蘇曉男，畢鵬翔，2，黃 青，于欣洋，吳 丹，3，郭艷芹，2

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011)

阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進(jìn)行性認(rèn)知能力下降、人格改變、記憶力衰退為主要臨床特征。2030年，我國AD患者即將達(dá)到1500萬，成為世界上AD患病人數(shù)最多的國家[1]。因目前AD的治病機(jī)理尚不明確，如何防治AD，成為目前亟待解決的世界難題。AD的標(biāo)志性病理特征包括細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積形成的老年斑。突觸丟失在AD患者早期出現(xiàn)，并與認(rèn)知功能下降有關(guān)[2-4]。NL1是一種突觸后粘附蛋白，在突觸的成熟、維持、形成和可塑性中扮演重要角色[5-7]，隨著NL1研究的逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)Aβ寡聚體可以直接與NL1細(xì)胞外域(1-691aa)相互作用，引發(fā)AD。

本研究利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建NL1/1-691誘導(dǎo)型原核表達(dá)重組質(zhì)粒，后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)C43中誘導(dǎo)表達(dá)，摸索優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，篩選能夠穩(wěn)定表達(dá)的表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)中采用pGEX-6P1質(zhì)粒，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是分子量較小，編碼抗氨節(jié)青霉素抗性序列、強(qiáng)啟動子tac和編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST，分子量約為26 kDa)的純化標(biāo)簽。后續(xù)多克隆位點(diǎn)可以插入DNA片段，融合蛋白產(chǎn)物純化方法簡單快速，在細(xì)菌中產(chǎn)生的融合蛋白一般以可溶狀態(tài)存在，不形成包涵體。另GST蛋白親和純化層析具有載量高、非特異性吸附少，流速快等特點(diǎn)。為提高可溶表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)濃度及IPTG加入時(shí)機(jī)進(jìn)行了優(yōu)化，通過實(shí)驗(yàn)確定最佳誘導(dǎo)條件，成功表達(dá)外源蛋白。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器(1)主要實(shí)驗(yàn)試劑：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞C43(上海唯地生物技術(shù)公司)；引物由金唯智生物科技有限公司合成；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；限制性核酸內(nèi)切酶XhoI、BamHI(Thermo Scientific公司)；酵母提取物、蛋白胨(英國Oxoid公司)；氯化鈉(Solarbio公司)；GST-tag Purification Resin(BeyoGold公司)。洗脫緩沖液：250 mM Tris Hcl，150 mM HCL，15 mM GSH，pH 8.0。兔抗GST-tag單克隆抗體(Thermo Scientific公司)；蛋白分子量Marker (Bio-rad公司)；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(biosharp公司)；(2)主要儀器：SDS-PAGE多功能電泳儀：美國BIO-RAD公司；全自動高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.2 pGEx-6P1-NL1/1-691原核表達(dá)載體的構(gòu)建及純化

1.2.1 pGEx-6P1-NL1/1-691原核表達(dá)載體的構(gòu)建 查找GeneBank數(shù)據(jù)庫中NL1/1-691基因序列，委托蘇州金唯智生物科技有限公司常規(guī)合成目的基因，并針對大腸桿菌的密碼子對表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行了目的基因序列優(yōu)化，添加5'BamHI、3'XhoI酶切位點(diǎn)，選擇pGEx-6p1蛋白表達(dá)載體，構(gòu)建質(zhì)粒pGEX-6p-1-NL1/1-691，使用SnapGene軟件繪制質(zhì)粒圖譜。取重組質(zhì)粒1 μL加入50 μL C43感受態(tài)中轉(zhuǎn)化。挑取克隆于1 mL含有氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)基中37 ℃活化16 h，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，反應(yīng)體系為2×Taq PCR Mastermix 7.5 μL，ddH2O 6 μL，引物前后各0.5 μL，菌液0.5 μL，1%瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測，反應(yīng)條件為：150 V恒壓，25 min左右，凝膠成像分析系統(tǒng)成像。

1.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的篩選 使用質(zhì)粒小提試劑盒從菌液中提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒及質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，反應(yīng)體系為pGEX-6p-1-NL1/1-691質(zhì)粒42 μL，綠色10×Buffer 5μL，BamHI、XhoI各1.5 μL，共50 μL體系37 ℃恒溫培養(yǎng)45 min。1%瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測，反應(yīng)條件為：150 V恒壓，25 min左右，凝膠成像分析系統(tǒng)成像。

1.2.3 NL1/1-691誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 取重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-NL1/1-691 1 μL加入50 μL C43感受態(tài)中轉(zhuǎn)化，42 ℃熱激90 s，冰上靜置2 min，加入500 μL無抗培養(yǎng)基，37 ℃ 180 rpm水平搖床震蕩70 min，后涂布至含有100 μg/mL氨芐青霉素平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。第二日，挑單個(gè)菌落于含有100 μg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中(100 μg/mL)，37 ℃、180 rpm過夜，按1:200比例轉(zhuǎn)接到100 μg/mL(A+)LB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD值達(dá)到0.6左右時(shí)，分別加入0.1、0.3、0.5 mmoL/L IPTG 誘導(dǎo)2 h、3 h、4 h，16 ℃、25 ℃、37 ℃培養(yǎng)過夜，次日收集菌體，沉淀使用10 mL PBS重懸，超聲破碎、4 ℃離心，收集上清液過GST親和純化層析柱，GST標(biāo)簽純化樹脂用PBS清洗兩次。分別收集破碎后全菌3 μL、離心后上清15 μL、過柱流穿液15 μL、清洗后Beads 15 μL，加15 μL SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，15% SDS-PAGE檢測，篩選最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。(1)tNL1誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)機(jī)的優(yōu)化：挑取陽性克隆至5 mL氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 rpm活化過夜，次日按1:200接菌至1000 mL A+培養(yǎng)基中，37 ℃分別水平搖床震蕩菌2 h、3 h、4 h后降溫至25 ℃，加入0.5 mmoL IPTG誘導(dǎo)過夜16 h，按上述方法處理及檢測。(2)tNL1誘導(dǎo)表達(dá)溫度的優(yōu)化：挑取陽性克隆至5 mL氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 rpm活化過夜，次日按1:200接菌至1000 mL A+培養(yǎng)基中，37 ℃水平搖床震蕩3 h，分別降溫至16 ℃、25 ℃、37 ℃后加入0.5 mmoL IPTG誘導(dǎo)過夜16 h，按上述方法處理及檢測。(3)tNL1 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化：挑取陽性克隆至5 mL氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 rpm活化過夜，次日按1:200接菌至1000 mL A+培養(yǎng)基中，37 ℃水平搖床震蕩3 h，降溫至25 ℃后分別加入0.1 mmoL IPTG、0.3 mmo IPTG、0.5 mmoL IPTG誘導(dǎo)過夜16 h，按上述方法處理及檢測。

1.2.4 pEGx-6p1-NL1/1-691純化 按照上述純化方法、以最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)，收集后的菌液4500 rpm、離心15 min，收集菌體，10 mL PBS重懸菌體，加入1 mmoL DTT、2 mmoL PMSF，后超聲破碎，14000 rpm離心40 min收集上清，將上清過GST親和純化層析柱(時(shí)間>1 h)，2 mL PBS清洗3次，分別取超聲破碎后全菌、離心后上清、過柱流穿液、GST標(biāo)簽純化樹脂樣品，將純化后樣品SDS-PAGE。蛋白洗脫：GSH洗脫緩沖液(250 mM Tris Hcl，150 mM HCL，15 mM GSH，pH 8.0)，5 min吹打1次，每次半小時(shí)取流穿液共4次(總時(shí)長2 h)，得到帶GST標(biāo)簽的目的蛋白。

1.2.5 Western blot檢測NL1/1-691蛋白 將NL1/1-691蛋白樣品Western blot，條件為80 V恒壓30 min轉(zhuǎn)為120 V，切相應(yīng)大小膠體蛋白印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，150 mA恒流90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，加入一抗(1:1000比例稀釋)，4 ℃孵育過夜，次日使用1×TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，加入二抗(1:10000比例稀釋)孵育60 min，TBST清洗PVDF膜3次，將膜用ECL發(fā)光試劑顯色，超靈敏多功能成像儀成像。

2 結(jié)果

2.1 pGEx-6p-1-NL1/1-691質(zhì)粒構(gòu)建使用SnapGene軟件繪制質(zhì)粒圖譜，圖中顯示目的基因片段、GST親和純化標(biāo)簽、5'BamHI and 3'XhoI酶切位點(diǎn)、載體pGEX-6p-1(氨芐青霉素抗性)，如圖1所示。

圖1 pGEx-6p-1-NL1/1-691質(zhì)粒中目的片段、載體、酶切位點(diǎn)結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 pGEx-6p-1-NL1/1-691重組質(zhì)粒菌液PCR及雙酶切鑒定NL1/1-691細(xì)胞外全長片段2073 bp，優(yōu)化目的基因并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR驗(yàn)證。圖中第1、2、4道無明顯條帶，為陰性克?。?、5道有明顯的與目標(biāo)大小一致條帶，為陽性克隆(圖2)。挑取其中一個(gè)陽性克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，使用XholI、BamHI對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果顯示：DNA片段有相應(yīng)條帶，原核表達(dá)載體構(gòu)建無誤(圖3)。

圖2 pGEx-6p-1-NL1/1-691蛋白菌液PCR鑒定

圖3 pGEx-6p-1-NL1/1-691質(zhì)粒、雙酶切鑒定

2.3 NL1/1-691蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

2.3.1 NL1/1-691蛋白誘導(dǎo)條件檢測 本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建pGEx-6p1-NL1/1-691原核表達(dá)載體，經(jīng)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件后，重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，全菌表達(dá)量較高、上清表達(dá)微弱。由于包涵體蛋白純化難度較大，變性復(fù)性多因素不可控，因此本研究按照可溶性表達(dá)提取目的蛋白。另誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度的選擇對于蛋白表達(dá)有很大影響，菌液培養(yǎng)時(shí)間不同，OD 600 nm值不同[8]。摸索純化條件，SDS-PAGE顯示，表達(dá)的蛋白主要位于103 kDa左右。37 ℃培養(yǎng)3 h(圖4)后降溫到25 ℃(圖5)、加0.5 mmoL/L IPTG(圖6)誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量最高，并與目的蛋白大小一致。

圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間對NL1/1～691表達(dá)的影響

圖5 不同溫度對NL1/1～691蛋白表達(dá)的影響

圖6 不同濃度IPTG對NL1/1～691蛋白表達(dá)的影響

2.3.2 重組蛋白的純化與洗脫 按照上述摸索條件GST親和層析法純化重組蛋白，使用GSH蛋白洗脫緩沖液洗脫蛋白4次并收集，SDS～PAGE結(jié)果分析：經(jīng)GST純化成功得到NL1/1～691重組蛋白(圖7)。

圖7 重組蛋白的純化、洗脫

2.3.3 重組蛋白Western blot鑒定 由于蛋白表達(dá)載體pGEx-6P1可使pGEx-6p-1-NL1/1-691重組蛋白帶GST親和標(biāo)簽，Western blot鑒定時(shí)一抗選擇兔抗GST標(biāo)簽，二抗選擇羊抗兔。經(jīng)SDS蛋白凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后分析結(jié)果表明：蛋白可被抗原特異性結(jié)合，且大小與目的蛋白一致，在103 KDa左右(圖8)，原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖8 重組蛋白抗原性檢測

3 討論

近期研究顯示，AD的早期認(rèn)知能力下降與突觸丟失有關(guān)[3-4]。NL-1最初被關(guān)注是因其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與乙酰膽堿酯酶同源[9]，但缺乏一個(gè)關(guān)鍵殘基，現(xiàn)被證明其也是神經(jīng)突觸黏附對(Neuroxin-Neuroligin)中重要的一員。在興奮性突觸中，當(dāng)Aβ釋放到突觸間隙時(shí)，會與突觸后膜上的NL-1結(jié)合，結(jié)合后將引起更多Aβ寡聚體的局部聚集，最終影響突觸后區(qū)域，引發(fā)AD。雖然Aβ1-42寡聚體治病機(jī)理目前在分子水平上尚不十分清楚，但NL1可能為Aβ寡聚體的靶向蛋白。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建并檢測表達(dá)了NL1/1-691重組蛋白，下一步將研究NL1/1-691蛋白對Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸功能的影響。最初的蛋白純化過程N(yùn)L1/1-691呈包涵體表達(dá)，因包涵體純化較為復(fù)雜，變性復(fù)性較難掌握，我們在實(shí)驗(yàn)中盡量降低包涵體的生成[10-11]。通過25 ℃誘導(dǎo)后不斷改進(jìn)IPTG濃度：0.1 mmoL/L、0.3 mmoL/L、0.5 mmoL/L，篩選出最佳IPTG濃度為0.5 mmoL/L。經(jīng)過對IPTG濃度、時(shí)間、溫度等條件的摸索，成功表達(dá)并純化出高純度的重組蛋白NL1/1-691。本課題使用GST融合蛋白，釋放出天然結(jié)構(gòu)的NL1/1-691，保留了瓊脂糖極好的親水性及大網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，與生物活性大分子有很好的相容性，具有載量高、非特異性吸附少，流速快等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建NL1/1-691原核表達(dá)載體，使用可溶性蛋白純化方法得到重組蛋白，其表達(dá)量較低，后續(xù)大量純化后可過離子交換柱或凝膠柱來富集目的蛋白，同時(shí)去除GST標(biāo)簽。下一步實(shí)驗(yàn)將重組蛋白應(yīng)用于細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，為研究阿爾茲海默病治療提供新理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建NL1/1-691原核表達(dá)載體，NL1/1-691蛋白最佳純化條件為：25 ℃培養(yǎng)2 h加IPTG誘導(dǎo)為最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為12 h。