李淑琴，陳振江，陳泰祥，李秀璋，慕彪彪，李春杰*

（1.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心，蘭州大學甘肅省西部草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州730020；2.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧810016；3.蘭州市生態(tài)林業(yè)試驗總場，甘肅 蘭州730085）

De Bary［1］于1866年最早提出內(nèi)生菌（endophyte）的概念，用以區(qū)別植物表面的表生菌［1-2］，他將生活在植物組織內(nèi)的微生物統(tǒng)稱為內(nèi)生菌。1898年Vogl從黑麥草（Lolium perenne）種子內(nèi)分離出來第一株內(nèi)生真菌［3］，國內(nèi)外學術(shù)界對于內(nèi)生真菌的研究已經(jīng)有一百多年的歷史，但直到八十年代初才開始被重視［4-5］。從目前的研究結(jié)果來看，內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)普遍存在［2］，包括禾草［6-8］與非禾草［9-11］。

禾草內(nèi)生真菌是指生長在禾本科草類植物體內(nèi)并完成全部或大部分生活周期，但不導(dǎo)致禾草外部癥狀的一類真菌［12-13］，主要是指子囊菌綱（Ascomycetes），麥角菌科（Clavicipitaceae），瘤座菌族（Balansieae）的香柱菌屬（Epichlo?）［13-15］。主要通過種子進行垂直傳播而侵染新的宿主禾草，與禾草形成互惠共生的關(guān)系。李翠英［16］于1989年首次對31份高羊茅（Festuca arundanacea）和21份多年生黑麥草進行了內(nèi)生真菌的檢測。后續(xù)我國學者對醉馬草（Achnatherum inebrians）、野大麥（Hordeum brevisubulatum）、鵝觀草（Roegneria kamoji）、雀麥草（Bromusjaponicus）和中華羊茅（Festuca elata）等禾草的Epichlo?屬內(nèi)生真菌進行了一系列研究報道，主要集中在內(nèi)生真菌多樣性、次生代謝產(chǎn)物、抗逆生物學以及生態(tài)學等方面。到目前為止，我國學者至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了21個屬，77種禾草中存在Epichlo?屬內(nèi)生真菌［17］。Epichlo?屬內(nèi)生真菌是一類特殊的微生物，一方面，在調(diào)節(jié)植株生長中發(fā)揮著重要作用，它可以促進禾草的生長，提高宿主禾草對多種非生物脅迫和生物脅迫的抗性［18-19］，例如，抗旱［20］、耐鹽［19］、耐金屬［21］、抗?。?2］、抗蟲［23］等。另一方面，由于內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生生物堿，主要有吲哚雙萜類（indolditerpenes），麥角堿類（ergot）、黑麥草堿（peramine）以及波胺（lolines），其中前兩種生物堿能夠?qū)倚螽a(chǎn)生毒性，引起取食了內(nèi)生真菌侵染的禾草的家畜中毒，給畜牧業(yè)造成重大損失，影響草地畜牧業(yè)的健康發(fā)展。而波胺和黑麥草堿能夠?qū)ハx產(chǎn)生毒性，提高了宿主植物的抗蟲性。

非禾草內(nèi)生真菌對它們的宿主植物的生長發(fā)育同樣發(fā)揮著重要作用，非禾草內(nèi)生真菌共生體同樣能夠提高宿主植物抗逆性。在非禾草中，內(nèi)生真菌是某些特殊植物的營養(yǎng)來源，是植株正常生長發(fā)育、生殖發(fā)育必不可少的條件［24］，其次利用內(nèi)生真菌生產(chǎn)植物原藥、功能化合物方面顯示出巨大潛力，以及內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物可能具有抗菌活性［25］、抗腫瘤活性［26］、抗HIV活性［27］、抗氧化活性［28］等特點。例如紫杉醇，最初從短葉紅豆杉（Taxuschinensis）樹皮中分離出來，能阻止癌細胞的擴散，是一種著名的抗腫瘤劑，并經(jīng)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，可以利用內(nèi)生真菌來合成紫杉醇，又因該方法生長速率高，培養(yǎng)條件易掌握，易獲得大量培養(yǎng)物而被廣泛關(guān)注［26，29-30］。

我國幅員遼闊，生態(tài)系統(tǒng)豐富多彩，空間格局復(fù)雜多樣，是世界上物種資源最豐富的國家。其中動物、植物、微生物以及環(huán)境所構(gòu)成的生態(tài)系統(tǒng)中，微生物發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，我國擁有豐富的草地資源，分布于東北平原、內(nèi)蒙古高原、鄂爾多斯高原、黃土高原以及青藏高原等各類天然草地，約有4億hm2，占全國國土面積的41.7%［31］。內(nèi)生真菌分布廣、種類多，普遍存在于每種植物中，此外內(nèi)生真菌所產(chǎn)生的次生代謝物也是多種多樣，這對于內(nèi)生真菌的研究和開發(fā)提供了巨大的空間。

近年來，大量相關(guān)科技文獻的涌現(xiàn)，使得文獻計量得到重視。文獻計量學是指利用科技文獻和信息科學，統(tǒng)計相關(guān)文獻的數(shù)據(jù)，并對其進行定量分析，來明確某一研究領(lǐng)域的發(fā)展趨勢，能夠為相關(guān)研究人員提供所在領(lǐng)域的發(fā)展現(xiàn)狀以及研究趨勢，能夠更好地為研究領(lǐng)域和研究方向的選擇提供參考。隨著科學研究和技術(shù)的不斷發(fā)展，內(nèi)生真菌在農(nóng)業(yè)科技應(yīng)用、綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面的重要性日益凸顯出來。我國在內(nèi)生真菌方面發(fā)表了大量的研究論文，但到目前為止，缺乏對內(nèi)生真菌以及禾草與非禾草內(nèi)生真菌發(fā)展進程的差距相關(guān)文獻的系統(tǒng)解讀。因此，將基于CNKI數(shù)據(jù)庫對禾草Epichlo?屬內(nèi)生真菌和非禾草內(nèi)生真菌的文獻進行計量分析，以明確國內(nèi)對內(nèi)生真菌相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點、研究空白、存在的問題以及與國際上內(nèi)生真菌相關(guān)研究存在的差距，為內(nèi)生真菌的進一步深入研究提供良好的借鑒與參考。

1 材料與方法

以中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）為數(shù)據(jù)來源，選用內(nèi)生真菌為關(guān)鍵詞，發(fā)表年份為1999年10月31日—2019年10月31日，進行高級檢索，共檢索到相關(guān)的文獻5333篇，以此作為文獻數(shù)據(jù)來源，手動挑選與禾草Epichlo?屬內(nèi)生真菌研究相關(guān)的論文，共挑選到377篇文獻?；谖墨I計量法分析，從論文的發(fā)表年份、數(shù)量、發(fā)表期刊、文獻科研機構(gòu)、所屬的學科、研究機構(gòu)和關(guān)鍵詞詞頻等方面進行統(tǒng)計和比較［32］。其中，對于禾草內(nèi)生真菌關(guān)鍵詞的統(tǒng)計與比較，利用Citespace對377篇的關(guān)鍵詞頻度進行分析，并構(gòu)建關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 全國禾草與非禾草內(nèi)生真菌論文發(fā)表情況及分析

1999-2019 年，共檢索到內(nèi)生真菌相關(guān)文獻5333篇，其中禾草內(nèi)生真菌相關(guān)文獻377篇。內(nèi)生真菌年發(fā)文量總體呈現(xiàn)不斷上升的趨勢（圖1），但禾草內(nèi)生真菌的年發(fā)文量，變化趨勢較小，2014年以前整體呈現(xiàn)上升的趨勢，其中2015年達到峰值，年發(fā)文量為69篇。從2015年以后又呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。擬合方程為y=2.1558x-4299.2，（其中x為發(fā)表文獻年份，y為年發(fā)文量），R2為0.6457，可表示發(fā)表年份與年發(fā)文量的關(guān)系。而非禾草內(nèi)生真菌研究相關(guān)文獻在20年內(nèi)發(fā)文量呈現(xiàn)較大幅度的增加，2016年以前呈現(xiàn)出線性增長的態(tài)勢，在2016年達到一個峰值，之后稍微有所降低。將非禾草內(nèi)生真菌文獻數(shù)量根據(jù)所在年度進行數(shù)據(jù)擬合，得到的擬合方程為y=24.406x-48811，（其中x為發(fā)表文獻年份，y為年發(fā)文量），R2=0.9022，線性擬合程度較好，表明國內(nèi)學術(shù)界對非禾草內(nèi)生真菌研究的重視程度越來越明顯。從20年發(fā)文量來看，國內(nèi)禾草內(nèi)生真菌的發(fā)文數(shù)量遠遠小于非禾草內(nèi)生真菌。

圖1 1999-2019年在CNKI數(shù)據(jù)庫中禾草內(nèi)生真菌與非禾草內(nèi)生真菌相關(guān)研究論文年發(fā)文量Fig.1 Annual publications of research paper s r elated to endophytic fungi of grass and endophytic fungi of non grass in CNKI database during 1999-2019

2.2 發(fā)文學科分布

對檢索出的5333篇內(nèi)生真菌相關(guān)文獻按照一級學科進行分類的結(jié)果表明（表1），在生物、作物、中藥與方劑研究領(lǐng)域的學科分布相對較高，分別為21.62%，15.58%，14.16%，涉及的學科較為廣泛。其次377篇禾草內(nèi)生真菌相關(guān)文獻按照一級學科分類的結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），在作物、草學、生物、植物保護4個研究方向的論文分別占禾草內(nèi)生真菌文獻總數(shù)的20.69%，18.83%，11.94%，10.34%。從以上結(jié)果可知，禾草內(nèi)生真菌與非禾草內(nèi)生真菌的學科分布在作物學和生物學中都有較大分布。禾草內(nèi)生真菌的研究由于其宿主都為禾本科草類植物，且禾草內(nèi)生真菌的有性態(tài)表現(xiàn)為香柱病菌，在草學學科和植物保護學科中有較大分布。而非禾草內(nèi)生真菌的研究有很大一部分來源于次生代謝產(chǎn)物的藥物開發(fā)，因此在中藥與方劑學科中也有較大分布。

表1 1999-2019年期間在CNKI數(shù)據(jù)庫中關(guān)于內(nèi)生真菌與禾草內(nèi)生真菌相關(guān)研究論文的主要學科分布Table 1 Main discipline distribution of research paper s on endophyte and grass endophyte in CNKI database during 1999-2019

2.3 文獻期刊分析

對檢索到的5333篇內(nèi)生真菌的文獻進行統(tǒng)計分析，其中發(fā)文期刊超過總文獻10%的有天然產(chǎn)物研究與開發(fā)、安徽農(nóng)業(yè)科學、菌物學報以及中國中藥雜志（表2），其中禾草內(nèi)生真菌的發(fā)文期刊主要分布在草業(yè)科學、草業(yè)學報、生態(tài)學報等雜志。由此可知，發(fā)文期刊種類較為狹小，內(nèi)生真菌主要發(fā)文期刊基本為同一類型的期刊，反映了關(guān)于內(nèi)生真菌的研究較為局限，存在較大的發(fā)展空間。

表2 1999-2019年期間在CNKI數(shù)據(jù)庫中內(nèi)生真菌研究載文量排名前10位的期刊Table 2 Top 10 journals in the CNKI database for endophytic fungi research during 1999 to 2019

2.4 發(fā)文量前10位的科研機構(gòu)或單位

對發(fā)文機構(gòu)和單位統(tǒng)計分析（表3）發(fā)現(xiàn)：發(fā)文量排在前10位的機構(gòu)或單位包括：西北農(nóng)林科技大學、蘭州大學、云南大學、海南大學、南京師范大學、中山大學、浙江大學、南京農(nóng)業(yè)大學、貴州大學和吉林農(nóng)業(yè)大學，其中排在第1位的是西北農(nóng)林科技大學，論文數(shù)量為240篇，占所有文獻的4.50%，其次是為蘭州大學，論文數(shù)量為126篇，占2.36%。關(guān)于發(fā)表禾草內(nèi)生真菌的機構(gòu)或單位，排名前兩位的分別為蘭州大學和南開大學，蘭州大學發(fā)表禾草內(nèi)生真菌論文數(shù)量109篇，占86.51%。南開大學發(fā)表禾草內(nèi)生真菌的論文占內(nèi)生真菌論文總數(shù)的22.28%。非禾草內(nèi)生真菌研究論文發(fā)文量較多的機構(gòu)和單位研究機構(gòu)主要包括西北農(nóng)林科技大學、云南大學、海南大學和南京師范大學等。通過計量分析可知內(nèi)生真菌的研究主要集中在一些高校，且非禾草內(nèi)生真菌的研究機構(gòu)相較于禾草內(nèi)生真菌的研究機構(gòu)廣泛。

表3 1999-2019年期間在CNKI數(shù)據(jù)中與內(nèi)生真菌相關(guān)研究論文數(shù)量排名前10位的機構(gòu)Table 3 Top 10 institutions in the number of papers related to endophytic fungi in CNKI data during 1999-2019

2.5 排名前7位的資助項目

各發(fā)表論文所獲得的資助項目（表4）表明，資助論文超過100篇的基金項目有3個，分別為：國家自然科學基金、國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃以及國家高科技研究發(fā)展計劃。此外，高等學校博士學科點專項科研基金、國家科技支撐計劃、廣東省自然科學基金和海南省自然科學基金等也資助了一定數(shù)量內(nèi)生真菌的研究。國家自然科學基金資助論文數(shù)量為1163篇，包括141篇禾草內(nèi)生真菌論文，以及1022篇非禾草內(nèi)生真菌論文，表明國家自然科學基金在我國內(nèi)生真菌的研究發(fā)展上起著舉足輕重的地位。

表4 1999-2019年期間在CNKI數(shù)據(jù)庫中與內(nèi)生真菌研究相關(guān)論文的主要基金項目Table 4 The main fund pr ojects of paper s related to endophyte r esearch in CNKI database dur ing 1999-2019

2.6 單篇論文被引次數(shù)排名前10位論文

在檢索到的5333篇關(guān)于內(nèi)生真菌的研究論文中，被引頻次最高的論文為郭良棟［2］于2001年發(fā)表于《菌物系統(tǒng)》的《內(nèi)生真菌研究進展》一文，被引頻次高達819次（表5）。其次為張集慧等［11］于1999年發(fā)表于《中國醫(yī)學科學院學報》的《蘭科藥用植物的5種內(nèi)生真菌產(chǎn)生的植物激素》一文，被引頻次為446次。其他被引頻次較高的論文分別發(fā)表于《中草藥》《微生物通報》《中國藥學雜志》《西北植物學報》和《中山大學學報》等雜志。

表5 1999-2019年期間在CNKI數(shù)據(jù)庫中發(fā)表關(guān)于禾草內(nèi)生真菌與非禾草內(nèi)生真菌相關(guān)研究論文中單篇被引用次數(shù)排名前10位的論文Table 5 Top 10 papers on the number of citations of a single paper related to endophytic fungi of grass and endophytic fungi of non gr ass in CNKI database in 1999-2019

關(guān)于禾草內(nèi)生真菌的研究論文，被引頻次最高的論文為南志標等［14］于2004年發(fā)表于《生態(tài)學報》的《禾草-內(nèi)生真菌共生體在草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的作用》一文，被引頻次為172次。其次為陳世蘋等［33］于2001年發(fā)表于《應(yīng)用于環(huán)境生物學報》的《水分脅迫下內(nèi)生真菌感染對黑麥草葉內(nèi)保護酶系統(tǒng)活力的影響》一文，被引頻次為142次，其他被引頻次較高的論文分別發(fā)表于《江蘇農(nóng)業(yè)科學》《植物生態(tài)學報》和《微生物學通報》等雜志。引用次數(shù)排名前10的禾草內(nèi)生真菌研究論文中，有5篇是關(guān)于黑麥草內(nèi)生真菌的研究，表明黑麥草內(nèi)生真菌共生體是國內(nèi)關(guān)于禾草內(nèi)生真菌研究起步較早的共生體。

2.7 禾草內(nèi)生真菌高頻關(guān)鍵詞

關(guān)鍵詞是對論文的研究內(nèi)容、方法、對象等的高度總結(jié)，關(guān)鍵詞分布可知相關(guān)研究領(lǐng)域的研究熱點以及發(fā)展趨勢。利用Citespace軟件對377篇禾草內(nèi)生真菌文獻的關(guān)鍵詞構(gòu)建了知識圖譜，結(jié)果表明，目前國內(nèi)關(guān)于禾草內(nèi)生真菌的研究對象多集中在醉馬草、黑麥草、野大麥、高羊茅、羊草（Leymus chinensis）、中華羊茅等幾種禾草（圖2）。其他高頻詞包括了“抗逆性”和“多樣性”等，表明目前國內(nèi)關(guān)于禾草共生體的研究多集中在禾草內(nèi)生真菌共生體的生物抗逆和非生物抗逆機理，以產(chǎn)生生物堿的功能為研究基礎(chǔ)，通過菌株多樣性的研究篩選獲得優(yōu)良的內(nèi)生真菌菌株以及新的禾草-內(nèi)生真菌共生體的挖掘。

圖2 1999-2019年期間在CNKI數(shù)據(jù)庫中與禾草內(nèi)生真菌研究相關(guān)的高頻關(guān)鍵詞網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.2 Network diagram of high frequency keywords related to the study of endophytic fungi of grass in CNKI database during 1999-2019

3 討論與展望

文獻作為信息、科技的載體，其數(shù)量可反映研究人員對內(nèi)生真菌相關(guān)研究領(lǐng)域的關(guān)注程度和投入程度，我國非禾草內(nèi)生真菌年發(fā)文量遠大于禾草內(nèi)生真菌，在國際上，關(guān)于禾草內(nèi)生真菌的發(fā)文量在1996-2016年達到1042篇，其中我國含有66篇［32］，占到國內(nèi)發(fā)文量的27.5%，對我國禾草內(nèi)生真菌研究占有重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)對于內(nèi)生真菌的研究局限于少數(shù)幾個學科，急需更加深入地交叉研究以推動研究思維的變革和創(chuàng)新，來挖掘研究領(lǐng)域的巨大潛力。此外任何一個領(lǐng)域的研究都離不開國家的支持，而在內(nèi)生真菌的研究上，尤其是禾草內(nèi)生真菌，基金項目較為缺乏且研究機構(gòu)較為集中，主要為西北地區(qū)，使得研究的廣度、深度都有待加強。2018年師茜等［32］基于Web of Science數(shù)據(jù)庫對禾草內(nèi)生真菌研究論文進行計量分析，列出了引用頻次排名前10論文的關(guān)鍵詞，研究對象主要是醉馬草和羽茅（Achnatherum sibiricum），研究內(nèi)容主要為內(nèi)生真菌提高宿主植物的抗旱性、抗寒性、抗鹽性的生理生化機制，本研究發(fā)現(xiàn)與其較為一致。

在20年的研究中我國取得了巨大進展，發(fā)現(xiàn)了越來越多的Epichlo?屬［47-48］內(nèi)生真菌，深入了解和認識到內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育過程，分子生物學技術(shù)、基因組學、蛋白組學和代謝組學以及信息生物技術(shù)的應(yīng)用加快了內(nèi)生真菌的研究，其次內(nèi)生真菌全基因族測序的測定，更是明確了次生代謝物多樣性及其基因的關(guān)系［49-50］。在目前，禾草內(nèi)生真菌的研究主要集中在黑麥草、高羊茅等，對于其他菌株還需要深入研究其進化起源以及與宿主植物的關(guān)系［51-52］。我國加大了對禾草內(nèi)生真菌多樣性的研究，但仍較為局限，且鑒定的精確度不高。其次，我國對于內(nèi)生真菌的研究主要集中在內(nèi)生真菌提高宿主對環(huán)境抗逆性的生理生化機制，以及生物堿對生態(tài)系統(tǒng)的影響和內(nèi)生真菌所產(chǎn)生的次生代謝物的作用等方面。而在國際內(nèi)生真菌的研究更多集中在內(nèi)生真菌與寄主相互作用的分子機制，以及利用內(nèi)生真菌來進行育種等方面［51］，并已經(jīng)選育出禾草內(nèi)生真菌共生體新品種并應(yīng)用于市場，而我國起步較晚，投入程度還遠遠不夠。再者，利用內(nèi)生真菌共生體所產(chǎn)生的次生代謝物將其開發(fā)成殺菌劑，殺蟲劑等，內(nèi)生真菌共生體所產(chǎn)生的麥角新堿具有消炎、止痛等功效，可用于藥物的制作等［8］都具有巨大的研究潛力。

續(xù)表5 Continued Table 5

內(nèi)生真菌是一類應(yīng)用前景廣闊的資源微生物，從長春花（Catharanthus roseus）所分離出的內(nèi)生真菌菌株中，可發(fā)現(xiàn)含有長春新堿成分，這種成分具有抗腫瘤活性，且對白血病具有顯著療效［41，53］。此外內(nèi)生真菌可能通過分泌2，3-丁二醇以及類似物來調(diào)控擬南芥（Arabidopsis thaliana）自 身 合 成 生 長 素（auxin，IAA），調(diào)節(jié)生長素相關(guān)運輸?shù)鞍走\輸生長素到指定位置以促進擬南芥的生長［54］，在未來可以利用該特性開發(fā)生物菌肥，對提高品種及產(chǎn)量具有巨大潛力。一些內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生細胞壁分解酶，能用于克服宿主防御異物的天然屏障，還可產(chǎn)生果膠酶等胞外酶［55］，產(chǎn)生較高的商業(yè)價值。植物內(nèi)生真菌是一個特殊的真菌類群，而目前對于非禾草內(nèi)生真菌的研究主要集中在藥用植物。近年來，我國已從數(shù)百種藥用植物中分離鑒定出大量的內(nèi)生真菌，主要研究內(nèi)生真菌對宿主的生長發(fā)育、種子萌發(fā)、有效成分積累等方面的作用［56-57］，但對于內(nèi)生真菌與宿主相互關(guān)系的分子機制研究成果較少以及對于內(nèi)生真菌的研究主要集中在實驗階段，實際應(yīng)用還需深入研究和實踐。因此同樣要加強非禾草內(nèi)生真菌的共生機制和抗逆機制的研究，加強內(nèi)生真菌與藥用植物天然產(chǎn)物的研究，加強內(nèi)生真菌同預(yù)防醫(yī)學、中醫(yī)藥學和林學等相關(guān)學科和團隊的研究。

內(nèi)生真菌共生體對其他微生物同樣也產(chǎn)生一定影響，Márquez等［58］在研究中發(fā)現(xiàn)，只有被病毒感染的內(nèi)生真菌才能提高寄主植物的耐熱性，這揭示了真菌病毒能影響內(nèi)生真菌共生體系，但病毒對內(nèi)生真菌以及共生體的影響仍不清晰。菌根真菌同樣能與植物根系建立互惠共生關(guān)系，而內(nèi)生真菌與菌根真菌雙重感染時對寄主植物所產(chǎn)生的影響研究較為缺乏。有研究表明內(nèi)生真菌與菌根真菌存在拮抗作用［59］，但在某些情況下反而促進菌根真菌的侵染［60］。兩種真菌是否形成雙重共生體以對寄主達到多方面的保護，仍需更深入的探索。因此對于我國內(nèi)生真菌的相關(guān)研究需要加大投入，以不斷提升該領(lǐng)域的研究水平，推動我國內(nèi)生真菌的發(fā)展。