李賽賽 李平 康楠 李芳赫 李家立

摘要 目的：探討連夏配方顆粒對心肌梗死大鼠室顫閾值和連接蛋白43（Cx43）重構(gòu)的影響。方法：通過結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支建立心肌梗死模型，將造模成功的大鼠隨機分為模型組、連夏配方顆粒高、中、低劑量組和美托洛爾組，另設(shè)假手術(shù)組。干預(yù)30 d后采用在體程控電刺激檢測大鼠室顫閾值;RT-PCR法檢測左心室心梗邊緣區(qū)P38mRNA、Cx43mRNA的表達;免疫組織化學染色檢測Cx43的密度和分布;酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠室顫閾值顯著降低，Cx43mRNA表達下降，分布紊亂，血清TNF-α的含量和心肌P38mRNA表達顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，連夏配方顆粒高、中劑量組大鼠室顫閾值提高（P<0.01，P<0.05），Cx43mRNA表達增加（P<0.05），Cx43分布改善，血清TNF-α的含量和心肌P38mRNA的表達顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：連夏配方顆?？商岣咝墓４笫笫翌濋撝?，其機制可能與減輕炎癥反應(yīng)，改善連接蛋白43重構(gòu)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 連夏配方顆粒;心肌梗死;連接蛋白43;室顫閾值

Effect of LianXia Formula Granule on Ventricular Fibrillation Threshold and Connexin 43 Remodeling in Rats with Myocardial Infarction

LI Saisai1，LI Ping1，KANG Nan2，LI Fanghe1，LI Jiali2

（1 Beijing University of Chinese Medicine，the Third Affiliated Hospital，Beijing 100029，China; 2 Affiliated Hospital of Jining Medical University，Jining 272029，China）

Abstract Objective：To investigate the effect of LianXia Formula Granule on ventricular fibrillation threshold and connexin 43（Cx43）remodeling in myocardial infarction rats.Methods：The model of myocardial infarction was established by ligating the left anterior descending coronary artery of the rat，and the successfully modeled rats were randomly divided into a model group，a Lianxia formula granule high，medium，and low dose group，and a metoprolol group，and a sham operation group.After 30 days of intervention，the ventricular fibrillation threshold was detected by in vivo programmed electrical stimulation; RT-PCR method was used to detect the expression of P38mRNA and Cx43mRNA in the marginal zone of left ventricular myocardial infarction; the density and distribution of Cx43 were detected by immunohistochemical staining; the content of serum TNF was detected by ELISA method.Results：Compared with the sham operation group，the ventricular fibrillation threshold of rats in the model group was significantly reduced，the expression of Cx43mRNA was decreased，the distribution was disordered，the content of serum TNF-α and the expression of myocardial P38mRNA were significantly increased（P<0.01）.Compared with the model group，the ventricular fibrillation threshold of rats in the high and medium dose groups of Lianxia formula particles increased（P<0.01，P<0.05），the expression of Cx43mRNA increased（P<0.05），the distribution of Cx43 was improved，and the level of serum TNF-α and the expression of P38mRNA in myocardium was significantly reduced（P<0.01）.Conclusion：LianXia Formula Granule can raise ventricular fibrillation threshold，and its mechanism is related to reducing inflammation and improving connexin 43 remodeling.

Keywords LianXia Formula Granule; Myocardial infarction; Connexin 43; Ventricular fibrillation threshold

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.008

急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）是嚴重威脅人類健康的常見心血管疾病。AMI后惡性室性心律失常（Ventricular Arrhythmia，VA）是AMI患者死亡的主要原因，因此，防治AMI后VAs具有重要的現(xiàn)實意義。連接蛋白43（Connexin43，Cx43）是心室表達最豐富的縫隙連接蛋白。心肌梗死后，Cx43的表達數(shù)量、分布和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了顯著性異常改變，稱為Cx43重構(gòu)[1-2]，影響電沖動在心室肌細胞間傳導(dǎo)的連續(xù)性、一致性，增加心律失常的誘發(fā)傾向。

連夏配方顆粒是李平教授根據(jù)黃連溫膽湯化裁而來，具有清熱化痰、寧心定悸的功效。我們前期研究證明，連夏配方顆粒能夠改善心肌梗死大鼠心臟自主神經(jīng)重構(gòu)[3]，有效減少腎上腺素誘導(dǎo)的實驗性大鼠心律失常的持續(xù)時間[4]。但是對連夏配方顆粒干預(yù)心肌梗死后室顫閾值的作用及連接蛋白43重構(gòu)的影響有待進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體（SPF）級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（京）2016-0006。實驗得到濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準。飼養(yǎng)環(huán)境清潔，室溫22～24 ℃，相對濕度45%～65%，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，光照周期12 h/12 h明暗交替。

1.1.2 藥物 連夏配方顆粒由黃連6 g、姜半夏6 g組成，均由北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院提供。根據(jù)人和動物等效劑量換算法計算得到：實驗大鼠連夏配方顆粒高劑量為189.00 mg/kg、連夏配方顆粒中劑量94.50 mg/kg、連夏配方顆粒低劑量47.25 mg/kg。酒石酸美托洛爾片（阿斯利康制藥有限公司，生產(chǎn)批號：190710）[5]。

1.1.3 試劑與儀器 4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，批號：P1110-100）;大鼠TNF-alpha ELISA試劑盒（RayBiotech公司，美國，批號：ELR-TNFA-1）;小鼠單克隆Connexin 43抗體（Abcam公司，英國，批號：ab11369）;HRP標記抗小鼠lgG（Easybio公司，美國，批號：80921227）;小動物呼吸機（上海奧爾科特生物有限公司，型號：ALC-V8S）;多導(dǎo)生理記錄儀（Adinstruments公司，澳大利亞，型號：PowerLab）;實時熒光定量PCR儀（ABI，美國，型號：QuantStudio 6）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 建立心肌梗死模型：采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制備心肌梗死大鼠模型[6]。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉45 mg/kg進行麻醉，備皮后經(jīng)口氣管插管連接小動物呼吸機，在第3～4肋骨之間逐層開胸，在左心耳下2 mm處用5-0手術(shù)線穿線并結(jié)扎左冠狀動脈前降支，結(jié)扎點以下的心肌組織變蒼白，心肌搏動減弱，逐層關(guān)胸，心電圖Ⅱ?qū)?lián)的ST段呈現(xiàn)弓背向上樣抬高作為評判手術(shù)成功的標志。假手術(shù)組平行手術(shù)操作，但只穿線不結(jié)扎。術(shù)后腹腔注射青霉素預(yù)防感染。術(shù)后24 h，將造模成功的50只存活大鼠隨機分為模型組、連夏配方顆粒高中低劑量組、美托洛爾組各10只，另設(shè)假手術(shù)組8只。

1.2.2 給藥方法 連夏配方顆粒高中低劑量組每日灌胃連夏配方顆粒分別為189.00 mg/kg、94.50 mg/kg、47.25 mg/kg;美托洛爾組每天灌胃酒石酸美托洛爾片24 mg/100 g，假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水灌胃，大鼠灌胃容積均為1 mL/100 g，1次/d，連續(xù)30 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 室顫閾值檢測 治療30 d后，采用在體程控電刺激方法檢測室顫閾值[7]。大鼠腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后連接氣管插管，連接PowerLab多導(dǎo)生理記錄儀，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。開胸暴露心臟，將刺激電極的正極置于心尖部，負極置于左室前壁右側(cè)心梗邊緣區(qū)，刺入深度約l mm，兩電極相距3 mm，刺激器發(fā)出的串刺激，每串10個刺激波，脈寬5 ms，刺激頻率30 Hz，初始刺激電壓1 V，增幅0.5 V，測量能夠誘發(fā)出室顫的最小刺激電壓，即為室顫閾值。

1.2.3.2 免疫組織化學檢測Cx43分布和表達 完成上述實驗后，將大鼠麻醉處死，在大鼠左心室心肌梗死邊緣區(qū)獲取心肌組織，置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋后制成厚度為4 μm的石蠟切片。經(jīng)二甲苯脫蠟、水化、抗原修復(fù)，滴加一抗（Cx43 1∶100）37 ℃孵育1 h，再滴加二抗室溫孵育20 min，加入DAB顯色液，自來水沖洗，蘇木精染色液孵育1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，凝膠樹酯封片。采用Image-ProPlus 6.0軟件分析，每張切片在心梗邊緣區(qū)隨機選取6個視野計算平均吸光度，求平均值作為各標本Cx43的表達值。

1.2.3.3 實時PCR檢測Cx43mRNA、P38mRNA轉(zhuǎn)錄水平 應(yīng)用Premier5.0軟件進行引物設(shè)計，Cx43引物：上游5′-GGCAAGGTGAAAATGAGGGG-3′，下游5′-AAAGCGAGAGACACCAAGGA-3′，長度242 bp;P38引物：上游5′-CACTGCTGCTTCCTCACTCCA-3′，下游5′-AGGGTTCAGGTGCTCTGTTCG-3′，長度：99 bp;GAPDH引物：上游5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，長度253 bp。采用trizol試劑進行RNA提取，并合成cDNA，再進行cDNA擴增。反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。PCR結(jié)束后獲取Ct值，并計算2-△△Ct值，分析表達差異。

1.2.3.4 ELISA檢測血清TNF-α含量 按照試劑盒說明書檢測大鼠血清TNF-α含量。于ELISA檢測儀450 nm處，以空白孔調(diào)零后測各孔吸光度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間比較用LSD法;若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則用非參數(shù)檢驗，組間比較用Kruskal-Wallis檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠室顫閾值比較 在體程控電刺激實驗，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠室顫閾值顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，連夏配方顆粒高劑量組和美托洛爾組室顫閾值顯著提高（P<0.01），連夏配方顆粒中劑量室顫閾值明顯提高（P<0.05），連夏配方顆粒低劑量組未見明顯降低（P>0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠心肌組織Cx43表達及分布比較 在免疫組織化學染色中Cx43被標記為棕褐色，細胞核被標記為淡藍色。假手術(shù)組可見Cx43表達量豐富，界線清晰，多數(shù)成粗線狀或短棒狀排列，分布有高度的規(guī)律性，主要位于心肌長軸方向垂直的細胞端-端連接處，即閏盤部位，少數(shù)分布在心肌細胞側(cè)-側(cè)連接處;模型組Cx43表達明顯減少，分布紊亂，呈細點狀排列，多數(shù)彌散分布于胞質(zhì)中，少量分布于細胞膜附近，與假手術(shù)組比較，模型組Cx43陽性表達的平均光密度顯著降低（P<0.01）;連夏配方顆粒高、中劑量組和美托洛爾組Cx43表達明顯增加，分布比較整齊，大部分界線清晰，成線狀排列，與模型組比較，連夏配方顆粒高、中劑量組和美托洛爾組Cx43陽性表達的平均光密度顯著增加（P<0.01）;連夏配方顆粒低劑量組Cx43表達增加，分布尚整齊，界線尚清晰，與模型組比較，連夏配方顆粒低劑量組Cx43陽性表達的平均光密度明顯增加（P<0.05）。見圖1，表2。

2.3 各組大鼠心肌組織Cx43mRNA和P38mRNA表達比較 與假手術(shù)組比較，模型組左心室心肌梗死邊緣區(qū)Cx43mRNA的表達顯著下降（P<0.01）;與模型組比較，美托洛爾組Cx43mRNA表達顯著升高（P<0.01），連夏配方顆粒高、中劑量組Cx43mRNA表達明顯升高（P<0.05），連夏配方顆粒低劑量組未見明顯降低（P>0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心梗邊緣區(qū)P38mRNA的表達顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，連夏配方顆粒高中低劑量組和美托洛爾組的P38mRNA表達有不同程度的下降（P<0.01，P<0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠血清TNF-α含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，連夏配方顆粒高、中、低劑量組和美托洛爾組大鼠血清TNF-α均顯著降低（P<0.01），差異有統(tǒng)計學意義。見表4。

3 討論

Cx43是心室縫隙連接通道最主要的構(gòu)成成分，在正常心室肌細胞中呈簇狀分布，以細胞端對端分布為主，介導(dǎo)心肌細胞電信號和化學信號的傳遞[8]。心肌梗死后Cx43發(fā)生了重構(gòu)現(xiàn)象心肌細胞Cx43表達水平顯著降低，并且紊亂分布于細胞側(cè)-側(cè)連接處，形成了心肌梗死后心律失常的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，Cx43表達減少程度與傳導(dǎo)速度負相關(guān)，Cx43在心肌細胞的不均勻分布造成了電傳導(dǎo)的不連續(xù)性和各向異性[10]。Cx43重構(gòu)是心肌梗死后心律失常發(fā)生的重要因素。因此，改善Cx43重構(gòu)是防治心肌梗死后室性心律失常的潛在干預(yù)靶點。

研究表明，諸多炎癥介質(zhì)參與調(diào)節(jié)心臟Cx43重構(gòu)。炎癥反應(yīng)是心肌梗死病理過程的基本特征，TNF-α是人體主要的炎癥介質(zhì)，在正常心臟中不表達或很少表達，心肌發(fā)生炎癥反應(yīng)時，TNF-α大量釋放，能夠加劇心肌細胞Cx43的降解[11]。有學者研究，TNF-α可能通過P38MAPK激酶信號通路調(diào)控Cx43的表達[12]。Surinkaew等[13]研究顯示，在心肌缺血時，p38MAPK被激活，能夠減少Cx43表達，進一步影響縫隙連接功能，進而導(dǎo)致心律失常的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清TNF-α和心肌P38mRNA表達水平顯著升高，Cx43mRNA表達顯著下降，免疫組化結(jié)果也提示心肌Cx43分布紊亂，在體程控電刺激提示室顫閾值降低，這一結(jié)果與前期研究相一致。

連夏配方顆粒由黃連與姜半夏兩味藥組成，專為冠心病痰熱證而立。黃連清心熱、瀉心火，姜半夏降逆氣、化痰濁，全方寒溫并治，辛開苦降，藥少力專，共奏清熱化痰、寧心定悸之功。現(xiàn)代藥理研究表明，黃連具有抗心律失常、抗炎、抗凋亡、降血糖、改善心肌缺血缺氧狀態(tài)等作用[14-15]。半夏具有抗炎、抗心肌缺血、抗心律失常、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、鎮(zhèn)靜等作用[16]。本研究結(jié)果表明，連夏配方顆粒高、中劑量組能夠提高心肌梗死大鼠室顫閾值，增加Cx43mRNA的表達，改善Cx43的分布，減少了血清TNF-α的含量和心肌P38mRNA的表達。從而推測，連夏配方顆粒應(yīng)用具有提高室顫閾值的作用，其機制可能與減輕炎癥反應(yīng)，改善Cx43重構(gòu)有關(guān)。

有報道，心肌梗死后自主神經(jīng)活性的改變對Cx43重構(gòu)有重要作用[17]。我們團隊基礎(chǔ)實驗證實連夏配方顆粒能夠調(diào)節(jié)心肌梗死后大鼠自主神經(jīng)[3]，提示連夏配方顆粒提高室顫閾值可能與改善自主神經(jīng)功能亦有關(guān)系，信號通路之間有復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，下一步可通過免疫組織化學等方法研究心臟自主神經(jīng)與Cx43之間的相關(guān)性及連夏配方顆粒的干預(yù)療效，進一步深入探討連夏配方顆粒提高室顫閾值的作用機制。

參考文獻

[1]王糧山，顧承雄.心肌梗死后縫隙連接蛋白43重構(gòu)與室性心律失常[J].中國循環(huán)雜志，2015，30（11）：1120-1122.

[2]Zhang Q，Bai X，Liu Y，et al.Current Concepts and Perspectives on Connexin43：A Mini Review[J].Curr Protein Pept Sci，2018，19（11）：1049-1057.

[3]李家立.連夏配方顆粒對心肌梗死后大鼠心臟自主神經(jīng)重構(gòu)的影響[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2015.

[4]殷銘，郭輔定，劉志豪，等.經(jīng)皮耳緣迷走神經(jīng)刺激改善阿霉素誘導(dǎo)大鼠心電活動異常的研究[J].中國醫(yī)藥，2021，16（3）：456-459.

[5]黃繼漢，黃曉暉，陳志揚，等.藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算[J].中國臨床藥理學與治療學，2004，9（9）：1069-1072.

[6]王蕾，趙明鏡，楊濤，等.從心電圖和超聲心動圖相關(guān)性分析研究心肌梗死后心衰模型的早期評價和篩選方法[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15（22）：2816-2820.

[7]董玢，劉涓，婁利霞，等.補腎生血解毒方對再生障礙性貧血小鼠紅細胞生成相關(guān)細胞因子表達的影響[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2014，37（6）：397-400，409.

[8]Tribulová N，Knezl V，Okruhlicová L，et al.Myocardial gap junctions：targets for novel approaches in the prevention of life-threatening cardiac arrhythmias[J].Physiol Res，2008，57（2）：S1-S13.

[9]柏林，王婷.間隙連接蛋白43與缺血性心律失常的關(guān)系進展[J].心臟雜志，2017，29（5）：592-594.

[10]Schulz R，Grge PM，Grbe A，et al.Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury，cardioprotection and neuroprotection[J].Pharmacol Ther，2015，153：90-106.

[11]Eugenín EA，Braes MC，Berman JW，et al.TNF-alpha plus IFN-gamma induce connexin43 expression and formation of gap junctions between human monocytes/macrophages that enhance physiological responses[J].J Immunol，2003，170（3）：1320-1328.

[12]Salameh A，Schneider P，Mühlberg K，et al.Chronic regulation of the expression of gap junction proteins connexin40，connexin43，and connexin45 in neonatal rat cardiomyocytes[J].Eur J Pharmacol，2004，503（1-3）：9-16.

[13]Kumphune S，Surinkaew S，Chattipakorn SC，et al.Inhibition of p38 MAPK activation protects cardiac mitochondria from ischemia/reperfusion injury[J].Pharm Biol，2015，53（12）：1831-1841.

[14]胡誠毅，莫志賢.黃連素的藥理作用及機制研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（20）：213-219.

[15]鄭洪艷，徐為人.小檗堿藥理作用研究進展[J].中草藥，2004，35（6）：708-711.

[16]王恩宇，王景輝，丁芮，等.“黃連-半夏”藥對治療胃癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學研究和實驗驗證[J].中國中藥雜志，2020，45（8）：1779-1788.

[17]陽元彬.培哚普利對大鼠心肌梗死邊緣區(qū)Cx43及MMP-7表達的影響[D].重慶：重慶醫(yī)科大學，2009.

（2020-05-18收稿 責任編輯：王明）