羅小鳳 秦麗華 達(dá)云萌 白 蕓 孫艷榮 王子月 賈 靜

絕經(jīng)是由于自然或手術(shù)導(dǎo)致卵巢功能喪失而引起的月經(jīng)停止超過6個(gè)月的生理過程，多發(fā)生于50歲左右的女性。在更年期綜合癥中，除潮熱、盜汗、性交困難等常見癥狀外，眼干、口干等癥狀也明顯增多，以往研究證實(shí)絕經(jīng)后激素生成減少可能導(dǎo)致唾液分泌量顯著下降，引起口干癥等，而雌激素治療可改善絕經(jīng)后的口干癥狀[1]，但其通過何種方式調(diào)控唾液分泌尚未有定論。

血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）是一種直鏈鈦，屬胰泌素/胰高血糖素家族，參與調(diào)控多種生理功能，如蛋白分泌、抗凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等[2]。VIP可能與絕經(jīng)后的多種癥狀相關(guān)并受到雌激素的調(diào)控。Liu X等研究表明，VIP可能參與絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程[3]。Lara,L.A等研究顯示雌激素能夠通過調(diào)控陰道后壁中VIP的表達(dá)，影響陰道分泌功能[4]。VIP主要通過與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，受體包括VIP-1 受體（VPAC1）、VIP-2 受體（VPAC2）、PAC1，其中VPAC1與VIP的結(jié)合有高度親和力，因此對(duì)于VIP受體的研究多選擇VPAC1[5]。截至目前，VIP在絕經(jīng)后下頜下腺中表達(dá)以及對(duì)其功能的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1.方法和材料

1.1 動(dòng)物模型60只8-10周齡（體重220±10g）雌性SD大鼠[6]，隨機(jī)分為：假手術(shù)組（SHAM），去卵巢組（OVX）和去卵巢后雌激素干預(yù)組（OVX+E），每組20只。置于25±1℃,相對(duì)濕度40-50%，光暗周期12h的環(huán)境中，非直接光照，自由飲水，無(wú)大豆飼料飼養(yǎng)兩周。所有實(shí)驗(yàn)程序已獲得當(dāng)?shù)氐赖略S可，并遵守中國(guó)公共衛(wèi)生部護(hù)理和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南。本研究經(jīng)過北京大學(xué)健康科學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（the approval number:LA2012-82）。

SHAM 組，只打開盆腔找到卵巢，切除卵巢周圍相同重量的脂肪，卵巢未切除；OVX 和OVX+E組大鼠實(shí)施雙側(cè)卵巢切除術(shù)[7]?；謴?fù)兩周后，OVX+E 組根據(jù)25 μg/kg 每日腹腔注射雌二醇[8,9]（17β-雌二醇，Sigma E8875），SHAM 和OVX 組大鼠腹腔注射等量芝麻油，給藥四周后每組剔除4 只體重明顯異常的大鼠，剩余每組16 只局麻下進(jìn)行心臟取血測(cè)定血清雌二醇含量以及處死后摘取下頜下腺組織。

1.2 免疫放射法測(cè)定血清雌二醇 所有大鼠麻醉后，暴露心臟，使用注射針提取心臟血液3-4ml，在4℃，3500rpm條件下離心15min，吸取上清液使用放射免疫試劑盒檢測(cè)大鼠體內(nèi)雌二醇含量[10]。

1.3 下頜下腺取材 完成心臟取血后，每組取8只大鼠，用4%多聚甲醛心臟灌流后剪取下頜下腺組織，制作冰凍切片用于免疫組化。每組剩余8 只處死后，直接摘取下頜下腺組織，將外側(cè)包膜剝離后-80℃保存，用于免疫印跡和sAA活性測(cè)量。

1.4 免疫組織化學(xué) 常規(guī)將冰凍切片（厚度10μm）Triton-X100 打孔，抗原修復(fù)后，使用VIP抗體（稀釋濃度1∶400,Abcam,ab272726）和VPAC1 抗體（稀釋濃度1∶500，杭州華安生物，ER65303）在4℃下孵育16h，滴加生物素山羊抗兔IgG 孵育3h，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶親和素孵育1.5h，DAB 顯色，每個(gè)組織在顯微鏡下觀察并在同一放大倍數(shù)時(shí)，隨機(jī)選取5 張視野進(jìn)行拍攝[11]。陰性對(duì)照組在一抗孵育時(shí)使用0.01mol/L PBS 溶液，其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。

1.5 免疫印跡 稱取0.4-0.6mg 下頜下腺組織進(jìn)行蛋白提取，電泳槽中加入等量蛋白提取液（80μg）100V 電壓下電泳1.5h，接著電轉(zhuǎn)2h 將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行目標(biāo)蛋白抗體孵育18h（VIP,VPAC1 稀釋濃度均為1∶1000），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L）孵育2h 后進(jìn)行曝光，使用Image J 軟件計(jì)算灰度值[12]。

1.6 微量法sAA 活性檢測(cè) sAA 能夠催化α-1，4-糖苷鍵水解生成還原性糖，還原3，5-二硝基水楊酸產(chǎn)生棕紅色，在540nm 波長(zhǎng)處出現(xiàn)吸收峰，可通過測(cè)量吸光度獲得sAA 活性。組織破碎后提取粗酶液，設(shè)置對(duì)照管，測(cè)定管，標(biāo)準(zhǔn)管和空白管，按照說明依次加入相應(yīng)試劑，測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)直線（y=kx+b）計(jì)算sAA 活性（每克組織每分鐘催化生成1mg 還原糖定義為1個(gè)酶活性單位）：sAA（U/g）=2×x÷W（W為樣本鮮重）[13]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 17.0 軟件分析結(jié)果。三組間VIP、VPAC1表達(dá)及sAA 活性之間的差異使用單因素方差分析（ANOVA），組間差異使用事后多重分析（SNK檢驗(yàn)），P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]。

2.結(jié)果

2.1 大鼠血清雌二醇含量 放射免疫法結(jié)果顯示，OVX組大鼠體內(nèi)雌二醇含量（8.643±4.226pg/ml）較SHAM 組（16.331±2.150pg/ml）明顯減少（P<0.05），OVX+E組含量增加（15.715±4.816pg/ml）接近SHAM組水平（P>0.05），（圖1）。

圖1 大鼠血清雌二醇含量（S±SD)：（*P<0.05，n=8）。

2.2 大鼠下頜下腺VIP 的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide,VIP）在大鼠下頜下腺腺泡細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞漿中均有表達(dá)（圖2 B-D）。VIP 在OVX 組下頜下腺的細(xì)胞核及細(xì)胞漿中表達(dá)相比于SHAM 組明顯減低，OVX+E組表達(dá)水平與SHAM組相似。

圖2 VIP在大鼠下頜下腺的免疫組化染色（S±SD)A：陰性對(duì)照；B：SHAM組；C：OVX組；D：OVX+E組；箭頭示：VIP的表達(dá)位置，標(biāo)尺：30 μm。

免疫印跡結(jié)果顯示，OVX 組下頜下腺中VIP表達(dá)（1.12±0.09）比SHAM 組（1.92±0.12）明顯減少（P<0.01），OVX+E 組（1.77±0.11）增加到SHAM組水平（P>0.05），（圖3 A,B）。

圖3 VIP在大鼠下頜下腺的免疫印跡結(jié)果（S±SD)A:VIP的免疫印跡蛋白表達(dá)；B:VIP的免疫印跡灰度值統(tǒng)計(jì)；（**P<0.01，n=8）。

2.3 大鼠下頜下腺VPAC1 的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，血管活性腸肽受體VPAC1 在大鼠下頜下腺腺泡細(xì)胞細(xì)胞核核膜和細(xì)胞膜上均有表達(dá)（圖4 B-D）。OVX 組下頜下腺中VPAC1 表達(dá)較SHAM 組明顯減少，OVX+E 組表達(dá)基本恢復(fù)到SHAM組水平。

圖4 VPAC1在大鼠下頜下腺的免疫組化染色（S±SD)A:陰性對(duì)照組；B:SHAM組；C:OVX組；D:OVX+E組；箭頭示VPAC1表達(dá)位置，標(biāo)尺：30 μm。

免疫印跡結(jié)果同免疫組化相同，灰度值分析（S±SD）結(jié)果，OVX 組下頜下腺中VPAC1 表達(dá)（4.46±1.43）較SHAM 組（8.64±0.42）明顯減少（P<0.05），OVX+E 組（8.50±2.30）增加到SHAM組水平（P>0.05）。（圖5 A,B）

圖5 VPAC1在大鼠下頜下腺的免疫印跡結(jié)果（S±SD)A:VPAC1的免疫印跡蛋白表達(dá)；B:VPAC1的免疫印跡灰度值統(tǒng)計(jì)；（*P<0.05，n=8）。

2.4 大鼠下頜下腺sAA活性sAA由漿液性腺泡細(xì)胞分泌產(chǎn)生，微量法活性檢測(cè)分析（S±SD）結(jié)果顯示，OVX 組下頜下腺分泌sAA 活性（0.34±0.80）較SHAM 組（0.72±0.28）明 顯降低（P<0.05），OVX+E 組（0.65±0.28）活性升高接近SHAM組水平（P>0.05），（圖6）。

圖6 下頜下腺中唾液淀粉酶活性（S±SD)；（*P<0.05，n=8）。

3.討論

本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)大鼠體內(nèi)血清雌二醇含量,確保大鼠去卵巢模型成功建立[7]。雌激素通過雌激素受體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)許多蛋白和肽類的表達(dá)[15]。雌激素與雌激素受體特異性結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，主要的受體亞型為：ERα、ERβ 和GPR30。下頜下腺中三種雌激素受體均有表達(dá)，其中ERα 僅在導(dǎo)管細(xì)胞表達(dá)[16]，而ERβ 和GPR30在漿液性腺泡細(xì)胞中均有表達(dá)[17,18]，與本實(shí)驗(yàn)中VIP 及其受體的表達(dá)位置一致。有研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女陰道后壁中雌激素受體ERα 表達(dá)減少可導(dǎo)致VIP 的表達(dá)減少[4]；小鼠SCN 神經(jīng)元中雌激素可通過受體ERβ 影響VIP 的表達(dá)，繼而維持細(xì)胞的晝夜節(jié)律[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)垂體中GPR30 能夠與受體活性修飾蛋白3(RAMP3）特異性結(jié)合調(diào)控VIP 的表達(dá)[20]。因此，我們推測(cè)雌激素很可能通過各種雌激素受體調(diào)控腺泡細(xì)胞中VIP 和VPAC1 表達(dá)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索和驗(yàn)證。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)去卵巢后大鼠下頜下腺細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激增加，腺泡萎縮，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常[7]，這也可能是導(dǎo)致VIP 和VPAC1 表達(dá)減少原因之一。另外VIP 對(duì)VPAC1 具有調(diào)節(jié)作用[21]，VIP 表達(dá)減少后可能導(dǎo)致兩者結(jié)合減少，長(zhǎng)期失代償后VPAC1表達(dá)亦減少。

圍絕經(jīng)期女性唾液中多種成分發(fā)生改變[22]。α-唾液淀粉酶（salivary alpha-amylase,sAA）是唾液中十分重要的有機(jī)成分，是唾液腺代表性功能指標(biāo)之一。它能夠?qū)⒌矸酆吞窃?，其分泌和活性異常能夠?qū)е率澄餆o(wú)法成團(tuán)和初步消化，出現(xiàn)咀嚼和吞咽困難[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠在低雌激素狀態(tài)下，下頜下腺分泌的sAA 活性降低，給與雌激素治療后，活性顯著提高，表明雌激素能夠影響下頜下腺sAA 的活性，這與Purushotham K R等的研究結(jié)果相似，該研究采用了與我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相同的去卵巢動(dòng)物模型并測(cè)量了唾液腺中提取的sAA活性[24]。而部分臨床研究顯示，使用雌激素治療后的絕經(jīng)后婦女唾液中的sAA 活性隨日間采樣時(shí)間不同呈現(xiàn)規(guī)律變化，而不使用激素治療的絕經(jīng)后婦女唾液中的sAA 的活性日間規(guī)律被打亂，這可能與絕經(jīng)后婦女在基礎(chǔ)和應(yīng)激條件下腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)和腎上腺皮質(zhì)（hypothalamus -pituitary -adrenal，HPA）軸活動(dòng)之間存在不對(duì)稱性導(dǎo)致。雌激素治療通過減少交感神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)而改變異常的腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)維持了唾液腺細(xì)胞的晝夜節(jié)律。N Yoshida 等人的研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前、圍絕經(jīng)期、絕經(jīng)后婦女的血清雌二醇含量及靜息唾液流量依次顯著減少，但sAA 活性并沒有顯著差異，根據(jù)皮爾遜相關(guān)系數(shù)計(jì)算得出雌二醇與sAA 活性呈負(fù)相關(guān)的結(jié)論，但該實(shí)驗(yàn)測(cè)量的樣本是靜息唾液，而研究顯示唾液淀粉酶在咀嚼或酸性食物刺激時(shí)才會(huì)大量分泌到唾液中[25,26]，此實(shí)驗(yàn)中的sAA 活性僅能作為精神壓力指標(biāo)，不能作為功能標(biāo)志，故與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不矛盾[27]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去卵巢后大鼠下頜下腺中VIP,VPAC1 表達(dá)減少，同時(shí)sAA 活性降低。另有研究發(fā)現(xiàn)在免疫細(xì)胞中特異性激動(dòng)和拮抗VPAC1，使血清中淀粉酶含量發(fā)生變化，表明VPAC1 對(duì)血清淀粉酶具有調(diào)控作用[28]。給與大鼠唾液腺細(xì)胞外源性VIP 刺激，sAA 活性顯著提高[29]。以上結(jié)果均提示下頜下腺中sAA 活性變化可能與VIP 和受體VPAC1 異常表達(dá)具有一定相關(guān)性?？赡茉蛴校海?）下頜下腺中VIP 和VPAC1 表達(dá)和結(jié)合減少，可能使細(xì)胞內(nèi)cAMP 或Ca2+含量改變，而下頜下腺漿液性腺泡細(xì)胞能夠在cAMP 刺激下合成和分泌sAA，導(dǎo)致sAA 活性降低[30]；（2）下頜下腺中VIP 能夠通過蛋白激酶PKA 途徑抑制腫瘤壞死因子TNF-α 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，VIP 表達(dá)減少可能導(dǎo)致腺泡細(xì)胞凋亡增多，分泌sAA 減少，活性降低[31]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)去卵巢后三大唾液腺出現(xiàn)腺泡細(xì)胞萎縮，凋亡細(xì)胞與氧化應(yīng)激現(xiàn)象加劇，毒蕈堿乙酰膽堿受體M1、M3 和水通道蛋白5表達(dá)減少等[12]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)低雌激素狀態(tài)與VIP 及其受體VPAC1 的表達(dá)具有一定相關(guān)性，這一過程可能導(dǎo)致唾液腺功能發(fā)生變化，進(jìn)而引起圍絕經(jīng)期女性口干、味覺異常等不適感。本研究為揭示圍絕經(jīng)期女性唾液分泌成分變化及其可能機(jī)制提供了新的線索，為深入研究圍絕經(jīng)期女性唾液分泌功能障礙提供新的思路。