林妙金，郭木娟，潘 廣，何詩淇，吳建輝，邱寶利，潘慧鵬*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學，植物保護學院，廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應用重點實驗室，廣州 510642；2. 廣州國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新中心，廣州 510520)

茄二十八星瓢蟲Henosepilachnavigintioctopunctata屬于鞘翅目瓢蟲科，是茄科和葫蘆科蔬菜上的重要害蟲。茄二十八星瓢蟲在全國各地分布，以長江以南地區(qū)發(fā)生和為害較為嚴重(涂小云和王國紅，2010；周雷等，2014)。當前，茄二十八星瓢蟲的防治主要依賴于化學殺蟲劑，但是過量使用化學農(nóng)藥會使害蟲產(chǎn)生抗藥性，同時也會殺傷天敵以及傳粉昆蟲等有益生物(涂小云和王國紅，2010)，所以，迫切需要創(chuàng)制防治茄二十八星瓢蟲的環(huán)境友好型的新方法。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象(Fireetal., 1998)。以RNAi為基礎的RNAi抗蟲技術，通過干擾控制害蟲發(fā)育或重要行為的關鍵基因，阻礙害蟲正常的生長和繁殖，甚至直接導致害蟲死亡，從而達到害蟲防控的目的(Baumetal., 2007)。dsRNA在生物體內(nèi)普遍存在，在環(huán)境中易降解，因此無毒、無殘留，是一種新型綠色環(huán)保的害蟲防控方法，展現(xiàn)出了廣闊的應用前景。而獲得高效安全的致死靶標基因是利用RNAi技術進行害蟲防治的關鍵。近兩年，本團隊建立了茄二十八星瓢蟲飼喂法RNAi的技術體系，在茄二十八星瓢蟲中鑒定得到了幾個致死能力較高的靶標基因，如HvvATPaseB(Lüetal., 2020a)、HvRPS18和HvRPL13(Lüetal., 2020b)、HvSnf7(Lüetal., 2020c)、HvvATPaseA和HvvATPaseE(Guoetal., 2021)、Hvlwr(Lüetal., 2021a)、HvαCOPI和HvγCOPI(Lüetal., 2021b)等。未來，一旦對RNAi抗性決定因素和抗性機制有了更好的了解，發(fā)現(xiàn)其他RNAi致死靶標基因?qū)⒂兄诨赗NAi技術的茄二十八星瓢蟲防控技術的發(fā)展。

細胞凋亡是細胞程序性死亡，是細胞自殺的一種進化保守途徑(Vauxetal., 1994)。在昆蟲體內(nèi)，激活和抑制細胞死亡之間建立了動態(tài)平衡，這一高度調(diào)控的過程涉及了許多基因和信號通路。細胞凋亡在昆蟲的發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和天然抗病毒反應的許多過程中起著重要作用(Parthasarathyetal., 2008；Miuraetal., 2011)。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein 1,IAP1)是一種廣泛存在且高度保守的抗凋亡蛋白，通過多種機制在細胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用，而IAP1為其主要成員(王珮琳等，2019)。最近研究發(fā)現(xiàn)，干擾赤擬谷盜Triboliumcastaneum幼蟲TcIAP1基因表達后能導致其死亡且能觀察到其消化道細胞從肛門排出的現(xiàn)象。消化道細胞被排出可能是由于干擾IAP1基因表達后，導致赤擬谷盜中腸細胞IAP1基因表達水平降低，引起中腸細胞凋亡速率增加(Yoonetal., 2020)。Mills等(2017)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過dsCsIAP1處理后蠓Culicoidessonorensis成蟲的中腸組織IAP1表達顯著下降，且中腸組織細胞受到嚴重的損害，最終使其壽命縮短。由此可見，IAP1基因在昆蟲的生長發(fā)育和代謝過程中發(fā)揮了重要作用。

本研究利用飼喂法RNAi，致力于評價HvIAP1基因是否可以作為茄二十八星瓢蟲防控的高效靶標基因，為實現(xiàn)基于HvIAP1基因的茄二十八星瓢蟲綠色防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

茄二十八星瓢蟲于2018年4月采集自廣州華南農(nóng)業(yè)大學校園溫室內(nèi)的龍葵葉片上，繼代飼養(yǎng)于廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應用重點實驗室，飼養(yǎng)材料為茄子和龍葵葉片，茄二十八星瓢蟲和葉片均放入帶有濾紙和保濕棉球的培養(yǎng)皿中，置于人工氣候箱(溫度25±1℃，相對濕度70%～80%，光周期14 L ∶10 D)(Lüetal., 2018)。

1.2 HvIAP1基因在茄二十八星瓢蟲不同發(fā)育階段的表達模式

1.2.1樣品收集

茄二十八星瓢蟲不同發(fā)育階段每個重復的取樣個體數(shù)如下：卵20頭、1齡幼蟲10頭、2齡幼蟲5頭、3齡幼蟲3頭、4齡幼蟲1頭、蛹1頭、雌、雄成蟲各1頭，每個樣本分別收集3個生物學重復，所有樣本均置于1.5 mL無RNA酶的離心管中，用液氮迅速冷凍，在提取RNA前置于-80℃冰箱冷凍保存。

1.2.2總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

使用TRIzol法對茄二十八星瓢蟲的不同發(fā)育階段樣品進行RNA提取(Invitrogen, United States)。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量并使用儀器NanoDrop OneC分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA United States)測定RNA濃度，所有樣本RNA的OD260/OD230在1.8～2.2之間。使用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time，Takara, RR047A)，根據(jù)說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所有的cDNA稀釋10倍用于后續(xù)實驗。

1.2.3HvIAP1基因在茄二十八星瓢蟲不同發(fā)育階段中的表達模式

選取基因RPL13和RPS18作為內(nèi)參基因(Lüetal., 2018)，對HvIAP1基因在茄二十八星瓢蟲不同發(fā)育階段中的表達模式進行RT-qPCR分析(引物序列見表1)。RT-qPCR反應體系：cDNA模板2.5 μL、引物F和R(10 μM)各2.5 μL、TB Green 25 μL，ddH2O 17.5 μL。qPCR反應程序為3個階段，分別為變性階段95℃，30 s；定量分析階段(95℃， 5 s；60℃， 30 s)40個循環(huán)；熔解曲線95℃， 5 s(4.4℃/s)，60℃(2.2℃/s)，95℃(0.11℃/s，每上升1℃拍照5次)。反應在96孔板Microseal PCR plates(BIO-RAD Inc., USA)中進行，RT-qPCR的反應儀器為Bio-Rad C1000 Real-Time PCR system(Bio-Rad C1000 Real-Time PCR system, BIO-RAD, USA)。最終的結果計算采用2-△△Ct法(Ct表示循環(huán)數(shù))進行計(Livak and Schmittgen, 2001)。

1.3 取食dsRNA的RNAi效應

1.3.1dsRNA的體外合成

根據(jù)茄二十八星瓢蟲轉(zhuǎn)錄組(PRJNA592380)獲得HvIAP1基因的部分序列，利用E-RNAi網(wǎng)站(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//)設計dsHvIAP1和dsGFP的特異性引物(表1)。PCR反應體系：ddH2O 35 μL、2×PCR Taq MasterMix 50 μL、cDNA/GFP質(zhì)粒5 μL、上游引物(10 μM)5 μL、下游引物(10 μM)5 μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min(Lüetal., 2021a)。

表1 本實驗所用的引物Table 1 Primers used in this experiment

反應完成后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測上述2種PCR產(chǎn)物，然后使用DNA純化回收試劑盒(Universal DNA Purification Kit, TIANGEN, China)回收，作為合成dsRNA的模版。使用MEGAscriptTMT7試劑盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)，根據(jù)說明書步驟合成dsRNA。dsRNA的合成體系：10×Reaction Buffer 5 μL、ATP Solution 5 μL、GTP Solution 5 μL、CTP Solution 5 μL、UTP Solution 5 μL、PCR回收產(chǎn)物1 μg、Enzyme mix 5 μL，用RNase-Free Water補足50 μL。上述體系混勻后，置于37°C 4 h。反應結束后加入2.5 μL的TURBO DNase去除殘留的模版DNA和單鏈RNA，然后純化dsRNA，用50 μL ddH2O溶解dsRNA后，置于-80℃冰箱中保存，分別得到dsHvIAP1和dsGFP。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA質(zhì)量并使用儀器NanoDrop OneC分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA United States)測定dsRNA濃度(Lüetal., 2021a)。

1.3.2dsHvIAP1對茄二十八星瓢蟲的沉默效率影響

為了探究取食dsHvIAP1對茄二十八星瓢蟲基因表達的影響，茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲分別用200 ng/μL dsHvIAP1和dsGFP進行飼喂法RNAi處理，24 h后收集5頭幼蟲為1個生物學重復。用200 ng的dsHvIAP1和dsGFP分別飼喂單頭茄二十八星瓢蟲4齡幼蟲，48 h后收集1頭幼蟲為1個生物學重復。所有樣本均設置3個生物學重復。液氮速凍后，-80℃儲存。提取所收集樣品的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用RT-qPCR分析dsHvIAP1對茄二十八星瓢蟲的沉默效率。

1.3.3dsRNA對茄二十八星瓢蟲的存活率和取食的影響

茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲處理組(dsHvIAP1)：在放有濾紙和加濕棉球的培養(yǎng)皿中放入10頭茄二十八星瓢蟲的1齡幼蟲，10頭為1個重復，設置5個重復，用濃度200 ng/μL的dsHvIAP1溶液浸泡直徑為12 mm的圓形龍葵葉片1 min，風干后飼喂幼蟲，每隔24 h更換一次葉片，飼喂用dsHvIAP1浸泡的葉片2 d后，用未經(jīng)處理的茄子葉片每天飼喂幼蟲。以相同濃度和方法設置對照組(dsGFP)。培養(yǎng)皿置于人工氣候箱中(溫度25±1℃，相對濕度70%～80%，光周期14 L ∶10 D)。每隔24 h統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中茄二十八星瓢蟲的死亡數(shù)目，并計算存活率。同時拍照觀察和記錄處理組和對照組茄二十八星瓢蟲的取食和生長發(fā)育情況差異(Lüetal., 2020c)。

茄二十八星瓢蟲4齡幼蟲處理組(dsHvIAP1)：4齡幼蟲饑餓處理24 h后，每頭4齡幼蟲飼喂1 μL濃度為200 ng/μL dsHvIAP1，1頭幼蟲為1個重復，共設置20個重復，然后將幼蟲放入帶有濾紙和加濕棉球的培養(yǎng)皿中，用直徑為30 mm圓形龍葵葉片每天飼喂幼蟲。以相同濃度和方法處理對照組(dsGFP)。培養(yǎng)皿置于人工氣候箱中(溫度25±1℃，相對濕度70%～80%，光周期14 L ∶10 D)。每隔24 h統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中茄二十八星瓢蟲的死亡數(shù)量，并計算存活率的變化。同時拍照觀察和記錄處理和對照條件下茄二十八星瓢蟲的取食和生長發(fā)育情況(Lüetal., 2020c)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

單因素方差分析用于比較HvIAP1在茄二十八星瓢蟲不同發(fā)育階段之間的表達水平，使用Tukey檢驗進行兩兩比較。單因素方差分析(Breslow兩兩比較，P<0.05)用于檢驗飼喂dsRNA后，對照和處理之間的死亡率差異，使用Cox回歸程序創(chuàng)建基于幼蟲死亡率的生存曲線。

2 結果與分析

2.1 HvIAP1基因在茄二十八星瓢蟲不同發(fā)育階段中的表達模式

茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲和3齡幼蟲中HvIAP1基因表達量最高，2齡幼蟲的基因表達量次之，卵、4齡幼蟲和蛹中HvIAP1的表達量無差異，雌蟲和雄蟲表達量最低(圖1)(F7, 16=37.799,P<0.05)。

圖1 HvIAP1基因在茄二十八星瓢蟲不同發(fā)育階段中的表達模式Fig.1 Expression profiles of HvIAP1 across developmental stages in Henosepilachna vigintioctopunctata注：圖中數(shù)值為平均值+標準誤。不同字母表示組間差異顯著(Tukey, P<0.05)。Note: Values were means+SE. Different letters indicated differences in gene expression at P<0.05.

2.2 dsHvIAP1對茄二十八星瓢蟲沉默效率的影響

RT-qPCR分析結果表明，dsHvIAP1飼喂茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲和4齡幼蟲后，其HvIAP1基因的表達水平被顯著抑制，與對照組相比，分別明顯下降了2.40倍(F1,4= 976.597,P<0.05)(圖2-A)和2.58倍(F1,4= 848.499,P<0.05)(圖2-B)。

圖2 取食dsHvIAP1對茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲(A)和4齡幼蟲(B)HvIAP1的沉默效率影響Fig.2 Effect of ingestion of dsHvIAP1 on the expression of HvIAP1 in 1st instar larvae (A)and 4th instar larvae (B)of Henosepilachna vigintioctopunctata注：圖中數(shù)值為平均值±標準誤，不同字母表示組間差異顯著(Tukey, P<0.05)。Note: Values were means±SE， Different letters indicated differences in gene expression at P<0.05.

2.3 dsRNA對茄二十八星瓢蟲存活率的影響

與對照組相比，經(jīng)過dsHvIAP1處理的茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲死亡率顯著上升，處理后第10天其死亡率達92%(P< 0.0001)，特別是在取食dsRNA后的第2天和第3天，死亡個數(shù)驟增(圖3-A)。在茄二十八星瓢蟲4齡幼蟲中，與dsGFP相比，取食200 ng的dsHvIAP1后的前6 d其死亡率急速上升，處理后第10天致死率為70%(圖3-B)(P< 0.0001)。

圖3 dsHvIAP1對茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲(A)和4齡幼蟲(B)存活率的影響Fig.3 Effect of dsHvIAP1 on survival rate of 1st instar larvae (A)and 4th instar larvae (B)of Henosepilachna vigintioctopunctata注：圖中不同字母表示組間差異顯著(P<0.0001)。Note: Different letters indicated differences in gene expression at P<0.0001.

2.4 dsRNA對茄二十八星瓢蟲取食和生長發(fā)育的影響

與對照相比，使用dsHvIAP1分別飼喂茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲和4齡幼蟲后均出現(xiàn)取食明顯減少或不取食的情況(圖4，圖5)。在1齡幼蟲中，dsGFP處理后第3天，全部發(fā)育為2齡幼蟲，但dsHvIAP1處理后第3天組中存活的個體仍然處于1齡幼蟲階段。同樣地，在4齡幼蟲的實驗中，當對照組發(fā)育到蛹期時，處理組中所有存活的個體仍處于4齡幼蟲階段。該結果表明dsHvIAP1能導致茄二十八星瓢蟲幼蟲生長發(fā)育受阻。

圖4 飼喂dsHvIAP1和dsGFP后茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲在24 h和48 h取食葉片情況Fig.4 Representative leaf consumed by the 1st instars ofHensosepilachna vigintioctopuntata after ingestion of dsHvIAP1 and dsGFP at 24 h and 48 h time point

圖5 飼喂dsHvIAP1和dsGFP后茄二十八星瓢蟲4齡幼蟲在24 h、48 h和72 h取食葉片情況Fig.5 Representative leaf consumed by the 4th instars of Hensosepilachna vigintioctopuntata after ingestion of dsHvIAP1 and dsGFP at 24 h, 48 h and 72 h time point

3 結論與討論

本研究通過飼喂dsHvIAP1來抑制茄二十八星瓢蟲HvIAP1基因的表達，誘導了茄二十八星瓢蟲急性進食障礙，并導致其1齡幼蟲和4齡幼蟲發(fā)育緩慢以及較高的死亡率。這些結果表明，HvIAP1基因可以作為茄二十八星瓢蟲防控的高效靶標基因。

IAP1基因的表達模式在不同昆蟲和不同發(fā)育階段中存在差異。Powell等(2017)發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅DrosophilamelanogasterDmIAP1基因在蛹期表達量最高，其他發(fā)育階段的表達量都較低；Cao等(2018)發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜TcIAP1基因在其卵期表達量最高，在幼蟲發(fā)育階段處于較低水平，然后在預蛹和蛹期表達量再次上升。本研究采用RT-qPCR對茄二十八星瓢蟲不同發(fā)育階段中HvIAP1基因的表達進行了分析，發(fā)現(xiàn)其在茄二十八星瓢蟲的成蟲期表達量最低，在其他發(fā)育階段的表達均較高，1齡幼蟲和3齡幼蟲的表達量最高，表明HvIAP1基因在茄二十八星瓢蟲的生長發(fā)育過程中起著重要的作用。

茄二十八星瓢蟲HvIAP1基因的沉默導致較高的死亡率。本實驗中，1齡幼蟲取食dsHvIAP1后的第2天，死亡率接近50%，到第3天，累計接近80%幼蟲死亡。而Lü等(2021a)發(fā)現(xiàn)干擾茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲Hvlesswright基因，同樣是飼喂200 ng/μL dsRNA處理的葉片，干擾實驗開始后的第7天，死亡率達到50%，干擾后的第9天，死亡率達到80%。由此可見，dsHvIAP1對于茄二十八星瓢蟲有更高效的致死作用，突顯了HvIAP1基因作為茄二十八星瓢防治候選靶標基因的巨大潛力。

除了快速的高致死率，dsHvIAP1干擾茄二十八星瓢蟲幼蟲后，還導致了其具有急性進食障礙。在dsRNA飼喂試驗中，HvIAP1基因沉默會導致1齡幼蟲和4齡幼蟲48 h內(nèi)急性停止進食，并且這種進食障礙現(xiàn)象持續(xù)至其死亡，這種現(xiàn)象也直接保護了作物免受蟲害。一般認為，害蟲的死亡可以使作物得到直接保護，而本實驗出現(xiàn)了急性的取食障礙，也直接保護了作物，可以認為這是害蟲防治的另一個新標準(Guoetal., 2021)。HvIAP1基因沉默引起的茄二十八星瓢蟲急性進食障礙的機制尚不清楚，它可能與中腸組織的細胞凋亡程度增加、中腸組織的完整性和大小受到嚴重損害有關。

RNAi作為一種具備高效、特異、環(huán)境友好型的新技術，在基因功能研究以及害蟲防治的領域展現(xiàn)巨大的潛力，為害蟲控制方法提供了新思路和新途徑。而在本研究中，飼喂dsHvIAP1能引發(fā)茄二十八星瓢蟲強烈的RNAi反應，因此，HvIAP1基因是一個潛在的可高效防治茄二十八星瓢蟲候選靶標基因。