蔡元，羅玉柱，臧榮鑫，李春陽，扎西英派

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

胚胎產(chǎn)前損失是哺乳動物繁殖過程中遇到的一個主要問題，綿羊（Ovisaries）和大多數(shù)哺乳動物的胚胎死亡損失在20%～40%，其中2/3發(fā)生在妊娠的附植期［1］，這嚴重限制了哺乳動物繁殖性能的發(fā)揮。胚胎著床失敗是造成這些早期妊娠損失的主要原因，因此，減少早期胚胎著床失敗是提高哺乳動物生殖效率的重要方法。雖然已有大量研究表明營養(yǎng)在胎兒發(fā)育和后續(xù)妊娠中發(fā)揮重要作用，但有關(guān)特定營養(yǎng)素對胚胎著床、胚胎存活和胚胎發(fā)育的影響的研究有限［2］。研究表明，精氨酸是體內(nèi)合成一氧化氮（nitric oxide，NO）、多胺、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的前體，精氨酸的代謝物NO對胚胎著床、胚胎發(fā)育和滋養(yǎng)層侵入、胎盤血管生成具有積極的調(diào)控作用［3-7］。但是精氨酸成本高，且飼糧中添加的精氨酸能夠被反芻動物瘤胃微生物降解，因此，在生產(chǎn)中難以推廣使用。N-氨甲酰谷氨酸（N-carbamylglutamate，NCG）是內(nèi)源性精氨酸合成的激活劑［2］，能夠促進精氨酸內(nèi)源合成［8］。妊娠飼糧中添加NCG能促進大鼠早期胚胎著床和改善產(chǎn)仔性能［7］，在妊娠早期的母豬飼糧中添加NCG能夠降低胚胎死亡率［9］、顯著增加每窩產(chǎn)活仔數(shù)［2］，妊娠飼糧中添加NCG對改善胎盤血管功能、促進胎兒營養(yǎng)供應(yīng)具有重要作用［10］，飼糧中添加NCG可促進雞卵巢血管生成，促進卵泡發(fā)育［11］，限飼母羊日糧中補充NCG能夠促進母羊胎盤的生長發(fā)育［12-13］，還可促進營養(yǎng)不良母羊的胎兒生長［14-15］。但目前還未見母羊妊娠早期飼喂NCG效果的相關(guān)報道。為此，本研究擬在母羊妊娠早期飼糧中添加NCG，研究其對胚胎存活、胎兒數(shù)量等指標(biāo)的影響，以及對血漿游離氨基酸、總一氧化氮合酶（total nitric oxide synthase，TNOS）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthetase，eNOS）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、NO、雌二醇、孕酮的影響，初步探討NCG對妊娠早期母羊繁殖性能的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

NCG（C6H10N2O5）≥97.0%，水分≤1.0%，總砷（以As計）≤0.5 mg·kg-1，鉛（Pb）≤0.5 mg·kg-1，生產(chǎn)批號為T 190228031，為白色粉末，有微酸味，由國家飼料工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 實驗動物與試驗設(shè)計

本試驗所用母羊為純種初產(chǎn)湖羊，35 kg時開始挑選生長狀況良好，有過發(fā)情記錄的母羊，最終選擇50只發(fā)情正常、健康狀況良好的母羊進行試驗。將50只母羊隨機分為2組：對照組和試驗組，每組25只羊，每只母羊為1個重復(fù)，基礎(chǔ)飼糧參照NRC（2004）體重40 kg的母綿羊妊娠前期的營養(yǎng)需要量配制。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧（表1），試驗組飼喂添加0.11%NCG的基礎(chǔ)飼糧。母羊采用同期發(fā)情人工授精方式配種，配種當(dāng)天計為妊娠第0天，從第一次人工授精開始給母羊分別飼喂各組試驗飼糧，飼喂期38 d。

表1 飼糧組成和營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of diets（dry matter basis）

1.3 飼養(yǎng)管理及樣品采集

試驗于2019年8-10月在蘭州七里河萬山種植養(yǎng)殖專業(yè)合作社進行。母羊妊娠期平均飼喂量為2.7 kg（常規(guī)含水量），每天08：30和16：00飼喂兩次。按照規(guī)章制度對羊場定期進行消毒和清潔，保持良好的通風(fēng)。在14 d時開始用公羊試情，35 d時用B超測孕。每組選擇8只體況相近的懷孕母羊，在妊娠第19、38天上午空腹頸靜脈采血10 mL，置于有肝素鈉的離心管內(nèi)，靜置30 min后，在4℃下以3000 r·min-1離心10 min后分離血漿樣品，將血漿分裝于1 mL的離心管中，保存于-80℃的超低溫冰箱，用于測定血漿氨基酸、eNOS、iNOS、TNOS、NO；38 d采血后，各選取7只懷孕母羊?qū)⑵渫涝祝缓罅⒓雌矢公@取子宮稱重后將其置于冰上，統(tǒng)計黃體數(shù)量，剪開子宮體，收集胎水、胎羊，記錄胎水體積，記錄胎羊數(shù)量和重量，測定胎羊的體長和體高，統(tǒng)計胎盤數(shù)、胎盤的長徑和短徑。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 母羊繁殖性能 記錄黃體數(shù)量、子宮重、總胎兒數(shù)、活胎兒數(shù)、活胎兒總重、胎水體積，統(tǒng)計直徑大于0.5 cm的胎盤的數(shù)量，測定最大的5個胎盤的長徑和短徑，測定胎兒的體長、體高和胎兒形成指數(shù)，本試驗中的胎兒形成指數(shù)為38 d的胎兒數(shù)除以黃體數(shù)的大小，取值范圍在0～1，在母羊健康狀況、精液質(zhì)量、輸精條件一定的情況下，其主要影響因素為子宮內(nèi)環(huán)境，其值越大，表示發(fā)情母羊排出的卵子受精、形成胚胎、發(fā)育成胎兒的能力越強，胚胎和胎兒的存活率越高。

1.4.2 血漿氨基酸濃度 采用德國賽卡姆Sykam（S-433D）（德國賽卡姆公司）氨基酸自動分析儀測定。

1.4.3 血漿TNOS、iNOS、eNOS、NO、雌二醇和孕酮濃度的測定 用南京建成生物工程研究所的試劑盒，按相應(yīng)的試劑盒說明測定血漿TNOS（A 014-2-2）、iNOS（A 014-1-2）、eNOS（H 195，48 T）、NO（A 012-2-1）、雌二醇（H 102，48T）和孕酮（H 089，48T）的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊繁殖性能的影響

對照組和NCG組屠宰的7只母羊均懷孕。與對照組相比（表2），在妊娠第38天時，NCG組每只母羊總胎兒數(shù)增加了79.72%（P＜0.05），活胎兒數(shù)增加了79.72%（P＜0.05），胎水體積增加了72.89%，胎兒形成指數(shù)增加了0.26（P＜0.05）。然而黃體數(shù)、子宮重有增加但差異不顯著（P＞0.05），直徑大于0.5 cm的胎盤數(shù)減少了2.96個（P＞0.05），直徑最大的5個胎盤的平均面積減少0.07 cm（2P＞0.05），NCG組的受胎率提高了5.20%（P＞0.05），飼糧添加NCG對母羊增重也沒有顯著影響（P＞0.05）。說明母羊妊娠早期飼糧中添加NCG后能夠顯著提高妊娠第38天的總胎兒數(shù)和活胎兒數(shù)，顯著增加胎水體積，顯著提高胎兒形成指數(shù)，能夠改善湖羊的繁殖性能。圖1為對照組妊娠第38天32號綿羊子宮的照片，圖2為NCG組妊娠第38天19號綿羊子宮的照片，由圖可見19號綿羊有3個黃體。圖3為對照組妊娠第38天32號綿羊卵巢和胎兒的照片，32號綿羊有2個黃體和1個胎兒。圖4為NCG組妊娠第38天19號綿羊胎兒的照片，19號綿羊有3個胎兒。

圖1 對照組綿羊子宮Fig.1 Control group sheep’s uterine

圖2 NCG組綿羊子宮Fig.2 NCG group sheep’s uterine

圖3 對照組母羊卵巢和胎兒Fig.3 Contr ol gr oup sheep’s ovar y and fetus

圖4 NCG組胎兒Fig.4 NCG gr oup fetuses

表2 妊娠0～38 d添加NCG對母羊妊娠第38天繁殖性能的影響Table 2 Reproductive performance on the 38th day of gestation of ewes fed a basal diet that was or was not supplemented with 0.11%NCG from days 0 to 38 of gestation

2.2 妊娠早期飼糧中添加NCG對胎兒發(fā)育的影響

與對照組相比（表3），在妊娠第38天時，NCG組活胎兒總重提高了71.13%（P＜0.05），活胎兒平均重降低4.70%（P＞0.05），胎兒體長減少0.16 cm，胎兒體高增加0.06 cm。說明妊娠早期飼糧中添加NCG后在增加胎兒數(shù)量的同時，并沒有影響胎兒的正常發(fā)育。

表3 妊娠0～38 d添加NCG對第38天胎兒發(fā)育的影響Table 3 Effects of NCG supplementation fr om 0 to 38 days of gestation on fetal development on the 38th day

2.3 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊血漿游離氨基酸濃度的影響

NCG組19 d的谷氨酸極顯著低于對照組（P＜0.01），甘氨酸、蛋氨酸、賴氨酸和精氨酸顯著高于對照組（P＜0.05），瓜氨酸和脯氨酸極顯著高于對照組（P＜0.01），鳥氨酸升高但差異不顯著（P＞0.05），天冬氨酸降低但差異不顯著（P＞0.05）；NCG組38 d的精氨酸和脯氨酸顯著高于對照組（P＜0.05），天冬氨酸、谷氨酸和鳥氨酸低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；NCG組19和38 d其他氨基酸與對照組差異不顯著（P＞0.05）。說明母羊妊娠早期飼糧中添加NCG后能夠影響母羊血漿中部分游離氨基酸的濃度（表4）。

表4 妊娠0～38 d飼糧添加0.11%NCG對母羊血漿游離氨基酸含量的影響Table 4 Effect of NCG supplementation between days 0-38 of gestation on concentration of free amino acids in the plasma of ewes on days 19 and 38 of gestation（μmol·L-1）

2.4 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊血漿NO、TNOS、eNOS和iNOS濃度的影響

妊娠第19和38天NCG組的NO濃度顯著高于對照組（P＜0.05）；妊娠第19和38天NCG組和對照組的TNOS濃度差異不顯著（P＞0.05）；妊娠19 d NCG組的iNOS和eNOS濃度顯著高于對照組（P＜0.05），妊娠38 d NCG組的iNOS和eNOS濃度極顯著高于對照組（P＜0.01）。說明妊娠早期飼糧中添加NCG后能夠顯著提高血漿中NO、eNOS和iNOS的濃度（表5）。

表5 妊娠0～38 d添加0.11%NCG對母羊血漿NO、TNOS、eNOS和iNOS濃度的影響Table 5 Effects of NCG supplementation between days 0 and 38 of gestation on concentrations of NO，TNOS，eNOS and iNOS in the plasma of ewes on days 19 and 38

2.5 血漿激素含量

與對照組相比，NCG組妊娠19 d母羊血漿中的孕酮濃度比對照組高0.89 ng·mL-1（P＜0.01），NCG組38 d母羊血漿中的孕酮以及妊娠19和38 d的母羊血漿中的雌二醇均比對照組高，但差異不顯著（P＞0.05）。說明妊娠早期飼糧中添加NCG后能夠增加妊娠第19天血漿孕酮的濃度（表6）。

表6 妊娠0～38 d添加0.11%NCG對母羊血漿雌二醇和孕酮濃度的影響Table 6 Effects of NCG supplementation between days 0-38 of gestation on concentr ations of estradiol and progester one in the plasma of ewes on days 19 and 38

3 討論

本研究結(jié)果表明，在妊娠早期的飼糧中添加0.11%NCG能夠顯著提高湖羊妊娠第38天的總胎兒數(shù)和活胎兒數(shù)，顯著提高胎兒形成指數(shù)，顯著增加活胎兒總重、胎水體積，能夠顯著增加精氨酸、脯氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等部分血漿游離氨基酸的濃度。本試驗中，NCG組的胎兒形成指數(shù)（0.86）比對照組的胎兒形成指數(shù)（0.60）高0.26（P＜0.05），說明NCG組的母羊人工授精后卵子受精、形成胚胎并發(fā)育成胎兒的能力比對照組強，添加NCG后提高了胚胎和胎兒的存活率，使NCG組胎兒的數(shù)量增加1只。母體營養(yǎng)是子宮內(nèi)環(huán)境最主要的影響因素，給母體提供適宜的營養(yǎng)，有利于胚胎的生長發(fā)育［16］，同時對胚胎、胎兒的存活和生長發(fā)育也至關(guān)重要［17-20］。NCG是精氨酸體內(nèi)合成途徑中關(guān)鍵酶CPS-1的有效激活劑，在體內(nèi)能夠促進精氨酸合成［8］，使NCG組的精氨酸顯著高于對照組。精氨酸對動物機體有多種有益作用，能促進血管生成，改善氮代謝，促進泌乳和生長，增強動物繁殖和免疫能力［21］，對已建立的綿羊滋養(yǎng)外胚層細胞系的增殖、遷移和蛋白質(zhì)合成具有促進作用［22-23］，血清中的精氨酸、脯氨酸濃度的增加可以為胚胎早期發(fā)育和植入提供足夠的營養(yǎng)，從而改善早期胚胎發(fā)育和著床［7］。在妊娠14～25 d給母豬添加0.4%和0.8%精氨酸分別使胎盤重量增加21%和34%（P＜0.01），每窩活胎數(shù)增加2個（P＜0.05），胚胎死亡率降低14%和15%（P＜0.01），使羊水總量極顯著增加（P＜0.01），提高了胚胎和胎兒的存活［24］；給多胎母羊注射精氨酸鹽能夠減少胚胎損失，增加羔羊的出生體重，提高胎羔的成活率［25-26］；Cai等［2］在妊娠早期母豬飼糧中添加NCG后顯著增加了每窩產(chǎn)活仔數(shù)（P＜0.05）；Zhu等［9］直接在妊娠0～28 d的母豬飼糧中添加0.05%NCG，NCG組妊娠第28天總胎兒數(shù)增加了1.32頭（P＜0.05），活胎兒數(shù)增加了1.29頭，胚胎死亡率降低11.8%（P＜0.05），胎盤總重和羊水總體積分別增加13%和18%（P＜0.05），活胎兒窩重比對照組高18%（P＜0.05），母豬妊娠第14和28天的血漿精氨酸和脯氨酸濃度顯著增加（P＜0.05），本試驗研究結(jié)果與以上報道的結(jié)果相一致。本試驗中在飼糧中添加NCG后，可能激活了CPS-1，促進了精氨酸的內(nèi)源合成，使體內(nèi)精氨酸的濃度升高，在精氨酸的作用下提高了胚胎和胎兒的存活率，從而提高了妊娠第38天的總胎兒數(shù)和活胎兒數(shù)。添加NCG后，還提高了妊娠19 d NCG組甘氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等部分血漿游離氨基酸的濃度，說明NCG還會影響NCG組其他氨基酸的代謝，具體原因有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加NCG能顯著提高母羊血漿中eNOS的含量和iNOS的活力，NCG組NO的濃度也顯著高于對照組。妊娠早期日糧中添加NCG會顯著增加母豬子宮內(nèi)膜中eNOS蛋白和mRNA的表達量［9］，經(jīng)產(chǎn)母豬整個妊娠期飼糧中添加NCG能有效提高妊娠母豬血漿中iNOS的濃度［27］，妊娠母豬飼糧中添加NCG提高了母豬血漿NO含量［9，27-28］，本試驗和這些結(jié)果類似。NO是由子宮內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的一種重要的舒張因子，能夠在胎盤和胎兒間的血流調(diào)控中發(fā)揮重要作用，因此，會在母體給胎兒提供養(yǎng)分和氧氣的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［29］，NO還通過重構(gòu)細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)胚胎著床［30］，在胎盤血管發(fā)育中起重要作用［31］，NO可誘導(dǎo)來自不同血管床的胎兒內(nèi)皮細胞增殖［32-33］，并調(diào)節(jié)中心血管口徑［34］。研究結(jié)果已經(jīng)表明，NO是胎盤血管生成、胎盤發(fā)育、胚胎發(fā)育和胎兒生長的重要調(diào)控因子［32-37］。動物體內(nèi)的NO是由精氨酸在一氧化氮合成酶（NOS）參與下生成［38］，因此精氨酸濃度的高低是影響NO合成的重要因素，同時精氨酸的濃度也是影響血管平滑肌產(chǎn)生iNOS的關(guān)鍵因素［27］，本試驗中添加NCG組精氨酸濃度的顯著升高有助于NO的生成和NOS活力的提高。因此，精氨酸在一氧化氮合成酶的作用下提高了體循環(huán)中NO的含量，促進了胎盤血管生成和發(fā)育，增加了胎盤的血流量［27，31，39］，在促進胎盤發(fā)育的同時為胚胎著床、妊娠期胚胎發(fā)育、胎兒的存活與生長提供了最適的子宮環(huán)境，使胚胎和胎兒存活率提高，并促進了胎兒的發(fā)育，因此本研究中妊娠第38天的總胎兒數(shù)、活胎兒數(shù)和活胎兒總重增加。這可能是在妊娠早期飼糧中添加NCG后能夠改善綿羊繁殖性能的作用機理。

雌激素和孕激素是調(diào)控妊娠的主要激素，它們在卵細胞的轉(zhuǎn)運、內(nèi)皮細胞的增殖和分化、子宮內(nèi)皮細胞的蛻膜化以及胚胎的著床過程中都扮演著重要的調(diào)控作用，從而對于哺乳動物妊娠的建立和維持起著至關(guān)重要的作用。本試驗中NCG組妊娠19和38 d的孕酮均比對照組高，尤其是NCG組在妊娠19 d的孕酮顯著增加，因精氨酸也是一種激素促分泌素［40］，能夠促進激素的分泌，孕酮和雌激素等含量的變化與母羊胚胎著床和妊娠維持關(guān)系非常密切。本試驗中NCG組母羊的黃體數(shù)量均比對照組多，分泌的孕酮也多，使NCG組19 d時血漿中孕酮的含量顯著升高。妊娠初期，孕激素促進子宮內(nèi)膜增生，使腺體發(fā)育、功能增強，從而有利于胚胎附植［41］。

4 結(jié)論

妊娠早期飼糧中添加NCG，提高了胚胎和胎兒的存活，增加了妊娠母羊第38天總胎兒的數(shù)量和活胎兒數(shù)量，改善了母羊的繁殖性能，其作用機制可能是NCG促進了母羊內(nèi)源性精氨酸的合成，提高了母羊血漿精氨酸、NO和孕酮含量，改善了子宮內(nèi)環(huán)境和營養(yǎng)供給，使之有利于胚胎著床和妊娠維持。