李彩艷 張玉鑫 袁慧敏 孫開元 湯陽 張淑靜 高譽珊 孫燕 鄭豐杰 李宇航

摘要 目的：探討麻黃連翹赤小豆湯對特應性皮炎（AD）小鼠皮損修復及PAR-2、TRPA1的表達的影響。方法：選用SPF級雄性BALB/c小鼠48只，隨機分為正常組、模型組、激素組、中藥組。除正常組外，各組用2，4二硝基氟苯（DNFB）誘導AD模型。造模后模型組給予皮炎平外抹，中藥組給予麻黃連翹赤小豆湯灌胃，其余均給予等量蒸餾水灌胃，2次/d，共7 d。于第1、15、31、37天觀察小鼠一般狀態(tài)及搔抓行為并統(tǒng)計，HE染色觀察致敏區(qū)域的皮膚病理變化，qRT-PCR、免疫組化分別檢測皮膚中PAR-2、TRPA1的基因與蛋白表達。結果：與正常組比較，模型組小鼠搔抓頻次顯著增多，致敏皮膚處有明顯紅斑滲出，局部潮紅，皮膚增厚，伴有結痂。中藥組、激素組較模型組明顯改善。病理顯示模型組較正常組棘層明顯增厚，角化珠增多，毛囊結構明顯增多，角化層明顯增厚，見炎性細胞浸潤，表皮不平整;激素組、中藥組角化層及棘層增厚，角化珠及毛囊結構略有增多，較模型組改善明顯。模型組小鼠皮膚組織中PAR-2、TRPA1的mRNA的表達較正常小鼠均顯著性上調(diào)（P<0.05），經(jīng)過中藥、激素干預后，其表達均下調(diào)顯著（P<0.01）。與正常組比較，模型組皮膚組織PAR-2、TRPA1免疫反應陽性均明顯增多，角質(zhì)形成細胞處最為顯著;中藥組、模型組表達較模型組均有所降低。結論：麻黃連翹赤小豆湯改善AD皮損、減輕皮膚瘙癢，下調(diào)PAR-2、TRPA1的表達，進而調(diào)控非組胺依賴性神經(jīng)信號傳導有關。

關鍵詞 特應性皮炎;非組胺依賴性瘙癢;麻黃連翹赤小豆湯;蛋白酶活化受體

Effect of Mahuang Lianqiao Chixiaodou Decoction on the Expression of PAR-2 and TRPA1 in Sensitized Tissues of Atopic Dermatitis Mice

LI Caiyan，ZHANG Yuxin，YUAN Huimin，SUN Kaiyuan，TANG Yang，ZHANG Shujing，GAO Yushan，SUN Yan，ZHENG Fengjie，LI Yuhang

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To investigate the effects of Mahuang Lianqiao Chixiaodou Decoction on skin repair and expression of PAR-2 and TRPA1 in mice with atopic dermatitis（AD）.Methods：A total of 48 SPF male BALB/c mice were randomly divided into a normal group，a model group，a hormone group and a traditional Chinese medicine group.Except for the normal group，AD models were induced by 2，4 dinitrofluorobenzene（DNFB）.After modeling，the model group was given Piyanping external application，the traditional Chinese medicine group was given Mahuang Lianqiao Chixiaodou Decoction for intragastric administration，and the rest were given the same amount of distilled water intragastric administration，twice a day with a total of 7 days.On the 1st，15th，31st and 37th day，the general state and scratching behavior of mice were observed，and the pathological changes of sensitized areas were observed by HE staining.The gene and protein expressions of PAR-2 and TRPA1 in skin were detected by qRT-PCR and immunohistochemistry respectively.Results：Compared with the normal group，the scratching frequency of the model group mice increased significantly，and the sensitized skin had obvious erythema exudation，local flushing，skin thickening and scab formation.Compared with the model group，the traditional Chinese medicine group and the hormone group improved significantly.Pathological examination showed that the spinous layer of the model group was significantly thicker than that of the normal group，keratinized beads were increased，hair follicle structure was significantly increased，keratinized layer was significantly thicker，inflammatory cell infiltration and epidermal irregularity were observed.Keratinized layer and spinous layer were thicker in the hormone group and the traditional Chinese medicine group，and keratinized beads and hair follicle structure were slightly increased，which was significantly improved compared with the model group.The expression of PAR-2 and TRPA1 in skin tissue of the model group was significantly higher than that of the normal group（P<0.05）.After intervention with Chinese medicines and hormones，the expression of PAR-2 and TRPA1 was significantly decreased（P<0.01）.Compared with the normal group，PAR-2 and TRPA1 immunoreactivity in the skin tissue of the model group increased significantly，especially in keratinocytes.The expression of PAR-2 and TRPA1 in the traditional Chinese medicine group and the model group was lower than that in the model group.Conclusion：Mahuang Lianqiao Chixiaodou Decoction can improve AD skin lesion，relieve skin itching，down-regulate the expression of PAR-2 and TRPA1，and then regulate non-histamine dependent nerve signal transduction.

Keywords Atopic dermatitis; Non-histamine-dependent pruritus; Mahuang Lianqiao Chixiaodou Decoction; Protease activated receptor

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.011

特應性皮炎（Atopic Dermatitis，AD），又稱異位性皮炎、特應性濕疹，是由遺傳因素和環(huán)境因素交互作用引起的慢性、復發(fā)性、炎癥性皮膚病，主要臨床表現(xiàn)為劇烈瘙癢、濕疹樣皮損和皮膚干燥等，并伴有鼻炎或哮喘等過敏性疾病病史[1-2]。近年來，AD發(fā)病人群逐年升高，有效治療的缺乏、強烈的瘙癢和皮疹等嚴重影響生命質(zhì)量[3]。AD相關瘙癢是多種因素相互作用的結果，其確切機制尚不清楚。研究表明，非組胺依賴性瘙癢神經(jīng)信號傳導與瞬間電壓感受體1（Transient Receptor Potential Ankyrin 1，TRPA1）通道偶聯(lián)通路密切相關，而蛋白酶活化受體2（Protease Activated Receptor，PAR-2）作為非組胺依賴型致敏機制信號傳導通路的關鍵分子，在AD瘙癢發(fā)生過程中起關鍵作用[4]。

麻黃連翹赤小豆湯為表里雙解之劑，外可解表邪郁遏，內(nèi)能清濕熱蘊結，開鬼門、潔凈府兼而有之，被廣泛用于AD、濕疹、蕁麻疹、痤瘡、環(huán)形紅斑等皮膚瘙癢癥的辨證治療[5]，療效確切。對于其效應機制，馬世忠等[6]曾觀察其對組胺誘導豚鼠皮膚局部瘙癢、右旋糖酐誘導小鼠全身瘙癢模型的影響，但非組胺依賴性瘙癢相關機制尚未見報道。本實驗通過觀察麻黃連翹赤小豆湯對半抗原反復刺激誘導AD小鼠模型皮損的影響，并從PAR-2、TRPA1的表達來探討其非組胺依賴性抗瘙癢機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6周齡，SPF級BALB/c小鼠，體質(zhì)量（20±2）g、雄性，48只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2006-0006，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物房。動物房溫度（24±1）℃，濕度（45±10）%，由國家標準固體混合飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水，實行12 h晝夜規(guī)律調(diào)整。

1.1.2 藥物 《傷寒論》麻黃連翹赤小豆湯由“麻黃二兩、連翹二兩、赤小豆一升、生梓白皮一升、苦杏仁四十枚、生姜二兩、大棗十二枚、炙甘草二兩”組成。本課題組前期經(jīng)考證實測，得出其現(xiàn)今臨床參考劑量為麻黃6 g、連翹6 g、苦杏仁3 g、赤小豆34 g、大棗7 g、生梓白皮11 g、生姜6 g、炙甘草6 g[7]，方中連翹（即連翹根）、生梓白皮，現(xiàn)今藥店不備，臨床多分別用連翹、桑白皮代之[8-9]，中藥材全部購置于北京同仁堂藥店。浸泡、常規(guī)水煎2次，80 ℃水浴濃縮至1 g/mL（含生藥），4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 2，4-二硝基氟苯（DNFB）（Sigma公司，美國，批號：M24218031），丙酮（國產(chǎn)分析純，北京化工廠，批號：20170209），以丙酮為溶劑配置DNFB致敏溶液，皮炎平[華潤三九（南昌）藥業(yè)有限公司，國藥準字H20080010]，蘇木素染色液（中杉金橋，貨號：ZLI-9610），伊紅染色液（中杉金橋，貨號：ZLI-9613），中性樹膠（索萊寶科技有限公司，貨號：G8590），PAR-2抗體（Abcam，英國，貨號：ab180953），TRPA1抗體（Abcam，英國，貨號：ab62053）;免疫組化檢測試劑盒（中杉金橋，貨號：SP-9001），DAB顯色試劑盒（中杉金橋，貨號：ZLI-9019）。Trizol、反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒（Thermo Scientific公司，美國，貨號：K1622），Power sybr green（ABI公司，美國，貨號：4367659）。石蠟包埋機（Leica Biosystems，德國，型號：HistoCoreArcadia），石蠟切片機（Leica Biosystems，德國，型號：RM2245），攝像頭（奧速，型號：V80），紫外分光光度計（IMPLEN公司，德國，型號：NanoPhotometer），定量PCR檢測儀（ABI公司，美國，型號：272005354）;正倒置一體熒光顯微鏡（Echo公司，美國，型號：Revolve FL）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 適應性喂養(yǎng)7 d后，將小鼠隨機分為空白對照組（正常組）、AD模型組（模型組）、麻黃連翹赤小豆湯組（中藥組）、皮炎平觀察組（激素組），每組12只。采用2，4二硝基氟苯（DNFB）半抗原反復刺激的方法制備小鼠AD模型[10]。具體如下：DNFB致敏前1 d，用電推剪和脫毛霜剃去小鼠背部毛發(fā)，面積約2.0 cm×3.0 cm。在2 cm×2 cm的紗布上滴涂1%的DNFB溶液（橄欖油/丙酮1∶3混合制成基質(zhì)溶液，配制1%的DNFB致敏溶液）200 μL，然后均勻涂抹在小鼠背部皮膚，2次/周（即造模開始第1、4、8、11天）。2周后，改用0.2%的DNFB溶液致敏刺激，2次/周重復上述操作，持續(xù)3周（即第15、18、21、25、28、32、35天），DNFB半抗原致敏刺激共持續(xù)5周（模型制備操作流程如圖1所示）。對照組小鼠采用丙酮溶液涂抹小鼠皮膚，時間頻率和模型組相同。

1.2.2 給藥方法 中藥組于第31天灌服麻黃連翹赤小豆湯;正常組、模型組、激素組灌服等量溫開水;激素組外用皮炎平涂抹。2次/d，連續(xù)7 d。按人鼠劑量換算公式計算出小鼠用量為11.86 g/kg[11]。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 小鼠搔抓行為觀察 實驗過程中，按照Kuraishi方法[12]，分別于第1、15、31、37天，用攝像機記錄并觀察小鼠搔抓行為，觀察小鼠前后肢對頭面部、背部、腹部的搔抓行為，統(tǒng)計各組小鼠30 min內(nèi)的搔抓次數(shù)。

1.2.3.2 小鼠背部皮損改變情況 肉眼觀察各組小鼠背部皮損程度，包括出血、水腫、表皮脫落和鱗屑（干燥）情況，并拍照記錄。

1.2.3.3 皮損組織病理學觀察 取各組小鼠背部皮膚1.0 cm×1.0 cm大小，10%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片、HE染色，顯微鏡下觀察，記錄并拍照存檔。

1.2.3.4 皮膚PAR-2、TRPA1免疫組織化學檢測?? 取各組小鼠背部皮膚，10%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4～5 μm厚度連續(xù)切片，采用SABC法進行免疫組織化學檢測。

1.2.3.5 qRT-PCR法檢測皮損組織PAR-2、TRPA1 mRNA表達 采用液氮研磨和Trizol方法提取皮膚組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，以總RNA為模板，按照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的合成，以Sybr Green作為熒光標志物進行PCR。反應條件為：預變性（95 ℃ 10 min），PCR（40個循環(huán);95 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s;）;增加熔解曲線：60 ℃→95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃。所有反應均設立3個復孔，以GAPDH為內(nèi)參照，結果采用2-△△Ct值表示。具體引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均值±標準差（Mean±SD）表示，多組間兩兩比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行統(tǒng)計學分析，LSD檢驗進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠搔抓行為觀察 各組小鼠在第1天時30 min搔抓次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;AD模型小鼠在造模后第15、31天，其30 min搔抓次數(shù)均顯著高于正常組（P<0.01）;經(jīng)藥物干預后，激素組與中藥組小鼠的搔抓頻次較AD模型組顯著性降低（均P<0.01）。見圖2。

2.2 小鼠皮損觀察 AD模型小鼠背部見增厚性皮損、紅斑、脫屑明顯、棕紅色色素沉著，部分皮損處可見結痂。麻黃連翹赤小豆湯和激素治療后，紅斑、滲出基本減輕或消失，痂皮大多脫落。見圖3。

2.3 對小鼠皮膚損傷的病理學影響 正常組棘層細胞層較?。?～2層）。AD模型組棘層細胞層明顯增厚，角化珠增多，毛囊結構明顯增多，角化層明顯增厚，見炎性細胞浸潤，表皮不平整;中藥組角化層及棘層細胞層增厚，角化珠及毛囊結構略有增多，較模型組改善明顯。見圖4。

2.4 對小鼠PAR-2、TRPA1的蛋白表達的影響?? PRR-2、TRPA1的免疫反應陽性呈現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒。與正常組比較，模型組皮膚組織PAR-2、TRPA1免疫反應陽性均明顯增多，角質(zhì)形成細胞處最為顯著;激素組、中藥組表達較模型組均有所降低。見圖5。

2.5 對小鼠PAR-2、TRPA1的基因表達的影響?? 模型組小鼠皮膚組織中PAR-2的mRNA的表達較正常小鼠顯著性上調(diào)（P<0.05），經(jīng)過中藥干預后，其表達下調(diào)顯著（P<0.01）;激素組PAR-2的表達較模型組顯著下調(diào)（P<0.05），與中藥組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。如圖6（B）所示，模型組小鼠皮膚組織中的TRPA1的基因表達較正常小鼠顯著性上調(diào)（P<0.05），中藥組與模型組比較，其TRPA1的表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。激素組的TRPA1的表達與模型組、中藥組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。見圖6。

3 討論

AD是一種慢性皮膚瘙癢和炎癥性疾病，常自嬰幼兒發(fā)病，其患病率在發(fā)達國家兒童中高達15%～20%，成人為2%～10%;我國1～7歲兒童AD患病率為12.94%，成人為4.6%，并呈逐年升高趨勢[13-14]。AD引發(fā)的皮膚瘙癢不可忍受并且難以治愈，還常合并哮喘、過敏性鼻炎和食物過敏，對細菌和病毒感染易感性增加，具有罹患焦慮、抑郁、注意力缺陷多動障礙等疾病傾向，嚴重影響患者身心健康，已成為日益嚴重的世界性公共健康問題[15]。盡管當前有多種針對AD瘙癢的治療方案，如光療、藥物治療等，但部分患者仍存在廣泛的皮膚損傷與強烈瘙癢，缺乏針對疾病關鍵機制的有效治療手段是其主要原因。

瘙癢的發(fā)病原因和病理機制十分復雜。目前比較公認的引發(fā)癢覺的特異性神經(jīng)通路至少包括組胺依賴性神經(jīng)（機械不敏感C纖維）通路和非組胺依賴性神經(jīng)（機械熱敏感C纖維）通路。Schmelz等[16]證實C-神經(jīng)纖維中存在的對壓力刺激不敏感，而對組胺等化學物質(zhì)刺激持續(xù)敏感的亞單位是瘙癢信號的特定傳導通路，組胺選擇性作用于組胺受體可引發(fā)皮膚瘙癢。Johanek等[17]發(fā)現(xiàn)發(fā)癢藜豆誘導的瘙癢可通過辣椒素敏感傳入神經(jīng)纖維傳導引發(fā)，而抗組胺劑對其瘙癢無拮抗作用，證實了非組胺依賴性效應途徑的存在。進一步研究發(fā)現(xiàn)，非組胺依賴性瘙癢神經(jīng)信號傳導與TRPA1通道偶聯(lián)通路密切相關，PAR-2作為這一信號通路的關鍵分子，可激活磷脂酶C，敏化瞬間電壓感受體TRPA1通道，導致背角神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細胞膜去極化，通過脊髓丘腦束傳導癢覺信號至中樞的軀體感覺皮層[18]。致敏化的TRPA1可使得機體對生理性或亞生理性的內(nèi)外環(huán)境的改變激活而產(chǎn)生傷害性感覺，這恰好與臨床上慢性瘙癢的核心癥狀——癢覺過敏、自發(fā)性瘙癢（溫熱癢）等密切相關。因此，探索針對PAR-2與TRPA1的調(diào)控的藥物研究可能是治療AD的重要途徑。

眾所周知，中醫(yī)講求“辨證論治”，“辨證”在前，“論治”在后。AD屬中醫(yī)“乳癬”“奶癬”“胎斂瘡”等病證范疇，歷代醫(yī)家對其病因病機有著豐富的論述，多認為本病因先天稟賦不足，胎毒遺熱或后天調(diào)攝不當，脾失健運，生濕化熱，復感風濕熱邪，蘊結肌膚，內(nèi)外合邪而發(fā)病[19]。麻黃連翹赤小豆湯見于《傷寒論·辨陽明病脈證并治篇》，具有解表散熱，清熱利濕解毒之功，主治傷寒瘀熱在里發(fā)黃之證。方中連翹，宋本《傷寒論》原文注云“連翹根是”，現(xiàn)今臨床多代以連翹，因而也被稱為麻黃連翹赤小豆湯。現(xiàn)今臨床廣泛應用本方治療水腫、AD、濕疹及過敏性疾病，證屬濕熱熏蒸于表者。如周芳等[20]用麻黃連翹赤小豆湯加減（名為“抗敏一號”）治療青少年及成人AD，可明顯改善AD皮損及瘙癢，療效優(yōu)于開瑞坦;本課題組也常用本方治療AD、濕疹等皮膚病，屢獲良效。

有關麻黃連翹赤小豆湯治療AD的效應機制，目前尚未見報道，僅有抗變態(tài)反應等相關研究，如邱明義等[21]、陳建等[22]發(fā)現(xiàn)本方可抵抗組胺引起的瘙癢、抑制IgE產(chǎn)生和肥大細胞脫顆粒。本實驗結果表明，麻黃連翹赤小豆湯可降低AD模型小鼠搔抓行為、有效改善模型小鼠皮損改變，進一步確證了本方治療AD及其引發(fā)的皮膚瘙癢的有效性。本實驗結果還證實，麻黃連翹赤小豆湯可下調(diào)AD皮損組織中PAR-2與TRPA1的基因與蛋白表達，提示該方改善皮損減輕瘙癢可能與影響上述環(huán)節(jié)，進而調(diào)控非組胺依賴性神經(jīng)信號傳導有關，為闡明麻黃連翹赤小豆湯防治AD的現(xiàn)代生物學機制與調(diào)控靶點奠定了基礎。

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（2020-06-28收稿 責任編輯：王明）