于 鑫，丁 晨，林 曉，朱 偉，黃春艷

(牡丹江醫(yī)學院免疫教研室，黑龍江 牡丹江 157011 )

LncRNA H19、HT-29、Proliferation、Apoptosis結腸癌是常見消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，其早期發(fā)現(xiàn)治愈率較高，但是由于早期缺乏特異性癥狀，導致大部分結腸癌患者確診時已是晚期，死亡率增加[1]。所以，臨床上迫切需要找到敏感度和特異度高的早期診斷指標。近年來，LncRNA因固有性質和易于獲取等特性，可能成為理想的早期診斷指標。LncRNA H19是不編碼蛋白的長鏈RNA，其在結腸癌患者中發(fā)現(xiàn)過表達，并促進腫瘤細胞增殖[2]，但是在結腸癌中的作用機制有待進一步研究，因此，本研究利用HT-29細胞作為研究對象，通過外源性降低LncRNA H19表達水平，觀察細胞增殖和凋亡情況并對其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和處理結腸癌細胞株HT-29購于上海細胞培養(yǎng)研究所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。取對數(shù)期細胞接種6孔板，按照脂質體LipofactamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen)規(guī)程，將Smart silencer NC、Smart silencer H19、siR-NC、siR-STAT1、siR-NC+ Smart silencer H19、siR-STAT1+Smart silencer H19分別轉染至HT-29細胞，6 h后棄去液體，加入正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h進行后續(xù)檢測，不同處理因素重復三次平行實驗行。

1.2 RNA提取和Real time PCR取各組細胞1×106，嚴格按照Trizol試劑盒(美國Omega公司)的操作流程提取HT-29細胞總RNA后，使用逆轉錄試劑盒(瑞士羅氏公司)將RNA合成cDNA。通過使用SYBR Green mix(瑞士羅氏)試劑盒進行實時定量PCR檢測。反應條件為預變性95 ℃ 60 s，一個循環(huán)，延伸95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)，以GAPDH為內參，參照2-△△Ct法計算LncRNA H19、STAT1、Bcl-2、Bax表達量，不同處理因素重復三次平行實驗。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 細胞增殖檢測將各組細胞濃度調至為4×104mL，取100 μL細胞接種至96孔培養(yǎng)板，加入20 μL的MTT(5 mg/mL)溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩，使晶體充分溶解。選擇波長為490 nm，酶標儀檢測每孔吸光度值(Optical density,OD)。細胞增殖能力與OD值成正比。不同處理因素重復三次平行實驗。

1.4 統(tǒng)計學處理使用GraphpadPrism 8軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析，以“均數(shù)±標準差”表示，兩樣本數(shù)據(jù)采用t檢驗分析兩組之間差異，并對兩組以上差異進行方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Smart silencer H19下調 LncRNA H19表達Real time PCR檢測轉染24 h后，Smart silencer H19組LncRNA H19相對表達量(0.45±0.01)明顯低于空白組(1.00±0.00，P<0.01)和Smart silencer NC組(1.02±0.02，P<0.01)。

2.2 LncRNA H19促進HT-29細胞增殖，抑制細胞凋亡Smart silencer H19組細胞在24 h、48 h、72 h三個時間點的OD值均小于空白組、Smart silencer NC組(P空<0.05，Psmart silencer NC<0.05)，見表2；與smart silencer NC組和空白組相比，細胞轉染24 h后smart silencer H19組Bcl-2表達下調，而Bax表達上調，差異具有統(tǒng)計學意義(P空<0.01，Psmart silencer NC<0.01)，見圖1。

表2 MTT檢測細胞增殖結果(OD值)

圖1 LncRNA H19影響凋亡相關蛋白表達

2.3 Smart silencer H19下調STAT1表達Smart silencer H19組轉染24 h后STAT1相對表達量(0.77±0.03)顯著低于smart silencer NC組(1.05±0.06，P<0.01)和空白組(1.00±0.00，P<0.01)。

2.4 STAT1促進HT-29細胞增殖，抑制細胞凋亡轉染24 h后siR-STAT1組STAT1相對表達量(0.41±0.04)明顯低于空白組(1.00±0.00，P<0.01)、siR-NC組(1.03±0.07，P<0.01)；siR-STAT1組在在24 h、48 h、72 h三個時間點的OD值均低于空白組、siR-NC組，差異具有統(tǒng)計學意義(P空<0.05，PsiR-NC<0.05)，見表3；與空白組、siR-NC組相比，siR-STAT1組轉染24h后明顯下調Bcl-2表達，而上調Bax表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P空<0.01，PsiR-NC<0.01)，見圖2。

表3 MTT檢測細胞增殖結果(OD)

圖2 STAT1影響凋亡相關蛋白表達

2.5 STAT1參與LncRNA H19 影響HT-29細胞增殖和凋亡siR-STAT1+smart silencer H19組在24 h、48 h、72 h三個時間點的OD值均小于siR-NC+smart silencer H19組和空白組(P空<0.05，PsiR-NC+smart silencer<0.05)，見表4；與空白組、siR-NC+Smart silence H19組相比，siR-STAT1+smart silencer H19組轉染24 h后明顯下調Bcl-2表達，而上調Bax表達(P空<0.01，PsiR-NC+smart silencer<0.01)，見圖3。

表4 MTT檢測細胞增殖結果

圖3 STAT1參與LncRNA H19 影響凋亡相關蛋白表達

3 討論

結腸癌是死亡率較高的惡性腫瘤，篩查和診斷的主要手段是結腸鏡檢查，但很多人對結腸鏡檢查具有排斥心理，因此，臨床上需要找到易于獲取、重復采樣的診斷方式?；贚ncRNA的穩(wěn)定性和組織、細胞特異性，其可能成為癌癥的早期診斷的生物學指標，并且越來越多的研究證實LncRNA異常表達在臨床上具有應用的價值。LncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，起初被認為是生物“噪音”，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)LncRNA能夠以DNA、RNA或者蛋白結合的方式發(fā)揮生物學功能，尤其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要調控作用，成為近年來腫瘤的研究熱點。越來越多研究報道表明LncRNA在惡性腫瘤中異常表達，通過各種機制調節(jié)腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移、上皮間質轉化等，從而發(fā)揮致癌或抑癌的作用[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、預后等相關，其介導腫瘤進展的方式主要是作為“分子海綿”，調控miRNA從而影響靶基因表達。在不同類型的腫瘤中發(fā)揮不同的作用機制，例如：在肺癌細胞中，LncRNA H19過表達且抑制miR-200a表達水平從而促進細胞增殖[4]，而在肝細胞癌中，LncRNA H19表達下調，抑制細胞增殖[5]。即使在同一類型腫瘤中LncRNA H19也可以通過靶向不同miRNA發(fā)揮不同的調控作用。然而，關于H19在結腸癌中作用機制研究報道較少。在結腸癌患者中LncRNA H19高表達，并利用結腸癌細胞體外探究其作用機制，發(fā)現(xiàn)可以靶向miRNA141，激活β-連環(huán)蛋白，導致腫瘤細胞活力增加[6]，也可以通過miRNA675/RB5[7]或miR-675/EHZ2[8]信號途徑調控腫瘤細胞的增殖。因此，本研究利用外源性smart silencer敲低HT-29細胞中LncRNA H19表達，結果顯示，smart silencer H19可降低細胞增殖能力和Bcl-2表達，而增加Bax表達。以上結果證實LncRNA H19可以促進結腸癌細胞增殖而抑制細胞凋亡，與已知報道結果一致。

STAT1是信號轉導轉錄激活因子家族之一，不但與增殖、分化、凋亡等生理過程密切相關，而且參與腫瘤形成、發(fā)展、轉移以及抗藥性，其可以通過調控血管生成因子、細胞凋亡和細胞周期相關蛋白，如：Bax、Bcl-2、caspases等，從而抑制腫瘤細胞增殖,促進細胞凋亡，也可以通過增強抗原呈遞能力和細胞毒作用的方式參與腫瘤免疫調節(jié)，促進腫瘤被免疫系統(tǒng)清除[9]。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)STAT1也具有促癌作用。在結腸癌患者中STAT1表達水平明顯高于正常結腸組織，而且通過不同路徑促進或抑制結腸癌細胞增殖。例如：STAT1下調miR-181a表達，抑制結腸癌細胞增殖[10]，而STAT1/CCL5路徑促進結腸癌細胞增殖[11]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，STAT1參與LncRNA調控腫瘤細胞增殖和凋亡[12-13]?；谏鲜鰣蟮?，為了進一步探討LncRNA H19調節(jié)結腸癌細胞增殖和凋亡的作用機制，我們進行STAT1敲低實驗，結果顯示，敲低STAT1導致細胞增殖減少，同時改變Bcl-2、Bax表達，并且STAT1敲低可增強LncRNA H19敲低對結腸癌細胞增殖和凋亡蛋白相關表達的影響。

綜上所述，LncRNA H19可能通過影響STAT1表達，調控結腸癌細胞的增殖和凋亡，但是涉及的詳細的調控機制還仍不清楚，有待進一步研究。