林潔 楊連娟 楊名珍

(1.上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院皮膚科，上海 200431；2.上海同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市皮膚病醫(yī)院皮膚科，上海 200050；3.寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭縣人民醫(yī)院藥劑科，寧夏 750200)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)，是一種與遺傳體質(zhì)有關(guān)的慢性炎癥性皮膚病[1]，其中頭頸部AD是一種亞型，好發(fā)于頭面部、頸部和軀干上部，在青少年和成人中多見[2]。相比白念珠菌，嗜脂酵母馬拉色菌的致敏作用對頭頸部AD病情進(jìn)展更重要[3]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)和生理生化分析鑒定方法周期長，影響因素較多，故我們用qPCR(quantitative real-time PCR)方法檢測了頭頸部AD患者面部皮損區(qū)和非皮損區(qū)的7種馬拉色菌DNA的拷貝數(shù)量，以了解頭頸部AD患者面部馬拉色菌的菌種構(gòu)成[4]。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020年9—12月上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院和上海市皮膚病醫(yī)院皮膚科門診就診的AD患者共45例，符合頭頸部AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。病情嚴(yán)重程度采取濕疹面積及嚴(yán)重程度指數(shù)評分法：<7分為輕度，7～21分為中度，>21分為重度[6]。其中輕度AD：男7例，女20例，平均年齡23.7歲；中度AD：男9例，女6例，平均年齡22.8歲；重度AD：男3例，女0例，平均年齡28.7歲。50名健康對照者均來自上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院工作人員及其子女，男24例，女26例，平均年齡21.9歲。研究的兩組對象在年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，兩組研究對象均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合頭頸部AD診斷標(biāo)準(zhǔn)；②面部均有皮損區(qū)和非皮損區(qū)；③能配合檢測者。

排除標(biāo)準(zhǔn) ①2周內(nèi)使用抗真菌藥物和糖皮質(zhì)激素史；②采樣前2 h進(jìn)行洗??；③伴有其他皮膚??；④伴有惡性腫瘤及其他嚴(yán)重疾患。

1.2 采樣

用一次性無菌棉簽拭子采集頭頸部AD患者面部皮損區(qū)和非皮損區(qū)及健康對照者面頰部的皮膚鱗屑，每個(gè)區(qū)域以相同的力度擦拭相同面積的皮膚(3 cm×3 cm)3次[4]。

1.3 DNA的提取

采集健康對照者面頰部、AD患者面部皮損區(qū)和非皮損區(qū)的皮膚鱗屑樣本，按照陸茂等[7]的方法提取馬拉色菌基因組DNA，記錄取樣面積，用于計(jì)算單位面積拷貝數(shù)。

1.4 引物的設(shè)計(jì)和合成

糠秕馬拉色菌(M.furfur)、球形馬拉色菌(M.globosa)、鈍性馬拉色菌(M.obtusa)、厚皮馬拉色菌(M.pachydermatis)、限制馬拉色菌(M.restricta)、斯洛菲馬拉色菌(M.sloofiae)、合軸馬拉色菌(M.sympodialis)等7種馬拉色菌序列下載自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，通過比對分析找到各個(gè)菌種的特異性序列，設(shè)計(jì)引物(見表1)。

表1 本實(shí)驗(yàn)用到的qPCR引物序列

1.5 馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證

不同馬拉色菌特異性引物先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后切膠回收目的片段，將回收產(chǎn)物連接到pTG19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含有IPTG和x-gal的瓊脂糖平板篩選陽性克隆，跳取單菌落，對陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證。對測序正確的質(zhì)粒，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，測定濃度，計(jì)算拷貝數(shù)。并將質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.6 PCR反應(yīng)

反應(yīng)體積20 μL，其中正反向引物各0.4 μL，SYBR Green Realtime PCR Master mix 10 μL，基因組DNA 1 μL，補(bǔ)去離子水至20 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性10 s，60℃退火延伸40 s，循環(huán)40次；采集溶解曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 頭頸部AD患者面部皮損和非皮損區(qū)7種馬拉色菌DNA拷貝數(shù)量的比較

健康對照者面部、患者面部皮損和非皮損區(qū)7種馬拉色菌的DNA拷貝數(shù)量結(jié)果見表2。結(jié)果顯示：M.restricta的平均拷貝數(shù)在3組中都是最高的，顯著高于其他6個(gè)；其次是M.globosa、M.sloofiae、M.sympodialis，3者平均拷貝數(shù)接近；其他的菌種平均拷貝數(shù)很少，均小于20×104/cm2。

表2 頭頸部AD患者面部皮損、非皮損和健康對照者馬拉色菌DNA平均拷貝數(shù)比較(×104/cm2)

與健康對照者相比，患者面部皮損區(qū)M.globosa、M.restricta、M.pachydermatis、M.obtusa和M.furfur的平均拷貝數(shù)比健康對照者顯著增加。而非皮損區(qū)與健康對照者面部的馬拉色菌菌種構(gòu)成與拷貝數(shù)無明顯差異。

2.2 頭頸部AD患者面部皮損區(qū)馬拉色菌DNA平均拷貝數(shù)和病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性

7種馬拉色菌在患者皮損不同程度下DNA平均拷貝數(shù)見圖1。結(jié)果顯示，M.globosa和M.restricta平均拷貝數(shù)隨病情嚴(yán)重程度而增加，在輕度與中度、中度和重度之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

圖1 輕重程度不同的皮損患者不同馬拉色菌拷貝數(shù)分析(×104/cm2). A. M. furfur； B. M. globosa; C. M. obtusa; D. M. pachydermatis; E. M. restricta; F. M. slooffiae; G. M. sympodialis(*：P<0.05；**：P<0.01)

3 討 論

馬拉色菌是一種條件致病菌，為人類及溫血?jiǎng)游锲つw上的常駐菌群。其含脂酶，能把脂質(zhì)分解為脂肪酸，提供自身代謝必需的營養(yǎng)，故主要寄生于人體皮脂腺豐富的頭面部等，目前發(fā)現(xiàn)有18種，傳統(tǒng)的分型有7種[8]。人體皮脂分泌量出生3個(gè)月時(shí)經(jīng)歷第一階段高峰，兒童期減少，青春期再次增加，直到50歲[9]。因此，年齡在馬拉色菌的皮膚定植中起著重要作用，本文隨機(jī)入選的頭頸部AD患者和健康對照組年齡為20～30歲，以年輕人為主。

研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組和其他部位AD患者相比，頭頸部AD患者的皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(SPT)和馬拉色菌特異性IgE陽性率更高[3]。AD的發(fā)病機(jī)制目前普遍認(rèn)為是在遺傳基礎(chǔ)上由免疫、環(huán)境、感染、皮膚屏障缺陷等多因素作用而發(fā)病[1]。馬拉色菌過敏可能是一個(gè)觸發(fā)因素，AD患者皮膚屏障缺陷增加了皮膚免疫系統(tǒng)與皮脂溢出部位馬拉色菌的接觸機(jī)會，從而誘發(fā)了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以及馬拉色菌特異性IgE的產(chǎn)生，反過來加重了AD的皮損[10]。

然而，目前沒有直接證據(jù)表明AD患者馬拉色菌定植更為嚴(yán)重，馬拉色菌在頭頸部AD患者面部的菌種構(gòu)成報(bào)道也有差異，可能與人種、生活地區(qū)及檢測方法有關(guān)[11-12]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定報(bào)道以生長較快的糠秕馬拉色菌定植為主，近年基因測序、qPCR等分子生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)AD患者皮膚馬拉色菌主要由球形或限制馬拉色菌構(gòu)成，占80%以上[13,7]，并且馬拉色菌屬占所有真菌的63.2%～72.7%[14]。本研究結(jié)果顯示：限制馬拉色菌在頭頸部AD患者和健康人的面部都是優(yōu)勢菌種，DNA平均拷貝數(shù)高于其他6個(gè)菌種約5倍以上，皮損區(qū)比非皮損區(qū)、健康對照高約3倍以上；其次，球形馬拉色菌雖然不是健康者面部的優(yōu)勢菌種，但是皮損區(qū)的平均拷貝數(shù)顯著高于健康者約7倍，非皮損區(qū)和健康者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示限制和球形馬拉色菌與頭頸部AD的皮損明顯相關(guān)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。并且，本研究結(jié)果還顯示限制和球形馬拉色菌拷貝數(shù)量隨病情嚴(yán)重程度而增加，重度>中度>輕度，三者間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與Akaza[15]和Kaga[13]的報(bào)道一致，但是國內(nèi)冉玉平教授[7]報(bào)道28例兒童(0～12歲)AD患者面部皮損區(qū)、非皮損區(qū)馬拉色菌屬拷貝數(shù)與EASI評分無相關(guān)性，可能是青春期前皮脂分泌量少的原因?？傊?，我們的結(jié)果和文獻(xiàn)顯示AD患者面部皮損處以限制和球形馬拉色菌為主，并且隨皮損嚴(yán)重程度定植數(shù)量增加，但兩者與疾病嚴(yán)重程度之間的因果關(guān)系以及在頭面部AD中特異性的發(fā)病模式有待更多進(jìn)一步的研究。

此外，我們結(jié)果還顯示厚皮、糠秕和鈍性馬拉色菌的平均拷貝數(shù)比健康者也增加，雖然總體拷貝數(shù)量不高，提示AD面部皮損區(qū)馬拉色菌的菌種數(shù)量較健康者面部更豐富。由此提醒臨床醫(yī)師，當(dāng)AD患者出現(xiàn)頭頸部病變、青春期或年輕人病情加重、或者常規(guī)抗炎治療抵抗或加重等情況，要考慮馬拉色菌過敏可能，可選擇給予抗真菌治療。