摘要：血凝試驗(yàn)（HA）與血凝抑制試驗(yàn)（HI）屬獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測禽流感、新城疫等家禽A類疫病常規(guī)方法，但在具體操作階段，一旦操作不規(guī)范極有可能降低試驗(yàn)檢測結(jié)果精準(zhǔn)程度，弱化工作效率。該文主要論述禽流感和新城疫血凝抑制試驗(yàn)檢測方法。

關(guān)鍵詞：禽流感;新城疫;血凝抑制試驗(yàn);檢測方法

中圖分類號(hào)：S855.3? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ? ? doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.21.005

Methods of Hemagglutination Inhibition Test for Avian Influenza and Newcastle Disease

Abstract：Hemagglutination test （Ha） and hemagglutination inhibition test （Hi） are routine methods in veterinary laboratory to detect avian influenza and Newcastle disease，if the operation is not standardized enough，the accuracy of test results will be reduced and the work efficiency will be weakened.The methods of hemagglutination inhibition test for avian influenza and Newcastle disease were discussed in this paper.

Keywords：avian influenza，newcastle disease，hemagglutination inhibition test，detection method

引言

禽流感和新城疫是家禽養(yǎng)殖過程中的常見病，是重大禽類傳染病之一。需做好家禽A類常見疫病的常規(guī)檢測方法，但在實(shí)際操作中，易出現(xiàn)不規(guī)范的問題，降低了試驗(yàn)檢測結(jié)果精準(zhǔn)程度。提供一種禽流感和新城疫的血凝抑制試驗(yàn)檢測方法，可克服現(xiàn)有技術(shù)不足，從根本上保證診斷技術(shù)檢測結(jié)果精準(zhǔn)程度。

1 采集與血樣處理

1.1 紅細(xì)胞準(zhǔn)備

1%雞紅細(xì)胞懸液的制備包括用阿氏液作為抗凝劑，選擇3只無特定病原微生物（SPF）、無禽流感癥狀、新城疫抗體的非免疫公雞的抗凝血液作為研究對(duì)象，加入試管中，隨即加入抗凝血液3倍的緩沖液（PBS）進(jìn)行充分混合，離心速度保持在2 000 r/min，持續(xù)5～10 min，去除血漿、白細(xì)胞層，重復(fù)上述過程并反復(fù)沖洗3次，將血漿、白細(xì)胞清洗干凈，離心速度控制為2 000 r/min，持續(xù)10 min，吸取適當(dāng)?shù)膲悍e紅細(xì)胞配合使用PBS制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液，在恒溫4 ℃條件下保存。選取2.05 g葡萄糖、0.8 g檸檬酸鈉、0.055 g檸檬酸、0.42 g氯化鈉加入100 mL的蒸餾水中，直至充分散熱溶解，維持pH在6.1并充分溶解，在壓強(qiáng)6.9 kPa條件下持續(xù)15 min高壓滅菌，在恒溫4 ℃條件下保存。配置的醛化紅細(xì)胞液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%，加入到濃度為0.1%，恒溫4 ℃，吸取適當(dāng)?shù)膲悍e紅細(xì)胞配合使用PBS制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液，在恒溫4 ℃條件下保存。加入到濃度為0.1%的疊氮鈉中備用。

1.2 血清準(zhǔn)備

受檢樣品為山東望聯(lián)種禽集團(tuán)有限公司肉種雞血清，原始編號(hào)為1～30，于2020年9月15日免疫高致病性禽流感三價(jià)滅活苗（H5N1RE-11株+RE-12株，H7N9（H7-RE2株），青島易邦生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)201384900;于2020年9月25日免疫新城疫凍干活疫苗，青島易邦生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)200333110。

1.3 檢測試劑準(zhǔn)備

使用哈爾濱國生生物科技股份有限公司生產(chǎn)禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制試驗(yàn)抗原，生產(chǎn)批號(hào)20190415，血凝效價(jià)8log2，和青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心生產(chǎn)的新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原，生產(chǎn)批號(hào)010131801;血凝效價(jià)為10log2。

1.4 檢測方法

（1）設(shè)禽流感血凝抑制試驗(yàn)固定的參照血凝效價(jià)為11log2，設(shè)新城疫血凝抑制試驗(yàn)固定的參照血凝效價(jià)為12log2。

（2）配制禽流感參照血凝效價(jià)11log2或新城疫參照血凝效價(jià)12log2的4HAU抗原。

（3）取2個(gè)96孔V型微量反應(yīng)板橫向相鄰放置，第2個(gè)96孔V型微量反應(yīng)板作為第1個(gè)板的加長，用移液器在第1～15孔各加入0.025 mL PBS，第16孔加入0.05 mL PBS。

（4）第1孔中加入0.025 mL標(biāo)準(zhǔn)的禽流感、新城域陽性血清，經(jīng)過充分混合后取出0.025 mL放置到第2孔中，直至第14孔，并且需要從第14孔中取出0.025 mL拋棄，第15孔作為陽性參照，第16孔作為PBS對(duì)照。

（5）1～15孔中均加入0.025 mL的L4HAU抗原，輕觸反應(yīng)板，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)物的充分混合，溫度環(huán)境控制在20～25 ℃環(huán)境下靜置，持續(xù)30 min，也可以選擇在恒溫4 ℃條件下持續(xù)靜置1 h;20～25 ℃室溫下靜置35～45 min，或在恒溫35～40 ℃條件下靜置持續(xù)12～18 min，PBS與孔紅細(xì)胞對(duì)比呈現(xiàn)出顯著的鈕扣形狀沉積到底，此時(shí)判定結(jié)果。

1.5 判定結(jié)果

PBS正確的前提下，傾斜反應(yīng)板，從背側(cè)角度觀察，1～3 s內(nèi)觀察紅細(xì)胞是否以淚珠狀落下，在陰性血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)照的HI滴度≤2log2的情況下，陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行對(duì)照，與已知滴度相差大約1個(gè)稀釋度，在陰陽血清均不發(fā)生自凝的前提下，判定HI結(jié)果有效，記錄試驗(yàn)抗體效價(jià)數(shù)值。

禽流感抗體效價(jià)公式：參照血凝效價(jià)11log2比正確血凝效價(jià)數(shù)值多Y個(gè)滴度，禽流感抗體效價(jià)=（試驗(yàn)抗體效價(jià)數(shù)值-Y）log2，Y=0、1、2、3、4。

新城疫抗體效價(jià)公式：參照血凝效價(jià)12log2比正確血凝效價(jià)數(shù)值多Y個(gè)滴度，新城疫抗體效價(jià)=（試驗(yàn)抗體效價(jià)數(shù)值-Y）log2，Y=0、1、2、3、4。

禽流感抗體效價(jià)公式或新城疫抗體效價(jià)公式中，若計(jì)算出的禽流感抗體效價(jià)或新城疫抗體效價(jià)大于10，則禽流感抗體效價(jià)或新城疫抗體效價(jià)記為10log2;若禽流感抗體效價(jià)或新城疫抗體效價(jià)小于或等于3log2，則判定抗體試驗(yàn)為陰性;若禽流感抗體效價(jià)或新城疫抗體效價(jià)等于4log2，則判定抗體試驗(yàn)為可疑，需重復(fù)試驗(yàn);若禽流感抗體效價(jià)或新城疫抗體效價(jià)大于或等于5log2，則判定抗體試驗(yàn)為陽性。

2種試劑檢測出試驗(yàn)HI效價(jià)（log2）情況如下。

（1）禽流感病毒H7N9（RE-2株）試驗(yàn)HI效價(jià)（log2）按照原始編號(hào)（1-30）結(jié)果分別為12、11、11、12、12、13、11、11、12、12、11、12、12、12、11、13、12、11、12、11、13、13、12、11、12、11、12、12、13、11;根據(jù)禽流感抗體效價(jià)公式，11log2比正確血凝效價(jià)8log2多3個(gè)滴度（Y=3），抗體效價(jià)（log2）=試驗(yàn)抗體效價(jià)-3，求得禽流感病毒H7N9（RE-2株）HI效價(jià)（log2）按照原始編號(hào)（1-30）結(jié)果分別為9、8、8、9、9、10、8、8、9、9、8、9、9、9、8、10、9、8、9、8、10、10、9、8、9、8、9、9、10、8;

（2）新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原的試驗(yàn)HI效價(jià)（log2）按照原始編號(hào)（1～30）結(jié)果分別為12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、12、11、12、12、12、12、12、11、12、12;根據(jù)新城疫抗體效價(jià)公式，12log2比正確血凝效價(jià)10log2多2個(gè)滴度（Y=2），抗體效價(jià)（log2）=試驗(yàn)抗體效價(jià)-2，求得新城疫HI效價(jià)（log2）按照原始編號(hào)（1～30）結(jié)果分別為10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、10、9、10、10、10、10、10、9、10、10。

本檢測方法和傳統(tǒng)檢測方法技術(shù)相比，在用于禽流感和新城疫血凝抑制試驗(yàn)檢測方中經(jīng)過大量試驗(yàn)證明修正后得到禽流感、新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗體效價(jià)公式，設(shè)定11log2為禽流感參照血凝效價(jià)，設(shè)定12log2為新城疫固定的參照血凝效價(jià)，能夠直接進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)并運(yùn)用禽流感、新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗體效價(jià)公式，求得HI抗體效價(jià)，其結(jié)果與正確抗體效價(jià)完全一致[2]。

2 加樣階段注意事項(xiàng)

（1）取樣環(huán)節(jié)。移液器要按至首個(gè)檔停點(diǎn)，在排樣階段要求要按至第二檔停點(diǎn)才能保證樣品整體排出并保證取樣量精準(zhǔn)。

（2）吸液環(huán)節(jié)。去除吸頭外部吸附的多余液體，拇指松開速度要平穩(wěn)緩慢，不要出現(xiàn)快速松開的操作，要順著沿壁滑出吸頭。

（3）加樣階段。吸頭與V板孔不應(yīng)觸及，以此減少交叉污染。按照比例稀釋樣品的過程中，拇指要緩慢按壓松開移液器按鈕。

（4）實(shí)際檢測。對(duì)盛放抗原液的加樣槽壁也要做出特殊標(biāo)識(shí)[3]。

3 結(jié)論

采用血凝抑制試驗(yàn)（HI）檢測禽流感與新城疫病毒會(huì)受到多種因素共同影響檢測結(jié)果精確度，工作人員要在試驗(yàn)中嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，嚴(yán)格依據(jù)規(guī)范要求配置紅細(xì)胞懸液，合理控制溫度及時(shí)間，力爭把影響降至最低。

參考文獻(xiàn)

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作者簡介：李宇剛（1976-），男，山東威海人，本科，獸醫(yī)師，研究方向：畜牧獸醫(yī)。