劉 丹，劉盛均，陳 楊

（綿陽市中心醫(yī)院病理科 四川 綿陽 621000）

宮頸癌是我國女性生殖系最常見的惡性腫瘤疾病，嚴(yán)重危害女性身體健康，宮頸細(xì)胞學(xué)篩查在預(yù)防子宮頸癌方面發(fā)揮著重要作用，液基薄層細(xì)胞學(xué)（TCT）檢查作為宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的首選辦法，能有效對宮頸癌進(jìn)行早期篩查，因此制備一張合格的涂片對最后的診斷至關(guān)重要，本文將針對透明與否對染色質(zhì)量的影響進(jìn)行探討。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2020年4月—9月婦科及體檢科送檢的宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本500例。

1.2 方法

1.2.1儀器及試劑 廈門邁威生物液基細(xì)胞檢查系統(tǒng)，MCT-2000液基薄層細(xì)胞制片機、旋渦振蕩器、制片器。液基細(xì)胞保存瓶、細(xì)胞提取液、細(xì)胞固定液（95%乙醇）、巴氏染液、蘇木素、0.5%鹽酸酒精、無水乙醇、環(huán)保透明劑、中性樹膠、一次性吸管、蓋玻片。

1.2.2液基薄層細(xì)胞學(xué)涂片的制備 每例標(biāo)本均同時制備兩張涂片分別標(biāo)記A和B。具體操作如下：取回的細(xì)胞標(biāo)本按患者姓名、編號進(jìn)行登記，并在載玻片一端標(biāo)記患者編號；將采集有細(xì)胞標(biāo)本的保存液瓶放在振蕩器上混勻5 min左右，注意擰緊瓶蓋防止液體溢出造成污染；往制片器的沉降管中加入細(xì)胞提取液至刻度線（約3.5 mL）使過濾杯的底部濾網(wǎng)浸入提取液中；將細(xì)胞保存液輕輕傾倒入沉降管中，保持細(xì)胞提取液與細(xì)胞保存液分層清晰，細(xì)胞保存液的加入需注意以下三方面：（1）保存液加入的量視細(xì)胞多少而定，若保存液非常清亮細(xì)胞少則可多加一點或者先將保存液離心，去上清吸取底部沉淀物加入到沉降管中，若保存液渾濁細(xì)胞多則可少加一點。加入的細(xì)胞量要適中，加入的細(xì)胞量過少容易產(chǎn)生涂片不均，出現(xiàn)空白區(qū)域不見細(xì)胞的現(xiàn)象，而細(xì)胞量過多易造成涂片厚薄不均，細(xì)胞重疊漂浮等現(xiàn)象，細(xì)胞過多過少均不便鏡檢。（2）若送檢標(biāo)本含血液過多，可在細(xì)胞保存液中加入適量專用細(xì)胞清洗液，或者1 mL冰醋酸（保存液與冰醋酸之比為9:1）搖勻[1]，去除過多紅細(xì)胞以免影響鏡檢。（3）若標(biāo)本含黏液過多，可先采用酶消化處理[2]；將沉降管中的過濾杯輕輕提起丟棄，不破壞細(xì)胞提取液與細(xì)胞保存液的分層；將制片器對稱放入MCT-2000液基薄層細(xì)胞制片機的吊籃中，相對位置底托擺放的方向一致，若不對稱擺放會導(dǎo)致離心制片機內(nèi)制片器中的載玻片被毀壞的嚴(yán)重后果；開啟制片機800 r/min，2 min；取出制片器，傾去制片器中的上清液，向制片器沉降管內(nèi)加入95%乙醇1～2 mL搖晃數(shù)次后傾去上清液，再加入95%乙醇1～2 mL固定30 s～2 min；取出載玻片進(jìn)行巴氏染色。

1.2.3巴氏染色步驟 A、B兩組涂片同時染色，首先將兩組涂片于95%乙醇中固定10 min[3]；蘇木素中染色5 min，根據(jù)染液使用的時間長短或染片數(shù)量或環(huán)境溫度，適當(dāng)增加或減少染色時間；自來水中漂洗，洗去多余蘇木素；0.5%鹽酸酒精中分化1～4 s，分化時間視分化液脫色力而定；流水反藍(lán)，自來水中流水沖洗不少于3 min；95%乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各1 min; EA50染色液中染色1～3 min, EA50染液更換時間以蘇木素染液的細(xì)胞核染色效果為準(zhǔn)，需要更換時全套染液同時更換；梯度酒精脫水，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ缸各30 s，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各1 min。

1.2.4透明 A組涂片脫水干凈后放入環(huán)保透明劑中兩缸各透明5 min，取出涂片中性樹膠濕封片；B組涂片脫水干凈后直接從酒精中取出空氣中自然干片，中性樹膠干封片。

2.結(jié)果

A組酒精脫水后透明中性樹膠濕封片的涂片染色鮮艷，不同類型細(xì)胞顯色分明，核漿對比清晰，細(xì)胞核、核仁、核膜結(jié)構(gòu)清晰，診斷信息明確（如圖1）。B組酒精脫水后直接空氣中自然干燥中性樹膠干封片的涂片出現(xiàn)胞膜分界欠清，胞質(zhì)難以辨識，部分胞核濃染，染色質(zhì)顆粒及核仁等細(xì)節(jié)無法觀察的現(xiàn)象（如圖2）。將A、B組涂片染色效果從色彩、細(xì)胞形狀及胞膜、核形狀及核細(xì)微結(jié)構(gòu)三方面進(jìn)行對比，見表1。

圖1 細(xì)胞輪廓感強，胞膜清晰銳利，胞質(zhì)明顯

圖2 胞膜分界欠清，核漿對比模糊，染色質(zhì)顆粒欠清晰

表1 液基細(xì)胞涂片染色后透明與否結(jié)果比較

3.討論

透明劑是一類能與乙醇、石蠟、中性樹膠互溶的有機溶劑，如二甲苯、甲苯、氯仿等有毒試劑及Histoclear、Van-clear、TO型生物制片透明劑（簡稱TO試劑）等環(huán)保透明劑，用于石蠟組織制片中，作為脫水、浸蠟過程的中介溶劑和封片時的透明劑及中性樹膠溶劑，以提高組織、細(xì)胞折光率。本實驗證明離心沉降式宮頸液基薄層細(xì)胞制片使用透明劑透明并濕封片，可顯著改善制片質(zhì)量，未經(jīng)透明可導(dǎo)致染色質(zhì)量下降，出現(xiàn)背景污穢，透明度欠佳，部分胞核染色略加深，部分胞膜分界欠清，胞質(zhì)欠明顯，核漿對比模糊，染色質(zhì)顆粒欠清晰，核細(xì)微結(jié)構(gòu)難以辨別等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響診斷。

我科現(xiàn)有的透明劑有二甲苯，TO試劑，環(huán)保透明劑。其中二甲苯價格便宜、透明效果好、作用時間短被廣泛采用，但二甲苯是一種具有芳香氣味的揮發(fā)性液體，長期接觸可造成免疫功能低下，吸入二甲苯蒸汽可刺激眼、鼻、喉，高濃度時可致嚴(yán)重呼吸困難，甚至死亡，在生活中也多處滲透性侵入[4]，是公認(rèn)的有毒的化學(xué)品之一。TO試劑是一種以優(yōu)質(zhì)松節(jié)油為主要原料并采用特殊配方合成的無色芳香透明液體，無毒，是一種安全、環(huán)保的新型試劑，能與乙醇互溶，能溶解石蠟、樹膠等，其效果與二甲苯無顯著差異。環(huán)保透明劑主要成分為液體石蠟，為無色無味的透明液體，不含苯，是一種環(huán)保的二甲苯替代物，環(huán)保透明劑具有低揮發(fā)性且對組織滲透較二甲苯柔和，即使透明時間長也不易造成組織的干澀、脆硬等現(xiàn)象，利于切片平整、完美，不會出現(xiàn)鏡下空洞與厚薄不均的現(xiàn)象[5]，也正是這種特性，使用環(huán)保透明劑透明細(xì)胞染色涂片時需適當(dāng)延長時間。三種透明劑各有優(yōu)劣，綜合考慮，我科選用環(huán)保透明劑作為常規(guī)透明劑使用，效果理想無毒無害環(huán)保，深受病理工作者的喜愛，見表2。

表2 二甲苯、TO試劑、環(huán)保透明劑優(yōu)劣比較

目前正是新型冠狀病毒肺炎疫情期間，全球疫情仍在蔓延，且有可能較長時期存在，在液基細(xì)胞涂片制備過程中會直接接觸到患者的血液、體液感染性物質(zhì)，暴露風(fēng)險中等[6]。做好病理醫(yī)務(wù)工作者的防護(hù)工作，是預(yù)防和減少感染的關(guān)鍵舉措，更是維護(hù)其身體健康和生命安全的必然要求，操作人員在操作過程中應(yīng)注意生物安全防護(hù)。根據(jù)《新冠肺炎疫情期間醫(yī)療機構(gòu)不同區(qū)域工作崗位個人防護(hù)專家共識》中指出病理科工作人員處理一般患者標(biāo)本防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)為一級防護(hù)：（1）嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防的原則。（2）工作時穿工作服，戴工作帽和醫(yī)用外科口罩，戴乳膠手。（3）嚴(yán)格遵守消毒的各項規(guī)章制度，空氣消毒，首選自然通風(fēng)，保證室內(nèi)外空氣的流通，室內(nèi)無人時使用紫外線燈照射消毒，每次消毒時間不少于1 h，每天2～4次；物體表面及地面的消毒，實驗前后1000 mg·L-1含氯消毒劑擦拭物體表面（操作臺、儀器、電腦）或拖地，每天至少2次，遇標(biāo)本漏灑污染時，先去除污染再使用含有效氯2000 mg·L-1的含氯消毒劑消毒，作用30 min，注意消毒劑要現(xiàn)用現(xiàn)配，24 h內(nèi)使用；生物安全柜消毒使用75%酒精，因含氯消毒劑有腐蝕作用一般不建議使用，消毒后清水清潔消毒，結(jié)束后開啟紫外殺菌燈消毒[7]。（4）嚴(yán)格執(zhí)行手衛(wèi)生，七步洗手法洗手，戴手套。

近年來宮頸癌發(fā)生率有上升趨勢，應(yīng)引起高度重視，該病屬于可預(yù)防性疾病，但因其病理發(fā)展過程較長，早期臨床癥狀不具有典型性，早期診斷難度較高。因此，能夠通過早期篩查及時明確高危人群，從而及時給予合理規(guī)范的治療，以改善患者預(yù)后降低宮頸癌死亡率至關(guān)重要。

液基細(xì)胞學(xué)檢查方法具有操作方便、快速、無創(chuàng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢[8]，作為國內(nèi)普遍使用的宮頸癌前病變篩查工具。穩(wěn)定的制片質(zhì)量是保證其診斷準(zhǔn)確的基礎(chǔ)，因此要求病理工作者掌握好離心沉降式宮頸液基薄層細(xì)胞制片染色技術(shù)，染色結(jié)束后透明濕封片制備出一張優(yōu)秀的細(xì)胞涂片。優(yōu)秀的液基薄層細(xì)胞涂片可提高診斷醫(yī)師閱片速率及臨床診斷準(zhǔn)確性，起到早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療的作用，降低宮頸癌的發(fā)病率。