丁 敏，王 瑩，鐘家美，黃愛軍

(贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/國家臍橙工程技術(shù)研究中心，江西贛州，341000)

柑桔葉斑駁病毒(Citrusleafblotchvirus, CLBV)屬于乙型線形病毒科柑桔病毒屬，是一種正義單鏈RNA病毒，在多數(shù)柑桔品種上不引起明顯癥狀[1]，但可引起德威特桔橙(Dweet tangor,Citrusreticulate×C.sinensis)斑駁花葉癥狀和在香櫞(‘Etrog’ citron,C.medica)上引起莖陷點(diǎn)癥狀[2-3]，還可能與以枳橙或枳柚做砧木時(shí)的砧穗不親和癥狀有關(guān)[4]。目前CLBV已在美國、西班牙、澳大利亞等多個(gè)國家報(bào)道，寄主范圍包括柑桔、甜櫻桃、獼猴桃和牡丹[5-7]。我國于2017年首次在檸檬上檢測出該病毒[8]。CLBV在自然條件下通過病穗嫁接和帶毒工具農(nóng)事操作進(jìn)行傳播，同時(shí)有證據(jù)顯示，CLBV具有一定的種傳概率[9-10]。雖然目前未見CLBV在柑桔產(chǎn)業(yè)上引起顯著危害的報(bào)道，但是不能排除該病毒對(duì)特定柑桔品種或者與其他病毒有協(xié)同作用產(chǎn)生嚴(yán)重危害。

目前報(bào)道的所有CLBV基因組結(jié)構(gòu)均相同，基因組5’和3’端各有一段非編碼區(qū)(untranslated regions, UTRs)，5’端有甲基化帽子結(jié)構(gòu)，3’端有ploy A尾巴；其余包含有3個(gè)開放閱讀框(open reading frame, ORF)。ORF1編碼一個(gè)227 kDa的多聚蛋白，這個(gè)多聚蛋白經(jīng)酶切割后，得到不同功能的蛋白，包括甲基轉(zhuǎn)移酶、AlkB蛋白、木瓜蛋白酶樣蛋白酶、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶。ORF2編碼約40 kDa的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)蛋白。ORF3編碼約41 kDa的外殼蛋白[11-13]。Li等[14]測定分析了中國4個(gè)不同省份柑桔樣品上的CLBV全長序列，核酸序列一致度在98.9%～99.8%間，表現(xiàn)出較小變異程度；而項(xiàng)周等[15]對(duì)來自湖北和四川的14個(gè)CLBV的CP基因分析結(jié)果顯示，CP基因核苷酸和氨基酸序列差異分別可達(dá)18%和12%，表現(xiàn)出較大的變異程度。目前，尚未有江西CLBV全長序列的報(bào)道。本研究擬通過對(duì)CLBV全基因序列測定，對(duì)其序列特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 供試材料感染CLBV的紐荷爾臍橙(C.sinensisOsbeck)樣品于2017年采集于江西省萬安縣窯頭鎮(zhèn)通津村柑桔園，樣品葉片上并未表現(xiàn)出斑駁黃化癥狀。采集感病植株的枝條進(jìn)行嫁接，保存于國家臍橙技術(shù)研究中心溫網(wǎng)室，并采集葉片低溫保濕帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行RNA抽提。抽提RNA于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑植物總RNA提取試劑RNAiso Plus，PrimeScript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒，SMARTer 5'/3' kit、PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒為寶生物工程公司產(chǎn)品。pEASY-Blunt Zero Cloning Kit，Trans1 -T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。所有操作均參照試劑盒說明書進(jìn)行。所得植物總RNA采用Nanodrop 2000(Thermo Scientific，美國)檢測其濃度和純度。CLBV基因組5’和3’端RACE擴(kuò)增引物，根據(jù)GenBank中已經(jīng)登錄的基因組序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，所有引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成。所用引物的相關(guān)信息見表1。

表1 柑桔葉斑駁病毒全基因組擴(kuò)增引物相關(guān)信息

1.3 試驗(yàn)方法CLBV基因組全長擴(kuò)增、克隆及測序：采用RNAiso試劑從采集的感病葉片樣品中提取總RNA，具體步驟參照說明書。以總RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系(20 μL)：隨機(jī)引物(Random 6 mers)1.0 μL，10 m mol/L的dNTP溶液1.0 μL，RNase Free 單蒸水6.0 μL，RNA模板2.0 μL，以上反應(yīng)液置于PCR儀上65 ℃解鏈5 min，然后取出立即置于冰上冷卻約2 min，再依次加入5× PrimeScript Buffer 4.0 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.5 μL，PrimeScript RTase(200 U/μL)1.0 μL，RNase Free 單蒸水4.5 μL，30 ℃反應(yīng)10 min，42 ℃反應(yīng)50 min，95 ℃反應(yīng)5 min酶失活后，冰上冷卻。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：5× PrimeSTAR GXL Buffer 5.0 μL，2.5 m mol/L的dNTP溶液2.0 μL，10 μ mol/L正向引物/反向引物0.5 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板1.0 μL，滅菌水15.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)步聚為：98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸時(shí)間視片段長度而定(按1 min / kb計(jì)算)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行條帶檢測。目的條帶的膠回收純化參照試劑盒說明進(jìn)行。經(jīng)純化產(chǎn)物與全式金pEASY-Blunt Zero載體連接后，轉(zhuǎn)化Trans1 -T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。每個(gè)條帶至少挑選3個(gè)以上陽性克隆進(jìn)行測序。病毒5’/3’端擴(kuò)增采用SMARTer 5’/3’試劑盒，步驟按照說明書進(jìn)行。擴(kuò)增所得目的條帶克隆、測序步驟同上。

序列分析：測序所得結(jié)果應(yīng)用Megalign軟件(DNASTAR)進(jìn)行序列拼接，得到病毒序列全長。分析所用CLBV分離物序列均下載自GenBank，利用在線軟件Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進(jìn)行序列一致性分析。序列比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA 6.06軟件，以鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)置為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLBV江西分離物的全基因組序列特征利用3對(duì)CLBV特異性引物通過RT-PCR擴(kuò)增得到3條片段大小為3 224、3 219和2 490 bp的目的條帶；利用RACE技術(shù)和巢式PCR擴(kuò)增獲得5’端和3’端序列，片段大小分別為471和557 bp。分離物全基因組分段擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，各片段結(jié)果均符合預(yù)期擴(kuò)增片段大小。

通過測序、拼接獲得了CLBV分離物基因組全長為8 747 nt，將其命名為CLBV-JX，提交GenBank后序列號(hào)為MT863785。該分離物全長序列包含3個(gè)ORF，ORF1(74-5 962)編碼多聚蛋白，ORF2(5 962-7 050)編碼移動(dòng)蛋白，ORF3(7 115-8 206)編碼外殼蛋白，5’端和3’端非翻譯區(qū)分別為73和541 nt，ORF2 和ORF3之間有一段64 bp的間隔區(qū)(見圖1)。

注：在電泳圖中，1為5’端RACE，2為KU52/KU58，3為KU59/KU60，4為KU61/KU62，5為3’端RACE擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 CLBV江西分離物與其他來源分離物的序列一致性序列一致性分析顯示，在全基因組水平上，CLBV-JX與其他6個(gè)CLBV分離物的一致度為74.3%～97.2%，與柑桔來源的分離物一致度高(96.8%～97.2%)，與獼猴桃來源的分離物一致度最低，僅為74.3%。在5’和3’端非編碼區(qū)上，核苷酸一致度分別為77.9%～98.6%和62.7%～98.9%。在3’端非編碼區(qū)表現(xiàn)出更大的變異性，CLBV-JX與來源于甜櫻桃的分離物(KR023647)一致度僅為62.7%。3個(gè)編碼框區(qū)域，核苷酸一致度分別為72.7%～97.1%、78.2%～96.4%和79.0%～98.8%，氨基酸一致度分別為79.4%～98.5%、96.1%～100%和88.0%～98.8%。當(dāng)CLBV分離物來源寄主是柑桔時(shí)，核苷酸和氨基酸水平變異小，當(dāng)寄主是甜櫻桃和獼猴桃時(shí)，核苷酸和氨基酸水平變異大(見表2)。這可能與病毒適應(yīng)不同寄主有關(guān)。

表2 CLBV-JX9分離物(MT863785)與其他來源CLBV分離物的核苷酸和氨基酸序列一致性 %

2.3 CLBV江西分離物基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育以不同來源CLBV分離物的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明，所有來源于柑桔的CLBV分離物緊密聚為一支，表現(xiàn)出較近的遺傳發(fā)育關(guān)系。來源于甜櫻桃的CLBV分離物與來源柑桔的CLBV分離物聚為一個(gè)大支，遺傳發(fā)育關(guān)系變遠(yuǎn)。來源于獼猴桃的3個(gè)CLBV分離物形成了兩個(gè)單獨(dú)分支，與以上分離物表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的遺傳距離(見圖2)。以上結(jié)果說明，CLBV在進(jìn)化上可能與對(duì)寄主的適應(yīng)性存在一定相關(guān)性，在柑桔上目前遺傳變異還較小，而在獼猴桃上變異較大。

圖2 不同來源CLBV分離物基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結(jié)與討論

本研究利用克隆、測序等技術(shù)獲得了CLBV-JX分離物的全基因組序列，并對(duì)CLBV-JX與其他寄主來源CLBV分離物的序列進(jìn)行了一致性和系統(tǒng)發(fā)育分析。CLBV-JX全長8 747 nt，編碼3個(gè)ORF。序列一致度比較結(jié)果顯示，CLBV-JX與來源于柑桔的分離物序列一致度高，核苷酸和氨基酸序列一致度均高于95.9%，這與Vives等[16]所得結(jié)果相同。CLBV-JX與來源于甜櫻桃和獼猴桃的分離物的一致性低，ORF1和ORF3編碼的氨基酸序列一致度最低，分別為79.4%和88.0%，特別是在3’端非編碼區(qū)，核酸一致度僅為62.7%，顯示出該病毒在不同寄主上的高度變異特性。項(xiàng)周等[15]和朱晨熹等[17]針對(duì)中國不同CLBV分離物的CP序列分析，發(fā)現(xiàn)其在不同寄主間也表現(xiàn)出較大的分子變異。本試驗(yàn)構(gòu)建的CLBV不同分離物全基因組的核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，所有柑桔來源CLBV分離物緊密聚為一支，并沒有明顯的地理差異，但與其他寄主來源分離物表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的系統(tǒng)發(fā)育距離。目前，對(duì)不同地區(qū)其他寄主來源的CLBV分離物報(bào)道不多。例如：獼猴桃在我國南方地區(qū)也有一定種植面積，但對(duì)寄主為南方獼猴桃的CLBV分離物研究相對(duì)較少；另外以芍藥為寄主的CLBV全基因序列還未有報(bào)道。因此，無法確定其他寄主來源CLBV分離物是否存在地理差異。不同寄主間核苷酸序列一致度低在類似病毒的相關(guān)研究中也有發(fā)現(xiàn)。如：趙磊[18]對(duì)已報(bào)道的所有蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)的CP基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)其在以蘋果、梨樹和柑桔為寄主的分離物間的核苷酸序列存在較大差異，但不同地域間的序列一致度沒有明顯差異；王利平等[19]發(fā)現(xiàn)，蘋果褪綠斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)群體具有遺傳多樣性，且不同分離物間親緣關(guān)系呈現(xiàn)一定的地域相關(guān)性。本研究表明，不同寄主來源CLBV分離物間的核苷酸和氨基酸序列差異較大，可能是因?yàn)镃LBV需要適應(yīng)不同寄主環(huán)境而發(fā)生了變異，此推測有待進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，對(duì)于CLBV全基因序列的地理差異，還需通過對(duì)其他寄主來源進(jìn)行深入研究。