郝 靜，楊太琴，2，+，王 晗，2，汪 旭，2，倪 娟，2，*

(1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650500;2.云南師范大學(xué)生物能源持續(xù)開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南昆明650500)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯［(－)－ epigallocatechin－3－gallate，EGCG］，是兒茶素中含量最高活性最強的成分，也是綠茶利好人體健康的主要承擔(dān)者［1－2］。兒茶素的結(jié)構(gòu)特征是B－環(huán)上有二個或三個羥基基團和A－環(huán)上的5，7－二羥基基團，因此具有抗氧化活性。EGCG除上述兩個環(huán)上的羥基外，還在D－環(huán)上帶有三個羥基，在四種主要的兒茶素中，其抗氧化活性最強［3－4］。EGCG不僅可以直接清除胞內(nèi)活性氧/氮離子，還能螯合幾種具有強正電荷的金屬離子(Fe3+、Al3+和Gu2+);其可使鐵離子失活，抑制超氧化物驅(qū)動的芬頓反應(yīng)(Fenton reaction);抑制H2O2形成和脂質(zhì)過氧化。因此，大多研究認為EGCG對人體健康的利好效應(yīng)源于其卓越的抗氧化能力［5］。

然而，由于EGCG特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，穩(wěn)定性較差，可發(fā)生自動氧化和異構(gòu)反應(yīng)，根據(jù)所處條件(EGCG濃度、pH、溫度和含氧量等)其反應(yīng)取向不同。當(dāng)EGCG自動氧化形成多聚物時，可能產(chǎn)生如H2O2一類的活性氧(reactive oxygen species，ROS)［6］，表現(xiàn)出促氧化活性。有研究發(fā)現(xiàn)，50μmol/L EGCG在無細胞的McCoy’s 5A培養(yǎng)基中120 min，培養(yǎng)基中的H2O2達到峰值25μmol/L。用相同的條件處理HT－29細胞30 min后培養(yǎng)體系中的H2O2水平達到最高水平10μmol/L［7］。在活體中，也觀察到了EGCG的促氧化效應(yīng)，用高劑量的EGCG喂食小鼠，出現(xiàn)劑量依賴的肝臟毒性［8］。但EGCG的促氧化效應(yīng)在不同的細胞和動物模型中并沒有得到一致的結(jié)論。Sheng等［9］發(fā)現(xiàn)200μmol/L的H2O2能顯著誘導(dǎo)正常人心臟成肌細胞H9c2凋亡，而EGCG可抑制H2O2介導(dǎo)的H9c2凋亡，用EGCG單獨處理H9c2時并未觀察到胞內(nèi)外的H2O2水平的變化。

因此，本文解析EGCG氧化聚合的環(huán)境條件，及其穩(wěn)定性變化對受試細胞氧化還原平衡的影響，為進一步探討EGCG在細胞培養(yǎng)體系及活體中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人正常結(jié)腸上皮NCM460細胞 購自中科院昆明動物所細胞庫;EGCG粉末 購自sigma公司;過氧化氫檢測試劑盒(S0038)購自上海碧云天公司。

MCO－5AC培養(yǎng)箱 SANYO;318C酶標(biāo)儀 上海三科儀器;NanoPhotometer N60分光光度計 IMPLEN;VANOX－S顯微鏡 OLYPUS。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑配制

1.2.1.1 EGCG溶液 0.15 g EGCG粉末融入10 mL的三蒸水中攪拌均勻配制成32 mmol/L的EGCG溶液，在超凈工作臺利用0.2μm針頭濾器進行無菌過濾。待實驗開始前將EGCG溶液儲存液稀釋至如表1所需濃度。

1.2.1.2 細胞培養(yǎng)基 RPMI1640或DMEM培養(yǎng)液Gibco，含10%胎牛血清Gibco;0.1%雙抗(10萬單位/mL)Gibco;1%L－谷氨酰胺(200 mmol/L)Gibco。

1.2.1.3 其他 細胞磷酸緩沖液(PBS)Gibco;0.4%臺盼藍Solarbio，0.25%胰蛋白酶Gibco。

1.2.2 影響EGCG氧化聚合的環(huán)境因素分析

1.2.2.1 溶液環(huán)境對EGCG聚合的影響 實驗選擇了H2O、RPMI1640、DMEM(pH=7)三種溶液體系，分別加入不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置于37℃培養(yǎng)箱恒溫反應(yīng)24 h后，吸取三個重復(fù)的150μL溶液置于96孔板中，檢測578 nm的OD值，以確定溶液體系對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.2 溫度環(huán)境對EGCG聚合的影響 實驗以RPMI1640(pH=7)為溶液體系，分別加入不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置于37℃培養(yǎng)箱和74℃的水浴鍋中恒溫反應(yīng)24 h后，吸取三個重復(fù)的150μL溶液置于96孔板中，檢測578 nm的OD值，以確定溫度對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.3 時間對EGCG聚合的影響 實驗以RPMI1640(pH=7)為溶液體系，加入320μmol/L的EGCG，置于37℃培養(yǎng)箱恒溫反應(yīng)3、6、12、24 h后，各組吸取三個重復(fù)的150μL溶液置于96孔板中，檢測578 nm的OD值，以確定時間對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.4 pH對EGCG聚合的影響 實驗選用RPMI1640和H2O為兩種溶液體系，分別設(shè)置不同的pH(p H=5和9)，加入不同濃度的EGCG(0、20、80、320μmol/L)，分別置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫處理24 h后，各組吸取三個重復(fù)的150μL溶液置于96孔板中，檢測578 nm的OD值，以確定pH對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.3 EGCG在培養(yǎng)系統(tǒng)中對NCM460細胞的胞內(nèi)、外H2O2濃度影響 接種6個含NCM460的6孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁生長后，更換含有不同濃度EGCG(0、20、40、80μmol/L)的RPMI1640培養(yǎng)液，每個6孔板培養(yǎng)時間分別為1、2、3、6、12、24 h，在對應(yīng)的時間節(jié)點先取各孔上層培養(yǎng)液50μL，用于胞外H2O2濃度檢測。之后，棄去含EGCG培養(yǎng)基，胰酶消化后用1 mL RPMI1640培養(yǎng)基吹打混勻形成細胞懸液，計數(shù)，吸取5×105個細胞，用于胞內(nèi)H2O2濃度檢測。

1.2.4 H2O2濃度檢測 按照過氧化氫檢測試劑盒操作步驟，檢測不同濃度EGCG處理各時間點的培養(yǎng)上清及細胞內(nèi)H2O2濃度。

表1 不同濃度EGCG溶液的配制Table 1 Preparation different concentrations of EGCG solution

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗均重復(fù)三次，對數(shù)據(jù)進行整理歸納，利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，采用GrahPad Prism 5制圖軟件作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因素對EGCG氧化聚合的影響

2.1.1 溶液體系對EGCG氧化聚合的影響 實驗設(shè)置了H2O、RPMI1640、DMEM(pH=7)3種溶液體系，比對不同的溶液對EGCG氧化聚合的影響。如圖1所示，在相同EGCG濃度下，RPMI1640、DMEM兩種培養(yǎng)基的OD578值極顯著高于H2O(P＜0.001);對比兩種培養(yǎng)基，DMEM的OD578值高于RPMI1640，即三種溶液體系促進EGCG氧化聚合率的排序為:DMEM＞RPMI1640＞H2O。

圖1 EGCG在不同溶液環(huán)境中OD值比較Fig.1 Comparison of OD value of EGCG in different solution environments

2.1.2 溫度對EGCG氧化聚合的影響 實驗設(shè)置了37和74℃研究溫度對EGCG氧化聚合率的影響。如圖2所示，在以RPMI1640為溶液體系下，除最高EGCG濃度320μmol/L外，各濃度組74℃的氧化聚合率均顯著高于37℃(P＜0.05)，即高溫促進EGCG的氧化聚合。

圖2 EGCG在不同溫度條件下OD值比較Fig.2 Comparison of OD value of EGCG in different temperatures

2.1.3 EGCG濃度對自身氧化聚合的影響 不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)分別以H2O、RPMI1640、DMEM(pH=7)三種溶液體系，反應(yīng)3、6、12、24 h。結(jié)果顯示，以H2O為溶液的各EGCG濃度組間無顯著差異(圖3i，j，k，l);以RPMI1640和DMEM為溶液體系的3 h組，各濃度間也無顯著差異(圖3a，e)，其余各組均隨著EGCG濃度的升高，OD578顯著上升(P＜0.05)(圖3b，c，d，f，g，h)，即高濃度促進EGCG的氧化聚合。

2.1.4 反應(yīng)時間對EGCG氧化聚合的影響 實驗設(shè)置了4個反應(yīng)時間，探討時間對EGCG氧化聚合的影響。通過EGCG濃度及溶液環(huán)境對其自動氧化影響的結(jié)果顯示，培養(yǎng)液及高濃度的EGCG促進其氧化聚合，因此，對比了320μmol/L的EGCG在RPMI1640培養(yǎng)基中各時間點OD578的變化。如圖4顯示，12和24 h的OD578極顯著高于3 h(P＜0.001)，即在高濃度下，隨著作用時間延長，EGCG氧化聚合率顯著增加。

2.1.5 pH對EGCG氧化聚合的影響 實驗設(shè)置了pH=5和9探討pH對EGCG氧化聚合的影響，選用RPMI1640和H2O兩種溶液條件，37℃時分別比較了不同pH條件下的OD值變化。如圖5a所示，以RPMI1640作為溶液環(huán)境，各濃度下兩種p H的OD578均有極顯著差異(P＜0.001)，pH=5時各濃度組OD578變化不顯著(P＞0.05);p H=9時OD578隨著EGCG濃度的升高顯著增大(P＜0.05)。當(dāng)以H2O作為溶液環(huán)境，p H=5各濃度OD57值均極顯著低于pH=9的OD578值(P＜0.001)，如圖5b，綜合各組結(jié)果，堿性環(huán)境較酸性環(huán)境促進EGCG的氧化聚合。

2.2 EGCG穩(wěn)定性的改變對NCM460細胞的胞內(nèi)、外H2 O2濃度影響

2.2.1 細胞內(nèi)H2O2水平的檢測 對比不同處理時間點發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)H2O2濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;與對照組0μmol/L相比，H2O2濃度1 h內(nèi)出現(xiàn)了短暫增高，其中80μmol/L組極顯著增高(P＜0.001)(圖6a)，處理3 h后，與對照組相比高濃度EGCG中的H2O2濃度出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)(圖6c)，這種現(xiàn)象在處理12 h后更顯著(P＜0.001)(圖6d)。

2.2.2 胞外H2O2水平的檢測 結(jié)果顯示，隨著處理時間的延長，培養(yǎng)體系中H2O2濃度呈現(xiàn)上升趨勢;對比相同時間不同濃度組發(fā)現(xiàn)，處理2、3、6、12 h后，20、40、80μmol/L的處理體系H2O2濃度顯著高于對照組(P＜0.05)，即培養(yǎng)體系中的H2O2濃度隨時間延長和EGCG濃度的增加而顯著上升，處理24 h后胞外的H2O2水平出現(xiàn)明顯降低，見圖7。

3 討論

EGCG的多種生物活性已在細胞培養(yǎng)模型中得到證實，其中最顯著的為抗氧化、抗炎和抗癌作用［2，10－12］，這表明EGCG很可能成為因ROS增加和/或細胞抗氧化能力不足引發(fā)的退行性疾病的臨床藥物。然而，EGCG在相應(yīng)動物實驗中的結(jié)果是存在爭議的［13－14］。依據(jù)EGCG結(jié)構(gòu)特征，其在細胞培養(yǎng)物中和整個生物體中的活性不一致可能歸因于EGCG分子的穩(wěn)定性不足，EGCG不受控的降解或聚合［15－16］，不僅會導(dǎo)致體外研究結(jié)論不準(zhǔn)確，還會限制EGCG在體內(nèi)的生物利用度。

圖3 不同濃度EGCG在各溶液環(huán)境及反應(yīng)時間下OD值比較Fig.3 Comparison of OD values of different concentrations of EGCG in each solution and reaction time

圖4 320μmol/L的EGCG在不同反應(yīng)時間下OD值比較Fig.4 Comparison of OD value of 320μmol/L EGCG in different time

本實驗發(fā)現(xiàn)不同的溶液環(huán)境對EGCG的氧化聚合有較明顯影響，在DMEM培養(yǎng)液中EGCG的聚合效率更高，而H2O的影響較小，這與Krupkova等［17］的研究結(jié)果吻合;高溫促進了EGCG的自動氧化，Krupkova等［17］也證實低溫可以保持EGCG的穩(wěn)定性;不同EGCG濃度下EGCG的氧化聚合程度不同，高濃度促進EGCG的聚合，同時，隨著反應(yīng)時間的增長，EGCG的聚合物增多;溶液pH對EGCG的穩(wěn)定性也有較明顯影響，EGCG在酸性環(huán)境中更加穩(wěn)定(pH＜6)，這與相關(guān)研究相符［17－18］。由此可見，溶液環(huán)境、溫度、反應(yīng)時間、EGCG濃度和溶液pH等因素均會影響EGCG的穩(wěn)定性，在相關(guān)實驗條件下應(yīng)給予考慮。已有研究證實，環(huán)境是確定EGCG抗淀粉樣蛋白功效的關(guān)鍵因素［19］，因此，解析EGCG穩(wěn)定性的環(huán)境條件對于進一步研究其在機體中發(fā)揮功效的機制有重要意義。

圖5 EGCG在不同pH條件下以RPMI1640為溶液環(huán)境(a)和H2 O為溶液環(huán)境(b)的OD值比較Fig.5 Comparison of OD values with RPMI1640 as solution environment(a)and H2 O as solution environment(b)under different pH conditions

圖6 不同濃度EGCG處理后NCM460胞內(nèi)過氧化氫濃度變化圖Fig.6 Changes of intracellular hydrogen peroxide concentration in NCM460 treated with different concentrations of EGCG

圖7 不同濃度EGCG處理下NCM460胞外過氧化氫濃度變化圖Fig.7 Changes of extracellular hydrogen peroxide concentration in NCM460 treated with different concentrations of EGCG

在正常培養(yǎng)細胞體系中探討了EGCG的穩(wěn)定性對其抗氧化能力的影響，發(fā)現(xiàn)胞外H2O2水平在時間和濃度效應(yīng)上與對照組相比呈上升趨勢，而胞內(nèi)出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。研究分析，EGCG在培養(yǎng)體系中會發(fā)現(xiàn)氧化聚合反應(yīng)，生成H2O2;隨后，H2O2進入細胞，使胞內(nèi)H2O2水平迅速上升，給細胞造成氧化脅迫［20］，激活胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)應(yīng)對脅迫［21－22］，隨著抗氧化酶系的積極響應(yīng)，胞內(nèi)H2O2水平出現(xiàn)短暫上升然后開始下降，最終表現(xiàn)為EGCG處理后，細胞內(nèi)H2O2濃度低于未處理細胞，表現(xiàn)為抗氧化效應(yīng)，特別是20μmol/L組，這一過程可能是EGCG發(fā)揮生物活性，特別是在抗增殖和癌癥治療中的潛在作用［23］。如20μmol/L的EGCG是其通過預(yù)警響應(yīng)發(fā)揮抗氧化活性的最適濃度，隨著EGCG濃度的升高，氧化聚合反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2水平超過細胞氧化應(yīng)激范圍，可能對細胞造成氧化損傷，詳細分子機制有待進一步驗證。

4 結(jié)論

RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基較H2O更促進EGCG的氧化聚合，低溫低EGCG濃度及酸性條件利于EGCG的穩(wěn)定，同時EGCG的氧化聚合隨反應(yīng)時間延長而加劇。在含有細胞的培養(yǎng)體系中，EGCG也會發(fā)生自動氧化聚合并產(chǎn)生H2O2，導(dǎo)致細胞內(nèi)外的H2O2濃度升高，但胞內(nèi)H2O2濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。研究結(jié)果提示，一定濃度的EGCG在培養(yǎng)細胞中可能通過氧化聚合產(chǎn)生H2O2，形成氧化脅迫，進而激活細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，使細胞內(nèi)H2O2濃度隨后降低，表現(xiàn)出抗氧化效應(yīng)。