ac和Neu5Prop與色譜峰面積之間的線性關系。將X－Gal－α－2，6－Neu5Prop或X－Gal－α－2，6－Neu5Ac分別溶于2 mol/L醋酸溶液中配制成1、2、2.5、5、10、15、20、40、60、80、100μmol/L的唾液酸衍生物，將配制好的溶液置于80℃水浴上加熱3 h后，迅速冰浴冷卻以終止反應，將反應液減壓真空濃縮干燥(28 Pa，1500 r/min，常溫)并參照1.2.6中描述的方法進行檢測。

1.2.5 禽蛋樣品中Neu5Ac的解離與定量檢測 將蛋黃與蛋清分離，稱取20 mg蛋黃或蛋清溶于1 mL醋酸溶液(2 mol/L)中，從中取出100μL加入4μL X－Gal－α－2，6－Neu5Prop水溶液(0.4 mmol/L)和96μL水。將反應體系置于80℃水浴中加熱3 h。反應結(jié)束后迅速將水解樣品冰浴冷卻以終止反應，離心后(12000 g，5 min，4℃)取500μL上清液減壓真空濃縮干燥(28 Pa，1500 r/min，常溫)并參照1.2.6中描述的方法進行檢測(流程如圖2所示)，并根據(jù)下列公式計算禽蛋樣品中Neu5Ac的含量:

其中，CNeu5Ac表示Neu5Ac的含量，mg/g;RMMNeu5Ac表示Neu5Ac的相對分子質(zhì)量309.27 g/mol;N表示樣品中Neu5Prop的摩爾質(zhì)量1.6 nmol;M表示樣品質(zhì)量，g;P表示峰面積。

1.2.6 唾液酸的熒光衍生與檢測 將上述經(jīng)真空干燥的游離唾液酸復溶在100μL 0.1 mol/L的氯化鈉溶液中，離心(12000×g，5 min，4℃)后取50μL上清加入10μL OPD衍生試劑(10 mg/mL鄰苯二胺(OPD)溶于0.2 mol/L NaHSO3溶液)，置于80℃水浴中避光反應40 min。

圖2 以X－Gal－α－2，6－Neu5Prop為內(nèi)標檢測禽蛋樣品中Neu5Ac的含量Fig.2 Determination of Neu5Ac in eggs by X－gal－α－2，6－neu5prop as internal standard

采用HPLC－FLD對衍生后的唾液酸樣品進行檢測。反相色譜柱:Phenomenex Hyperclone 5μm ODS C18，250 mm×4.60 mm。熒光激發(fā)波長Ex為373 nm，發(fā)射波長Em為448 nm，進樣量10μL。流動相A為純凈水，流動相B為色譜純乙腈，流動相C為色譜純甲醇，總流速為1.0 mL/min，梯度洗脫時間為22 min。洗脫程序如下:流動相A∶B∶C的初始比例為90∶5∶5，10 min內(nèi)流動相比例逐漸變?yōu)?6∶12∶12，然后2 min內(nèi)流動相比例變?yōu)?0∶40∶40，并在此濃度保持10 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel Office 2010數(shù)據(jù)整理，繪圖軟件采用Adobe illustrator進行色譜圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的合成、純化與檢測

酶法合成的X－Gal－α－2，6－Neu5Ac以及化學酶法合成的X－Gal－α－2，6－Neu5Prop，經(jīng)C18固相萃取柱初提純后再經(jīng)硅膠柱二次純化。純化后的X－Gal－α－2，6－Neu5Ac與X－Gal－α－2，6－Neu5Prop經(jīng)HPLC檢測，結(jié)果如圖3A中所示，X－Gal－α－2，6－Neu5Ac與X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的保留時間均在7 min左右，采用LC－MS對其進行驗證，提取在負離子模式下的離子流圖，結(jié)果如圖3B中所示，X－Gal－α－2，6－Neu5Ac的質(zhì)荷比(m/z)為697.06(［M－H］－)，與理論值697.14(［M－H］－，84%)相符。X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的質(zhì)荷比(m/z)為711.08(［M－H］－)，與理論值711.18(［M－H］－，77%)一致。采用MALDI－ToF－MS對X－Gal－α－2，6－Neu5Ac與X－Gal－α－2，6－Neu5Prop進一步驗證，結(jié)果如圖3C和3D所示，檢測結(jié)果均與理論值相符。因此，本研究成功合成并得到了X－Gal－α－2，6－Neu5Ac與X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的純品。

圖3 X－Gal－唾液酸的HPLC－MS譜圖和MALDI－ToF－MS譜圖Fig.3 The HPLC－MSprofiling and MALDI－ToF－MS profiling of the X－Gal－sialoside

2.2 X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop的水解特性研究

本研究以酶法合成的X－Gal－α－2，6－Neu5Ac作為生物樣品中唾液酸糖綴合物的模型，以化學酶法合成的X－Gal－α－2，6－Neu5Prop為內(nèi)標物，研究了X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop在酸性條件下的水解特性。將不同樣品量的X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop在2 mol/L的醋酸溶液中80℃的水解條件下反應，取反應0、10、20、30、60、90、120、150、180 min時的反應上清液冰浴、稀釋并過濾膜后用HPLC進行分析。研究結(jié)果如圖4所示，不同樣品量的唾液酸衍生物在60 min內(nèi)水解速率較快，唾液酸衍生物的解離程度與反應時間成正比。90 min后能完全轉(zhuǎn)化為相應的游離唾液酸。因此，相同樣品量的生物樣品中唾液酸糖綴合物在2 mol/L的醋酸溶液中、80℃的水解條件下，90 min即可完全轉(zhuǎn)化為游離的唾液酸。

圖4 底物濃度和水解時間對X－Gal－唾液酸水解程度的影響Fig.4 Effects of substrate concentration and time on the extent of the hydrolysis of X－Gal－α－2，6－sialoside

2.3 Neu5Ac和Neu5Prop在酸性條件下的穩(wěn)定性分析

在樣品處理和衍生過程中，分析物與內(nèi)標的穩(wěn)定性十分重要。因此本文研究了Neu5Ac和Neu5Prop在酸性條件下的穩(wěn)定性。前期研究結(jié)果顯示唾液酸衍生物如脫氨基神經(jīng)氨酸(KDN)在酸性條件下的穩(wěn)定性與Neu5Ac相比明顯較差［16，26］。為了評估這一特性，將X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop分別溶于2 mol/L醋酸溶液中并在80℃下(與禽蛋樣品中唾液酸的水解條件相同)反應，游離唾液酸經(jīng)OPD衍生后采用HPLC進行分析。結(jié)果如圖5所示，Neu5Ac和Neu5Prop在10 h內(nèi)表現(xiàn)出相似的穩(wěn)定性，反應10 h后，游離唾液酸的量隨水解時間的延長呈逐漸下降的趨勢。從圖5B中可以看出，水解3 h后Neu5Prop的量隨著水解時間的延長不再繼續(xù)升高，因此X－Gal－α－2，6－Neu5Prop在水解3 h后能完全解離為游離的Neu5Prop。

2.4 底物濃度與峰面積之間的線性關系的考察

為了考察分析方法的準確性以及靈敏度，采用高效液相色譜對已知濃度的Neu5Ac和Neu5Prop(從X－Gal－α－2，6－唾液酸的定量水解得到)與峰面積之間的線性關系進行考察。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，結(jié)果如圖6所示。Neu5Ac和Neu5Prop在1～100μmol/L的濃度范圍內(nèi)均呈線性關系。

2.5 禽蛋中唾液酸含量的定量測定

圖5 唾液酸水解條件下Neu5Ac和Neu5Prop的穩(wěn)定性Fig.5 Stability of Neu5Ac and Neu5Prop under sialic acid－releasing conditions

圖6 底物濃度與峰面積之間的線性回歸分析(n=3)Fig.6 The linear regression analysis between substrate concentration and peak area(n=3)

本研究采用內(nèi)標法檢測了9種禽類蛋黃和蛋清中Neu5Ac的含量(如表1所示)。游離唾液酸經(jīng)熒光標記物OPD衍生后采用HPLC－FLD進行檢測，MS結(jié)果顯示m/z 382.0(［Neu5Ac－OPD+H］+)、396.0(［Neu5Prop－OPD+H］+)均與理論值相符，驗證了液相色譜中9.1和11.8 min的色譜峰分別為Neu5Ac和Neu5Prop的色譜峰(如圖7所示)。研究結(jié)果顯示蛋清中Neu5Ac的含量在相同物種之間相差不大，但在不同物種之間表現(xiàn)出很大的差異。鵪鶉蛋清中Neu5Ac的含量最低(0.13 mg/g)，而鴕鳥蛋清中的最高(2.20 mg/g)，比鵪鶉蛋清Neu5Ac含量高出近17倍。蛋黃中Neu5Ac含量的差異較小，雞蛋黃中含量為0.88 mg/g，鴕鳥蛋黃中含量為0.94 mg/g。檢測到雞蛋中唾液酸的含量與已報道的結(jié)果(蛋黃中0.95 mg/g，蛋清中0.1 mg/g)一致［19］。而烏雞蛋黃和蛋清中Neu5Ac的含量與已報道的含量(蛋黃為7.1 mg/g，蛋清為0.49 mg/g)相比較低，今后需進一步研究種間變異對檢測值造成的影響。

表1 不同種類禽蛋蛋清和蛋黃中Neu5Ac含量(n=3)Table 1 The content of Neu5Ac in egg whites and egg yolks of different species of bird(n=3)

圖7 雞蛋黃中Neu5Ac和內(nèi)標物Neu5Prop的定性測定Fig.7 Qualitative determination of Neu5Ac and Neu5Prop in egg york

實驗以化學酶法合成的X－Gal－α－2，6－Neu5Prop為內(nèi)標，消除了基質(zhì)效應對檢測結(jié)果造成的影響，實現(xiàn)了對禽類蛋清蛋黃中Neu5Ac的準確定量?；|(zhì)效應通常是指樣品在提取或在前處理中引入的其他雜質(zhì)對檢測的選擇性和靈敏度造成的影響，進而影響到分析方法的準確度。內(nèi)標法［27］、基質(zhì)添加標準曲線法［28］和優(yōu)化前處理條件［29］等方法是有效消除基質(zhì)效應的方法。內(nèi)標定量法是通過測量內(nèi)標物與目標組分的峰面積的相對值來進行計算，在一定條件上消除了前處理條件變化等所引起的誤差，測定結(jié)果較為準確。采用內(nèi)標法消除基質(zhì)效應時，應選擇合適的內(nèi)標物，本研究中用到的內(nèi)標物X－Gal－α－2，6－Neu5Prop經(jīng)酸水解為游離的Neu5Prop，該物質(zhì)與被檢測物質(zhì)Neu5Ac的結(jié)構(gòu)相似，僅單個側(cè)鏈基團不同。因此，在液相色譜中與被檢測物質(zhì)有相似的響應值，可減小檢測過程中帶來的誤差。但X－Gal－α－2，6－Neu5Prop不適用于分析樣品中含有兩種以上與被分析物與不可分離的唾液酸［30］。Cai等［17］應用同位素標記的唾液酸衍生物作為內(nèi)標物實現(xiàn)了肉類和禽蛋中唾液酸含量的準確測定，但是同位素標記的內(nèi)標物價格昂貴且不易獲取。因此，選擇合適的內(nèi)標物至關重要。

3 結(jié)論

本研究采用化學酶法成功地合成了非天然唾液酸衍生物X－Gal－α－2，6－Neu5Prop，對該衍生物在酸性水解條件下水解特性以及穩(wěn)定性進行了考察。并以該衍生物為內(nèi)標結(jié)合高效液相色譜測定了鵪鶉、鵝、珍珠雞、鴕鳥、鴨、鴿子、火雞等9種禽類蛋黃和蛋清中Neu5Ac的含量。研究結(jié)果表明，相同濃度的X－Gal－α－2，6－Neu5Ac和X－Gal－α－2，6－Neu5Prop在2 mol/L的醋酸溶液80℃的水解條件下水解程度相當，90 min后能夠完全轉(zhuǎn)化為游離的唾液酸。Neu5Ac和Neu5Prop在10 h時仍保持相似的穩(wěn)定性。蛋清中Neu5Ac的含量在相同物種之間相差不大但在不同物種之間表現(xiàn)出很大的差異。鵪鶉蛋清中Neu5Ac的含量最低(0.13 mg/g)，而鴕鳥蛋清中的最高(2.20 mg/g)，比鵪鶉蛋清Neu5Ac含量高出近17倍。雞蛋蛋黃與蛋清中Neu5Ac含量與之前報道的結(jié)果一致［19］。本研究涉及的分析方法可行性高，易于操作，重復性強。因此，適于食品和生物樣品的常規(guī)分析。