閆蒙蒙 張蕾 程云霞 江幸福

摘要 ：為進一步探究黏蟲的磁感應機制，明確磁場強度變化對黏蟲相關(guān)基因表達的影響及相應的分子機制，本研究利用亥姆霍茲線圈裝置產(chǎn)生近零磁場，使用Illumina技術(shù)，分別對近零磁場（小于500 nT）和地磁場（約54 000 nT）下飼養(yǎng)的黏蟲雌蛾和雄蛾進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果表明：相對于地磁場，近零磁場下雌、雄蛾分別鑒定出1 670和1 401個差異表達基因，其中雌蛾鑒定出614個上調(diào)基因，1 056個下調(diào)基因;雄蛾鑒定出545個上調(diào)基因，856個下調(diào)基因;雌、雄蛾共同差異表達基因274個。GO功能分析和pathway結(jié)果顯示近零磁場脅迫與離子結(jié)合、催化和代謝等關(guān)鍵過程密切相關(guān)。對選取的10個差異基因進行熒光定量PCR驗證，證明了轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果準確可靠。本試驗為深入探究遷飛性昆蟲的地磁定向機制提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ：近零磁場; 地磁場; 黏蟲; 轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號：

S 433.4

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020013

Transcriptome analysis of the oriental armyworm Mythimna separata in

a near-zero magnetic field

YAN Mengmeng， ZHANG Lei， CHENG Yunxia， JIANG Xingfu*

（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

In order to further explore the mechanism of magnetoreception of Mythimna separata and clarify the effects of magnetic field changes on the expression of related genes， transcriptome analysis of M.separata in a near-zero magnetic field was carried out. In this study， Helmhortz coils were used to generate a near-zero magnetic field， and the Illumina technology was used to sequence the transcriptome of M.separata moths （female and male） raised in near-zero magnetic field （less than 500 nT） and normal geomagnetic field （about 54 000 nT）. The results showed that compared with geomagnetic field， 1 670 and 1 401 differentially expressed genes were identified in female and male adults under near-zero magnetic field， respectively， among which 614 up-regulated genes and 1 056 down-regulated genes were identified in female adults， and 545 up-regulated genes and 856 down-regulated genes were identified in male adults. There were 274 common differentially expressed genes in male and female adults. The gene ontology （GO） functional annotation and pathway enrichment analysis results showed that near-zero magnetic field was related to key biological processes， such as ion binding， catalysis activity and metabolism process. The results of qRT-PCR showed that the transcriptome was accurate and reliable. Our study provided a theoretical fundament for further study of the mechanism of magnetoreception in migratory insects.

Key words

near-zero magnetic field; geomagnetic field; Mythimna separata; transcriptome

與溫濕度、紫外線、CO2濃度一樣，磁場同樣是影響昆蟲生存的非生物因素之一[1]，然而卻極易被人們忽略。地磁場作為地球上最基本的物理因素，時刻影響著地球上生物的發(fā)育與進化[2]。地磁場強度從赤道的約30 μT向兩極逐漸遞增到約65 μT，且其強度隨著時間和空間的變化而不斷變化。許多動物如魚類、鳥類、昆蟲等動物可依賴地球磁場進行洄游及飛行定向[35]。磁場的極性、強度和傾角都可以幫助昆蟲確定目的地的地理位置進而幫助昆蟲保持恒定航向[6]。磁場變化不僅會影響昆蟲的定向行為，還會對昆蟲生長發(fā)育產(chǎn)生影響，如磁場強度降低會延長棉鈴蟲Helicoverpa armigera和褐飛虱Nilaparvata lugens生長發(fā)育歷期，降低褐飛虱產(chǎn)卵量，影響其翅型分化等[78]。盡管近年來開展了許多磁感應研究，然而關(guān)于生物磁效應機制目前尚不明確[9]。

黏蟲Mythimna separata是我國重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一，每年在我國南北往返季節(jié)性遷飛[1011]。其遷飛過程中，不僅濕度和溫度在逐漸變化，地磁場強度和方向也在不斷變化。前人研究表明，黏蟲雌、雄蛾在人工模擬的強磁場、近零磁場下均沒有顯著的群體共同定向行為，且野外不同地區(qū)遷飛性黏蟲的定向方向不同，表明黏蟲可能根據(jù)磁場進行遷飛定向[1214]。因此，明確磁場變化對黏蟲的影響及黏蟲的地磁定向機制對黏蟲發(fā)生的預測預報具有重要意義。

近零磁場又稱為亞磁場，即屏蔽地磁場后產(chǎn)生的磁場強度接近零的磁場。近零磁場可用于揭示磁場強度降低對生物產(chǎn)生的影響及地磁場對生物的重要性[1516]。本研究通過直流電型亥姆霍茲線圈屏蔽地磁場，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)探索黏蟲對近零磁場的分子響應機制，進一步挖掘磁感受相關(guān)基因，以期為深入研究遷飛性昆蟲的地磁定向機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)條件

以本實驗室連續(xù)繁殖多代的黏蟲為供試蟲源，室內(nèi)飼養(yǎng)條件為溫度（26±1）℃，相對濕度（70±10）%，光周期L∥D=14 h∥10 h，幼蟲飼養(yǎng)密度為10頭/罐（罐直徑9 cm，高13 cm），以人工飼料飼喂，幼蟲老熟后置于含水量為15%的土壤中化蛹，成蟲羽化后飼喂5%的蜂蜜水，取羽化后48 h的雌、雄蛾供試，并設(shè)置3次重復。

1.2 磁場發(fā)生裝置

磁場發(fā)生裝置由亥姆霍茲線圈和相連的兩個電源箱組成（中國科學院電工所制），亥姆霍茲線圈為正方體形，線框直徑為1 m，通過調(diào)節(jié)電源箱電流可在線圈中心區(qū)域（20 cm×20 cm×20 cm）內(nèi)產(chǎn)生低于500 nT的磁場（近零磁場）。兩個磁場發(fā)生裝置放置在同一房間內(nèi)（間隔3 m），一個用來產(chǎn)生近零磁場，另一個用來做假暴露以避免裝置帶來的誤差。每次試驗前及過程中均使用磁強計（CH-330F，北京翠?？萍加邢薰荆z測磁場強度。

1.3 黏蟲成蟲RNA提取

供試黏蟲從卵至成蟲分別放置在近零磁場和正常地磁場中飼養(yǎng)。分別收集正常地磁場下和近零磁場下羽化48 h的雌、雄蛾蟲體。不同磁場下每個性別各3個重復，共12個樣品。每個樣品由3頭黏蟲混合組成，液氮處理后儲存在-80℃超低溫冰箱中。以地磁場下黏蟲雌、雄蛾為對照，近零磁場下雌、雄蛾為處理組進行轉(zhuǎn)錄組測序，地磁場下雌、雄蛾樣品分別編號為GF1、GF2、GF3和GM1、GM2、GM3，近零磁場雌、雄蛾樣品分別編號為OF1、OF2、OF3和OM1、OM2、OM3。采用TRIzol法提取不同處理組樣品總RNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否降解或污染，超微量紫外分光光度計（凱奧，K5500）檢測RNA的純度，使用安捷倫2100 RNA Nano 6000 Assay Kit（Agilent Technologies，CA， USA）檢測RNA樣品的完整性和濃度。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序及信息注釋

檢測合格的RNA樣品在北京安諾優(yōu)達公司進行cDNA文庫構(gòu)建以及Illumina平臺測序。測序完成后，通過去除低質(zhì)量序列、去接頭等過程完成數(shù)據(jù)處理，得到高質(zhì)量序列進行組裝。選取| log2Ratio |≥1和q<0.05的基因作為差異顯著表達基因。

1.5 GO功能分析

根據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫（http：∥www.geneontology.org/），使用GO功能來分析差異基因（DEG）的主要功能。計算每個GO條目的差異基因數(shù)目，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集的GO條目。其計算公式為P=∑m-1i=0（Mi）（n-Mn-i）（Nn），其中N為所有基因中具GO功能注釋的基因數(shù)目;n為N中差異表達基因的數(shù)目;M為所有基因中注釋到某特定GO條目的基因數(shù)目;m為注釋到某特定GO條目的差異表達基因數(shù)目。計算得到的P值經(jīng)過校正后，以P<0.05為閾值，滿足P<0.05的GO條目為差異表達基因中顯著富集的GO條目。

1.6 pathway 富集分析

根據(jù)京都基因和基因組百科全書（KEGG）（http：∥www.genome.jp/kegg/），使用pathway分析確定差異表達基因的主要通路。以P<0.05為標準，對KEGG中每個pathway應用超幾何檢驗進行富集分析，找出差異表達基因中顯著富集的pathway。

1.7 qPCR定量分析

為驗證轉(zhuǎn)錄組測序的準確性，從測序結(jié)果中隨機選擇10個差異表達基因采用熒光定量PCR進行驗證。使用Beacon Designer設(shè)計基因特異性引物（表1），并由生工生物工程（上海）有限公司合成，以β-actin和18S rRNA為內(nèi)參基因。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈;以合成的cDNA為模板，在Bio Rad 儀器上進行實時熒光定量PCR：35個循環(huán)，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。繪制熔解曲線，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個試驗用重復3次的樣品進行qPCR分析。文中數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤（SE）。均值用單因素方差分析作比較。當P<0.05時為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果與質(zhì)量評估

經(jīng)檢測，樣品總RNA均滿足后續(xù)試驗分析要求。不同磁場下雌、雄蛾共12個樣本轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表2。過濾后的reads數(shù)占總數(shù)的98%

以上。各樣本的Q30（序列中質(zhì)量大于30即錯誤率小于0.1%的堿基數(shù)的比例）均在92%以上，各樣本GC含量均在40%左右，測序結(jié)果準確度較高，可用于后續(xù)分析。

1） GF1、GF2、GF3為地磁場下雌蛾樣品， GM1、GM2、GM3為地磁場下雄蛾樣品， OF1、OF2、OF3為近零磁場下雌蛾樣品， OM1、OM2、OM3為近零磁場下雄蛾樣品。

GF1， GF2， GF3 indicate female moth under geomagnetic field. GM1， GM2， GM3 indicate male moth under geomagnetic field. OF1， OF2， OF3 indicate female moth under near-zero magnetic field， and OM1， OM2， OM3 indicate male moth under near-zero magnetic field.

2.2 差異表達基因分析

相對于地磁場，近零磁場下雌、雄蛾分別鑒定出1 670個和1 401個差異表達基因，其中雌、雄蛾分別鑒定出614、545個上調(diào)基因和1 056、856個下調(diào)基因（圖1～2）。其中雌、雄蛾共同差異表達基因274個。大部分差異表達基因的差異倍數(shù)分布在1倍～10倍之間，少部分差異倍數(shù)達到10倍以上。

2.3 GO功能分析

GO功能分析結(jié)果顯示（圖3），生物過程中，不同磁場下黏蟲雌雄蛾差異基因主要集中在催化、合成和代謝過程;在分子功能中雌、雄蛾分別有53個和24個顯著富集條目，大多為聚合酶、內(nèi)切酶、水解酶、合成酶、核酸酶、還原酶和肽酶活性等;細胞組分中差異基因主要集中在細胞內(nèi)和細胞質(zhì)組分。

2.4 KEGG通路分析

在pathway分析中，除人類疾病外，雌蛾中細胞黏附分子通路富集到的差異基因最多，其次為AMPK信號通路、脂肪酸合成通路、細胞外基質(zhì)受體交互作用通路、PI3K-Akt信號通路、嘌呤代謝、脂肪酸代謝、碳代謝、膽固醇代謝、神經(jīng)活性配體—受體相互作用途徑。雄蛾中雷帕霉素信號通路富集到的差異基因最多，其次為脂肪酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、AMPK信號通路、細胞凋亡、自噬、脂肪酸合成，神經(jīng)活性配體—受體相互作用途徑。

2.5 qRT-PCR驗證

從轉(zhuǎn)錄組中隨機挑選了10個差異表達基因進行熒光定量PCR驗證。結(jié)果表明差異基因定量表達結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致（圖4），其中7個基因表現(xiàn)為一致下調(diào)，3個基因表現(xiàn)為一致上調(diào)。說明轉(zhuǎn)錄組測序具有較高的準確性和可靠性。

3 討論

自趨磁細菌發(fā)現(xiàn)以來，越來越多的國內(nèi)外學者關(guān)注磁場的磁生物學效應。地磁定向是遠距離遷飛昆蟲的重要定向機制之一，也是目前生物磁效應研究熱點[17]。目前，廣泛認可的磁感應機制有兩種，即依賴光的自由基對假說和磁顆粒假說，兩種假說之間并不矛盾，兩者可能同時存在于生物體內(nèi)[1819]。

在依賴光的自由基對假說中，藍光受體隱花色素CRYs被認為是最可能的磁感應受體。CRYs是紫外光和藍色光感受器，存在于植物和動物中，含有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）發(fā)色團，在光活化后形成自由基對[2021]。磁場還被認為是一種授時因子[2126]，CRY作為核心生物鐘基因，被認為參與了磁場影響果蠅晝夜節(jié)律的過程[27]，同時CRY還參與介導磁場對果蠅趨地性、趨光性，交配行為等的影響過程[2829]。Mo等對近零磁場下培養(yǎng)的人神經(jīng)瘤母細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選到CRY2在近零磁場下差異表達[30]，而在灰飛虱Laodelphax striatellus雌成蟲的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，CRYs在地磁場和近零磁場下并不存在顯著差異表達[31]。在黏蟲雌雄蛾轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中也未篩選到CRYs基因在地磁場和近零磁場下差異表達，這可能與CRYs的調(diào)控時間和作用位置有關(guān)。萬貴鈞研究表明白背飛虱Sogatella furcifera體內(nèi)CRY1和CRY2對近零磁場的響應存在時間特異性，可能是CRYs的生物鐘功能和磁感受功能交互作用引起的[32]。

磁顆粒假說認為磁鐵礦物晶體存在于生物體內(nèi)，外界磁場對生物體內(nèi)鐵磁顆粒產(chǎn)生磁矩進而改變生物膜上的離子通道開關(guān)影響神經(jīng)系統(tǒng)[19]。遷飛性昆蟲褐飛虱、鱗翅目昆蟲黑脈金斑蝶 Danaus plexippus體內(nèi)均已發(fā)現(xiàn)鐵磁性物質(zhì)[3334]。而黏蟲體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)存在鐵磁性物質(zhì)。Fitak等通過轉(zhuǎn)錄組測序開展了虹鱒魚在基因水平對脈沖磁場的響應研究，發(fā)現(xiàn)與鐵吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)的ferritin基因參與虹鱒魚的磁感受過程[35]。對近零磁場下培養(yǎng)的灰飛虱雌蟲的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，與鐵吸收相關(guān)的MVL基因在灰飛虱雌成蟲中差異表達[31]。本研究發(fā)現(xiàn)黏蟲雄蛾體內(nèi)與Fe轉(zhuǎn)運蛋白和鐵硫結(jié)合相關(guān)基因差異表達，雌、雄蛾中分別篩選到17個和8個與鐵離子轉(zhuǎn)運結(jié)合相關(guān)的差異表達基因，推測磁顆粒感受機制可能在黏蟲的磁響應過程中發(fā)揮作用。

在GO功能分析中，不同磁場下黏蟲雌、雄蛾差異表達基因大多富集在離子結(jié)合、代謝和酶活過程，表明近零磁場對黏蟲的生長發(fā)育也存在一定影響。這與前期研究發(fā)現(xiàn)近零磁場對黏蟲的生長發(fā)育存在負面影響一致（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。本試驗中，近零磁場下黏蟲雌、雄蛾下調(diào)基因數(shù)量都多于上調(diào)基因，與人神經(jīng)瘤母細胞的測序結(jié)果[30]相似，而近零磁場下的灰飛虱雌蟲轉(zhuǎn)錄測序得到數(shù)量相近的下調(diào)基因和上調(diào)基因[31]，這可能是由于不同物種對近零磁場的響應存在特異性差異。近零磁場下雌、雄蛾轉(zhuǎn)錄組中，雌蛾比雄蛾多出269個差異基因，雌、雄蛾共同差異表達基因共274個，在GO功能分析的生物過程中，雌、雄蛾差異表達基因顯著富集到的生物途徑也有所不同，不同性別黏蟲可能對近零磁場的敏感性不同。

昆蟲的地磁定向機制是一個復雜的過程，不僅與地磁場強度有關(guān)，還可能與磁場的極性和磁傾角相關(guān)，而本試驗僅考慮了磁場強度，并未涉及磁傾角的變化。昆蟲的地磁定向機制應結(jié)合生物物理學、生態(tài)學、分子生物學、解剖學等多學科做進一步研究。

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（責任編輯：楊明麗）