楊立品

(許昌市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 許昌 461000)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的85%，其發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響著人類的健康安全[1]。探究預(yù)示NSCLC預(yù)后的指標(biāo)有著重要意義，不僅可了解患者預(yù)后情況，還可幫助臨床醫(yī)師采取有效措施進(jìn)行干預(yù)。NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程與基因和信號通路的異常表達(dá)關(guān)系密切，研究參與其發(fā)生、發(fā)展過程中的分子標(biāo)志物是近年來的熱點(diǎn)。有研究[2]表明自噬可通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而增加預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。網(wǎng)狀蛋白1C(reticulin 1C，RTN-1C)是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白[3]，與自噬密切相關(guān)，干擾其表達(dá)可調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬過程[4]，NSCLC細(xì)胞自噬程度與患者預(yù)后密切相關(guān)，有理由推測RTN-1C與NSCLC預(yù)后有關(guān)。目前，關(guān)于RTN-1C與NSCLC預(yù)后的關(guān)系尚不清楚，因此，本研究分析二者之間的關(guān)系，以期為NSCLC的預(yù)后評估和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年1月至2017年9月間在許昌市中心醫(yī)院就診的116例NSCLC患者作為研究對象。根據(jù)手術(shù)病理活檢、支氣管鏡檢查或胸腔積液細(xì)胞學(xué)檢查等診斷NSCLC。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)明確診斷為NSCLC；(2)接受根治性手術(shù)切除治療；(3)有保存完好的存放于液氮罐中的NSCLC組織；(4)配合完成研究隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)根治性手術(shù)前接受了放、化療或免疫治療等；(2)其他惡性腫瘤；(3)未簽署知情同意書；(4)臨床資料不完整。116例NSCLC患者年齡46～69(58.20±5.14)歲；男性79例，女性37例；78例有吸煙史；TNM分期Ⅰ期18例，Ⅱ期25例，Ⅲ期73例；腺癌60例，鱗癌56例；分化程度低分化63例，中、高分化53例。本研究經(jīng)許昌市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 信息收集收集入組NSCLC患者年齡、性別、吸煙史、NSCLC病理類型、分化程度、TNM分期和生存預(yù)后等信息。用電話或復(fù)診方式了解入組NSCLC患者術(shù)后3年生存預(yù)后情況，每3個月隨訪1次，末次隨訪時間為2020年10月8日，隨訪終點(diǎn)為隨訪過程中死亡或至末次隨訪結(jié)束。

1.3 RTN-1C水平檢測用蛋白質(zhì)免疫印跡法[5]檢測NSCLC患者癌組織和外周血單個核細(xì)胞中RTN-1C水平。抽取入組NSCLC患者根治性切除術(shù)前、術(shù)后24 h內(nèi)空腹外周靜脈血10 mL，用Ficoll分離液分離出外周血中單個核細(xì)胞。用RIPA裂解液分離出NSCLC組織和外周血單個核細(xì)胞中總蛋白；凝膠電泳由80 V至120 V至溴酚藍(lán)跑出膠面；轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；滴加兔抗人RTN-1C單克隆抗體(武漢維克賽斯科技有限公司)，4 ℃環(huán)境下孵育過夜；滴加山羊抗兔二抗(北京百奧萊博科技有限公司)，室溫下孵育2 h；用化學(xué)發(fā)光底物液顯影，然后用Image J軟件讀取蛋白質(zhì)免疫印跡圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 23.0軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；組間比較用配對樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率[n(%)]表示，組間比較用卡方檢驗(yàn)。用Perason相關(guān)分析NSCLC患者癌組織和外周血單個核細(xì)胞中RTN-1C水平的相關(guān)性。用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析RTN-1C評價NSCLC預(yù)后的價值。用Kaplan-Meier繪制NSCLC患者生存曲線，并用Log-Rank法比較差異。用COX回歸分析NSCLC預(yù)后的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RTN-1C在NSCLC患者癌組織和外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)NSCLC患者癌組織和外周血單個核細(xì)胞中RTN-1C水平分別為(0.98±0.12)和(0.64±0.12)，二者呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.303，P=0.001)，見圖1。

圖1 RTN-1C在NSCLC患者癌組織和外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 兩組外周血單個核細(xì)胞中RTN-1C水平116例NSCLC患者3年生存率為43.10%(50/116)，中位生存時間為26個月。根據(jù)3年生存預(yù)后情況將NSCLC分為2組：生存組(n=50)和死亡組(n=66)。生存組的術(shù)前RTN-1C、術(shù)后RTN-1C水平均低于死亡組，ΔRTN-1C水平高于死亡組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組外周血單個核細(xì)胞中RTN-1C水平比較

2.3 RTN-1C評價NSCLC預(yù)后的價值術(shù)后RTN-1C評價NSCLC預(yù)后的ROC曲線下面積大于術(shù)前RTN-1C和RTN-1C，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.895、4.182，P<0.001)，見表2、圖2A。以術(shù)后RTN-1C評價NSCLC預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)為界值，將其分為2組：高RTN-1C組(n=59)和低RTN-1C組(n=57)。高RTN-1C組的中位生存時間為19個月，低于低RTN-1C組(36個月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rankχ2=31.811，P<0.001)，見圖2B。

表2 RTN-1C評價NSCLC預(yù)后的價值

圖2 RTN-1C評價NSCLC預(yù)后的價值

2.4 NSCLC預(yù)后的COX回歸分析將NSCLC預(yù)后作為因變量，將年齡、性別、吸煙史、腫瘤直徑、病理類型、分化程度、TNM分期和術(shù)后RTN-1C作為自變量，分別納入COX回歸分析，結(jié)果顯示分化程度、TNM分期和術(shù)后RTN-1C與NSCLC預(yù)后有關(guān)(P<0.05)；將NSCLC預(yù)后作為因變量，將分化程度、TNM分期和術(shù)后RTN-1C作為自變量，一并納入COX回歸分析，結(jié)果顯示分化程度高是NSCLC預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)，TNM分期Ⅲ期和術(shù)后RTN-1C>0.49是NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3。

表3 NSCLC預(yù)后的COX回歸分析

3 討論

NSCLC是呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，多因遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥或局部侵襲等，NSCLC死亡的患者數(shù)量逐年增加[6]。自噬是一種通過降解自身衰老細(xì)胞器或大分子物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)自身代謝或細(xì)胞器更新的過程[7]，其在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，一方面癌細(xì)胞可通過自噬抑制自身凋亡；另一方面癌細(xì)胞通過自噬調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低放、化療療效，進(jìn)而影響預(yù)后[8]。本研究分析NSCLC組織和外周血單個核細(xì)胞中RTN-1C水平，結(jié)果顯示二者間呈正相關(guān)關(guān)系，有理由用外周血單個核細(xì)胞中RTN-1C水平反映NSCLC組織中RTN-1C水平。通過比較生存組和死亡組RTN-1C水平，結(jié)果顯示生存組的術(shù)前RTN-1C、術(shù)后RTN-1C水平均低于死亡組，ΔRTN-1C水平高于死亡組，該結(jié)果提示RTN-1C水平與NSCLC預(yù)后有關(guān)，或可作為其預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。

為進(jìn)一步分析RTN-1C與NSCLC預(yù)后的關(guān)系，本研究構(gòu)建了RTN-1C評價NSCLC預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示術(shù)后RTN-1C評價NSCLC預(yù)后的ROC曲線下面積、敏感度和特異度分別為0.858、75.76%和82.00%，其價值高于術(shù)前RTN-1C和RTN-1C，上述結(jié)果表明術(shù)后RTN-1C對于NSCLC預(yù)后評估有一定價值，可輔助用于預(yù)后評估。通過比較高RTN-1C組和低RTN-1C組生存情況，結(jié)果顯示高RTN-1C組的中位生存時間低于低RTN-1C組，該結(jié)果進(jìn)一步說明RTN-1C與NSCLC預(yù)后有關(guān)。

既往研究[9]表明NSCLC預(yù)后與TNM分期、腫瘤分化程度等因素有關(guān)。本研究避免混雜因素影響分析結(jié)果，采用COX回歸分析了影響NSCLC預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示分化程度高是NSCLC預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，TNM分期Ⅲ期是NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，上述結(jié)果與既往研究結(jié)果一致。此外，本研究結(jié)果還顯示術(shù)后RTN-1C>0.49是NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，推測其原因是RTN-1C反映腫瘤細(xì)胞的自噬水平，腫瘤細(xì)胞的自噬水平與其自身凋亡及靶向治療、放、化療的療效密切相關(guān)，當(dāng)自噬水平增加時，腫瘤細(xì)胞凋亡被抑制，此外，其還可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等逃避放、化療誘發(fā)的損傷，上述過程均會導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良。

綜上所述，NSCLC患者根治性切除手術(shù)后外周血單個核細(xì)胞中RTN-1C水平高提示預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)高。本研究僅從蛋白質(zhì)組學(xué)層面分析了RTN-1C與NSCLC預(yù)后的關(guān)系，RTN-1C在NSCLC發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制及上下游靶標(biāo)等還需進(jìn)一步研究闡明。