蔣香云，朱 麗，陳 勇，劉占軍*

（1.華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山 063201；2.南通大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南通 226001）

鹽酸青藤堿是從青風(fēng)藤中提取出的單體生物堿，在祛風(fēng)除濕、消腫止痛等方面具有較好療效［1-2]，但其口服絕對生物利用度僅30%左右，并會引起白細(xì)胞減少等不良反應(yīng)［3-4]。透皮給藥可靶向遞送藥物，避免肝首過效應(yīng)，從而減輕藥物的系統(tǒng)性不良反應(yīng)［5-6]。鹽酸青藤堿的游離堿型具有適中的相對分子質(zhì)量（329.4）、較低的熔點(diǎn)（161 ℃）、適宜的油水分配系數(shù)（log P 1.24），已有報道將其制成被動透皮制劑，用于局部鎮(zhèn)痛和抗風(fēng)濕［7]。

透皮離子導(dǎo)入可使藥物快速吸收［8-9]，這對治療局部肌肉酸痛、關(guān)節(jié)炎癥極為有利。鑒于鹽酸青藤堿本身理化性質(zhì)（溶解度約為9%，可在生理pH 條件下充分解離）［10]，已有報道通過對其施加20 mA 電流進(jìn)行離子導(dǎo)入透皮遞送［11]，但電流強(qiáng)度一般不得超過0.5 mA/cm2，否則會產(chǎn)生嚴(yán)重的皮膚灼傷。因此，本實驗通過對皮膚施加生理可接受的電流強(qiáng)度，探討離子導(dǎo)入技術(shù)在鹽酸青藤堿透皮促進(jìn)作用中的影響因素。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（配置717 plus 型自動進(jìn)樣器、2487 型紫外檢測器、1525 型二元高壓泵、Empower 色譜工作站，美國Waters 公司）；UV-2550 型紫外可見分光光度計（日本Shimadzu 公司）；FiveEasy 型實驗室PH 計（瑞士Mettler-Toledo 公司）；雙臂垂直式Franz 滲透池（擴(kuò)散面積2.0 cm2，南通科華玻璃儀器廠）；APH 1000M 型穩(wěn)壓直流電源（美國Kepco 公司）；6727-C10 型Stadie-Riggs 組織切刀（美國Thomas Scientific 公司）。

1.2 試劑與藥物 鹽酸青藤堿（陜西森弗生物技術(shù)有限公司，純度≥99%，批號SF15082105）；2-嗎啉乙磺酸（MES）、Ag/AgCl 電極（美國Sigma公司）。甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水（美國Milli-Q 超純水儀生產(chǎn)）。

1.3 動物 新鮮豬耳，取自尤卡坦型生豬［體質(zhì)量約100 kg，南通市永興生豬場，合格證號（蘇通）動防合字第20150028 號]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；EasyGuard C18保護(hù)柱（4.0 mm×10 mm，5 μm）；流動相10 mmol/L 磷酸氫二鉀緩沖液（磷酸調(diào)pH 至3.0）-甲醇（30∶70）；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長264 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 線性關(guān)系考察 用“2.1”項下流動相配制不同質(zhì)量濃 度（0.5、2、10、50、100、200、500 μg/mL）對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以鹽酸青藤堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積 為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y=157.226X+45.161（r=0.999 8），在0.5～500 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。分別以信噪比約3、10 時所對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測限、定量限，測得鹽酸青藤堿兩者分別為0.10、0.26 μg/mL。

2.3 專屬性試驗 取適量空白皮膚于生理鹽水中浸泡5 min，取出后吸干水分并剪碎，加入10 mL純水，攪拌60 min 后0.45 μm 微孔尼龍濾膜過濾，取續(xù)濾液，得到空白皮膚提取液。取空白皮膚提取液、100 μg/mL 對照品溶液、離子導(dǎo)入鹽酸青藤堿后接收池溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，空白皮膚提取液雜質(zhì)峰對鹽酸青藤堿峰（保留時間約6 min 處）測定無干擾。

圖1 鹽酸青藤堿HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of sinomenine hydrochloride

2.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液適量，用“2.1”項下流動相稀釋成低、中、高質(zhì)量濃度（0.5、5、50 μg/mL），每個質(zhì)量濃度平行3 份，同一天內(nèi)在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸青藤堿日內(nèi)精密度RSD 分別為1.58%、1.32%、0.90%；連續(xù)測定3 d，測得日間精密度RSD 分別為1.95%、1.53%、1.12%，表明該方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗 精密稱取鹽酸青藤堿對照品25 mg，置于500 mL 量瓶中，用“2.1”項下流動相溶解并定容至刻度，作為供試品溶液，平行6份，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸青藤堿含量RSD 為1.69%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.5”項下供試品溶液1份，室溫下于0、1、2、4、6、8 h 在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸青藤堿峰面積RSD為0.67%，表明溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗 精密吸取對照品溶液適量，用空白皮膚提取液稀釋成低、中、高質(zhì)量濃度（0.5、5、50 μg/mL），每個質(zhì)量濃度平行3 份，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，鹽酸青藤堿平均加樣回收率分別為98.2%、99.1%、99.6%，RSD 分別為1.74%、1.23%、1.05%。

2.8 穩(wěn)定性影響因素研究

2.8.1 pH 值 精密稱取鹽酸青藤堿對照品25 mg，置于50 mL 量瓶中，分別用10 mmol/L MES 緩沖液（氫氧化鈉溶液調(diào)pH 至5.5）、pH 7.4 的PBS緩沖液（含氯化鈉8.0 g/L、磷酸二氫鉀0.2 g/L、磷酸氫二鈉2.9 g/L、氯化鉀0.2 g/L）稀釋定容至刻度，搖勻，室溫下保存2、4、8 h 后取樣，用“2.1”項下流動相稀釋，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算鹽酸青藤堿含量。結(jié)果，鹽酸青藤堿含量在MES、PBS 緩沖液中8 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，8 h后的剩余質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.96%、99.81%。因此，后續(xù)采用MES 緩沖液（pH 5.5）配制鹽酸青藤堿作為給藥池溶液，并以PBS 緩沖液為接收介質(zhì)。

2.8.2 電流 參考文獻(xiàn)［8] 報道，精密稱取鹽酸青藤堿對照品250 mg，置于25 mL 量瓶中，MES 緩沖液（pH 5.5）溶解定容至刻度，精密移取5 mL 至玻璃樣品瓶中，樣品瓶之間、樣品瓶與陽極池或陰極池（陽極池、陰極池均含20 mL PBS緩沖液）之間都以鹽橋（將3% 瓊脂糖溶于0.1 mol/L氯化鈉溶液，注入硅膠管冷卻固化后形成）依次連接，以保持電路連通。

離子導(dǎo)入透皮給藥的電流一般不超過0.5 mA/cm2，作用時間也維持在數(shù)分鐘到數(shù)小時之內(nèi)，以避免產(chǎn)生皮膚刺激。本實驗通過Ag/AgCl電極連接直流電源，開通電流1.0 mA，于2、4、8 h后取樣，用“2.1”項下流動相稀 釋，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算鹽酸青藤堿含量。結(jié)果，鹽酸青藤堿在1.0 mA 電流下8 h 內(nèi)僅發(fā)生輕微降解，實驗結(jié)束時其剩余質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.12%，表明電流穩(wěn)定性可以滿足離子導(dǎo)入要求。

2.8.3 皮膚組織 參考文獻(xiàn)［12] 報道，取新鮮豬皮，分別將其表皮側(cè)或真皮側(cè)向上，以檢驗鹽酸青藤堿對兩者的穩(wěn)定性。垂直式Franz 擴(kuò)散池固定，接收池中不加入液體［13]，供給池中加入含10 mg/mL鹽酸青藤堿的MES 緩沖液1 mL（pH 5.5），于2、4、8 h 后取樣，用“2.1”項下流動相稀釋后，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算鹽酸青藤堿含量。結(jié)果，鹽酸青藤堿含量在與新鮮豬表皮接觸8 h 后基本保持穩(wěn)定（99.37%），而與新鮮豬真皮接觸8 h 后僅逐漸發(fā)生輕微水解（97.27%），表明該成分在透皮遞送過程中可基本保持穩(wěn)定。

2.9 體外透皮遞送研究

2.9.1 方法 取新鮮豬耳，洗凈后將其皮膚和軟骨組織分離，用Stadie-Riggs 組織切刀除去皮下脂肪組織和部分不規(guī)則真皮組織，得到厚度約為1 mm的皮膚組織。用沖壓模具取圓形皮膚組織，直徑約3 cm，將其放入-80 ℃冰箱中冷藏備用，處理過程中應(yīng)保證角質(zhì)層的完整性。通過雙臂垂直式Franz 擴(kuò)散池（有效擴(kuò)散面積為2 cm2），將皮膚固定在供給池與接收池之間，表皮側(cè)向上，接收池中加入磁力攪拌子及12 mL PBS 緩沖液，保證皮膚真皮側(cè)與接收液之間無氣泡。將擴(kuò)散池置于恒溫循環(huán)水透皮擴(kuò)散儀中，保證接收池大部分浸沒在水面以下，控制溫度32 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。實驗開始前，供給池加入1 mL PBS 緩沖液，平衡30 min 后用移液槍吸出，純水沖洗供給池3 次，加入供試液1 mL，每小時從接收池中取樣0.8 mL，同時補(bǔ)充同溫等量PBS 緩沖液，持續(xù)7 h。HPLC 法測定PBS 緩沖液中鹽酸青藤堿含量，計算其各時間點(diǎn)累積透皮遞送量 Qn，公式 為 Qn=（VCn+其中V 為接收液總體積（12 mL），Cn為第n 個時間點(diǎn)鹽酸青藤堿含量，V0為每次取樣體積（0.8 mL），A 為有效擴(kuò)散面積（2 cm2）。以各時間點(diǎn)累積透皮遞送量Qn對時間t 作圖，得累積透皮曲線，并對其直線部分回歸，所得斜率即為透皮穩(wěn)態(tài)流量（J）。

2.9.2 pH 值對鹽酸青藤堿透皮遞送的影響 分別用MES 緩沖液（pH 5.5）或PBS 緩沖液（pH 7.4）配制10 mg/mL 供試液，被動擴(kuò)散7 h 后，測得中性介質(zhì)（PBS 緩沖液）中鹽酸青藤堿累積透皮遞送量為（8.93±1.67）μg/cm2，高于在弱酸性介質(zhì)（MES 緩沖液）中的（6.10±0.88）μg/cm2（P＜0.05），透皮曲線見圖2。另外，實驗期間均未出現(xiàn)鹽酸青藤堿的透皮穩(wěn)態(tài)流。

圖2 pH 值對鹽酸青藤堿透皮遞送的影響Fig.2 Effect of pH value on transdermal delivery of sinomenine hydrochloride

2.9.3 化學(xué)促滲劑對鹽酸青藤堿透皮遞送的影響 用MES 緩沖液（pH 5.5）配制10 mg/mL 鹽酸青藤堿溶液，加入5% 丙二醇或5% 二甲基亞砜，發(fā)現(xiàn)含5% DMSO 的鹽酸青藤堿溶液7 h 累積透皮遞送量約為不含DMSO 的16 倍［（97.43±13.14）μg/cm2vs（6.10±0.88）μg/cm2]，并且添加5%PG 后7 h 內(nèi)累積透皮遞送量也顯著升高［（38.82±5.45）μg/cm2]，累積透皮曲線見圖3，可知DMSO 的促滲效果略優(yōu)于PG。

圖3 化學(xué)促滲劑對鹽酸青藤堿透皮遞送的影響Fig.3 Effect of penetration enhancer on transdermal delivery of sinomenine hydrochloride

2.10 體外離子導(dǎo)入透皮遞送研究

2.10.1 方法 離子導(dǎo)入透皮實驗采用0.1～0.5 mA/cm2直流電［8]。皮膚組織用擴(kuò)散池固定，表皮側(cè)朝上，陽極池、接收池（也作為陰極池）分別加入PBS 緩沖液（pH 7.4）20、12 mL，其中接收池持續(xù)磁力攪拌。為降低離子導(dǎo)入過程中無機(jī)鹽離子對藥物離子的同離子競爭，用鹽橋連接物理性分隔的陽極池和供給池，將Ag 電極、AgCl 電極分別插入陽極池、接收池。實驗開始前，供給池加入1 mL PBS 緩沖液，平衡30 min 后用移液槍吸出，純水沖洗供給池3 次，加入供試制劑［MES緩沖液（pH 5.5）制成5、10、20 mg/mL 鹽酸青藤堿溶液] 1 mL，溫度維持在32 ℃，打開直流電源開始實驗，每隔一定時間從接收池中取樣0.8 mL（迅速補(bǔ)充同溫等量PBS 緩沖液），持續(xù)7 h，樣品用“2.1”項下流動相適當(dāng)稀釋，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，按“2.9.1”項下方法測定累積透皮遞送量及其穩(wěn)態(tài)流量。實驗結(jié)束后拆除裝置，皮膚用流水沖洗10 s 以除去殘留藥液，吸水紙吸干表面水分后剪碎，加入10 mL“2.1”項下流動相持續(xù)攪拌12 h，提取皮膚組織內(nèi)鹽酸青藤堿，提取液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，用“2.1”項下流動相適當(dāng)稀釋，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算鹽酸青藤堿含量及其在皮膚內(nèi)部的沉積量。

2.10.2 電流密度對鹽酸青藤堿透皮遞送的影響 用MES 緩沖液（pH 5.5）配制10 mg/mL 鹽酸青藤堿溶液，在供給池中加入1 mL 后開通電流進(jìn)行離子導(dǎo)入試驗，電流密度分別設(shè)置為0.1、0.3、0.5 mA/cm2，結(jié)果見圖4。由此可知，施加0.5、0.3、0.1 mA/cm2直流電7 h 后，其累積透皮遞送量分別達(dá)（990.69±164.86）、（602.67±102.36）、（141.88±33.71）μg/cm2，比無電流施加時的（6.10±0.88）μg/cm2分別增加了約161、98、22倍，也遠(yuǎn)超“2.9.3”項下結(jié)果；通過離子導(dǎo)入作用，鹽酸青藤堿可快速透過皮膚吸收，并在3 h 后達(dá)到穩(wěn)態(tài)流量。

圖4 電流密度對鹽酸青藤堿透皮遞送的影響Fig.4 Effect of current density on transdermal delivery of sinomenine hydrochloride

圖5 顯示，施加0.5、0.3、0.1 mA/cm2直流電后，3～7 h 的穩(wěn)態(tài)流量分別為（203.92±32.18）、（123.07±33.45）、（44.37±11.53）μg/（cm2·h），回歸方程J=205.25I-453.38（r=0.999 3），表明鹽酸青藤堿的透皮遞送速率可通過改變電流密度來精密調(diào)控，有利于實現(xiàn)精確的個體化給藥；該成分皮膚沉積量分別為（1 588.80±263.78）、（708.69±250.20）、（340.36±110.44）μg/cm2，均高于相應(yīng)電流下的累積透皮遞送量，但并不與電流密度成正比。皮膚內(nèi)部存在著大量沉積的鹽酸青藤堿，這種藥物貯庫形式理論上可使其在電流停止后仍能從皮膚中緩慢釋放進(jìn)入體內(nèi)。

圖5 電流強(qiáng)度對鹽酸青藤堿總遞送量、穩(wěn)態(tài)流量的影響Fig.5 Effents of current density on total delivery and steady-state flux of sinomenine hydrochloride

2.10.3 質(zhì)量濃度對鹽酸青藤堿透皮遞送的影響用MES 緩沖液（pH 5.5）配制5、10、20 mg/mL鹽酸青藤堿溶液，在供給池中加入1 mL 后開通電流進(jìn)行離子導(dǎo)入試驗，設(shè)定電流密度為0.5 mA/cm2，結(jié)果見圖6。由此可知，5、10、20 mg/mL 鹽酸青藤堿溶液離子導(dǎo)入時，累積透皮遞送量分別為（887.95±155.50）、（990.69±164.86）、（1 259.50±253.39）μg/cm2，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)鹽酸青藤堿質(zhì)量濃度為5、10 mg/mL 時，皮膚沉積量分別為（409.42±128.18）、（1 588.80±263.78）μg/cm2，雖然差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），但不與其質(zhì)量濃度成正比。另外，在離子導(dǎo)入過程中使用了鹽橋，排除了大量競爭性離子（如Na+）與藥物共傳遞，可能是導(dǎo)致離子導(dǎo)入量與藥物濃度不相關(guān)的重要原因［14]。

圖6 質(zhì)量濃度對鹽酸青藤堿透皮遞送的影響Fig.6 Effect of concentration on transdermal delivery of sinomenine hydrochloride

2.11 傳導(dǎo)效率、遞送效率研究 在離子導(dǎo)入過程中，鹽酸青藤堿傳導(dǎo)效率是荷正電鹽酸青藤堿所傳遞電量占總輸出電量的百分比，傳導(dǎo)效率越高，表明該成分所載電荷在總輸出電量中的份額越高。鹽酸青藤堿遞送效率是遞送進(jìn)入皮膚的藥物量占初始給藥量的百分比，遞送效率越高，代表被利用的鹽酸青藤堿份額越高。不考慮角質(zhì)層被部分或全部破壞，在最高質(zhì)量濃度（20 mg/mL）、最高電流密度（0.5 mA/cm2）下可獲得最高的傳導(dǎo)效率，但此時遞送效率不是最高，而是出現(xiàn)在中低質(zhì)量濃度鹽酸青藤堿、最高電流密度時，即10 mg/mL、0.5 mA/cm2，見表1。

表1 離子導(dǎo)入鹽酸青藤堿的總遞送量、傳導(dǎo)效率和遞送效率（，n=5）Tab.1 Total delivery，transport efficiency and delivery efficiency of iontophoresis of sinomenine hydrochloride（，n=5）

表1 離子導(dǎo)入鹽酸青藤堿的總遞送量、傳導(dǎo)效率和遞送效率（，n=5）Tab.1 Total delivery，transport efficiency and delivery efficiency of iontophoresis of sinomenine hydrochloride（，n=5）

注：總遞送量=皮膚沉積量+累積透皮遞送量，傳導(dǎo)效率=（總遞送量對應(yīng)的電荷量/總輸出電量）×100%，遞送效率=（總遞送質(zhì)量/供給池中的初始藥物質(zhì)量）×100%。與10 mg/mL、0.5 mA/cm2 比較，*P＜0.05。

3 討論

離子導(dǎo)入的突出優(yōu)點(diǎn)是可快速可控地將目標(biāo)化合物透皮遞送［15-16]。鹽酸青藤堿是鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕的有效化合物，利用離子導(dǎo)入技術(shù)促進(jìn)其透皮遞送已有報道，但其機(jī)理和影響因素并未得到詳細(xì)研究［11]。本實驗使用了安全閾值之內(nèi)的電流密度，并且在體外條件下對離子導(dǎo)入鹽酸青藤堿的穩(wěn)定性及影響因素進(jìn)行了更詳細(xì)的考察，證實了該技術(shù)可安全、有效、可控地增加其透皮遞送量。

鹽酸青藤堿的pKa為7.97，依據(jù)Henderson-Hasselbalch 方程，該成分在pH 5.5 的弱酸條件下有超過99% 的分子發(fā)生電離，適合離子導(dǎo)入，而在pH 7.4 的中性條件下主要以分子形式存在，故其被動吸收更適合中性介質(zhì)。本實驗在鹽酸青藤堿的被動吸收中添加了促滲劑DMSO 和PG 以改變角質(zhì)層的脂質(zhì)排列，可增加該成分在皮膚內(nèi)部的分配系數(shù)，從而在一定程度上增加透皮吸收。

離子導(dǎo)入一般受到電極、電流密度、藥物濃度、角質(zhì)層狀態(tài)、載體材料等多種因素影響［15]，本實驗選擇Ag/AgCl 作為電極，避免了使用Pt 電極時陽極池溶液pH 降低的情況［17]。通過調(diào)節(jié)電流密度，可快速正相關(guān)地改變鹽酸青藤堿的透皮遞送穩(wěn)態(tài)流（r=0.999 3），有利于基于藥械一體化的個體化給藥。在供給池中存在競爭性離子（如Na+）時，藥物離子導(dǎo)入透皮遞送速率與電流密度成正相關(guān)［14]，但由于Na+等離子的電動學(xué)活性遠(yuǎn)高于荷電藥物分子，故會降低藥物的傳導(dǎo)效率和遞送效率。本實驗采取加入鹽橋的方式，將供給池與含有更多競爭性離子的陽極池作物理性分隔，也取得了較好的傳導(dǎo)效率（2.6%～6.1%）和遞送效率（9.6%～51.6%），可為基于電輔助技術(shù)的鹽酸青藤堿透皮給藥制劑開發(fā)提供依據(jù)。