莫瑾 王哲 周慧平 朱宏建 朱水芳 廖曉蘭

摘要 ：對水稻中多種病原細菌的檢測，使用常規(guī)方法往往耗時耗力，而多重PCR可以更加高效地進行多種細菌的檢測。根據(jù)水稻細菌性谷枯病菌gyrB基因，水稻細菌性葉鞘褐腐病菌PfsI/R quorum sensing 位點以及水稻細菌性條斑病菌和水稻白葉枯病菌含鐵細胞接受因子基因設計引物，建立4種水稻病菌的多重PCR檢測方法，對方法進行特異性和靈敏度測試，并對采自不同地區(qū)的水稻樣本進行檢測。結果顯示，多重PCR方法能同步地快速檢測出水稻細菌性谷枯病菌、水稻細菌性葉鞘褐腐病菌、水稻細菌性條斑病菌或水稻白葉枯病菌，檢測靈敏度達到103 cfu/mL的菌液濃度，利用該方法對我國不同地區(qū)的58份水稻種子進行檢測，其中17個樣本檢測出水稻細菌性條斑病菌或水稻白葉枯病菌，未檢測到水稻細菌性谷枯病菌和水稻細菌性葉鞘褐腐病菌。

關鍵詞 ：多重PCR; 水稻病原細菌; 檢測

中圖分類號：

S 435.111

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020205

A multiplex PCR method for rapid detection of four rice pathogenic bacteria

MO Jin1，2， WANG Zhe2， ZHOU Huiping2， ZHU Hongjian1， ZHU Shuifang1， LIAO Xiaolan1*

（1. College of Plant Protection，Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China;

2. Technology Center of Changsha Customs， Changsha 410004， China）

Abstract

Multiplex PCR is an efficient and simple method to detect a variety of pathogenic bacteria in rice at the same time. A multiplex PCR detection method was established for four rice pathogenic bacteria， and the primers were designed based on the gyrB gene of Burkholderia glumae，the PfsI/R quorum sensing locus of Pseudomonas fuscovaginae and the iron-containingcell-receiving factor genes of Xanthomonas oryzae pv. oryzae and X. oryzae pv. oryzicola. The specificity and sensitivity of the multiplex PCR method were validated， and rice samples from different regions were tested using this method. The results showed that the multiplex PCR method can fast and accurately detect four rice pathogenic bacteria. The detectability of this method reached 103 cfu/mL in the bacterial solution. Among 58 rice samples from different regions， neither B.glumae nor P.fuscovaginae was detected，while X.oryzae pv. oryzae or X.oryzae pv. oryzicola were positive in 17 samples.

Key words

multiplex PCR; rice pathogenic bacteria; detection

水稻細菌性谷枯?。ú≡築urkholderia glumae）[12]、水稻細菌性葉鞘褐腐?。ú≡篜seudomonas fuscovaginae）[34]、水稻白葉枯病（病原菌：Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和水稻細菌性條斑?。ú≡篨.oryzae pv. oryzicola）[56]等水稻細菌性病害，對水稻危害嚴重，導致嚴重減產。其中水稻細菌性谷枯病、水稻細菌性條斑病和水稻白葉枯病屬于我國進境檢疫性病害，水稻細菌性葉鞘褐腐病是馬來西亞等稻種進口國的進境檢疫性病害。

目前有多種關于這4種病原菌檢測技術的報道。Takeuchi等[1]建立了B.glumae的檢測方法;羅金燕等[7]研究了B.glumae的生理生化特點、Biolog、RAPD-PCR和致病性測定等鑒定方法;Sayler等[8]和Fang等[9]建立了B.glumae的實時熒光PCR鑒定法;朱金國、莫瑾等制定了PCR、實時熒光PCR、生理生化鑒定等方法檢測B.glumae、X. oryzae pv. oryzae和X.oryzae pv. oryzicola的國家標準[1011];劉雅婷等設計了X.oryzae pv. oryzae和X.oryzae pv. oryzicola的多重PCR檢測體系并申請了專利[12];田茜等建立了X.oryzae pv. oryzae和X.oryzae pv. oryzicola的數(shù)字PCR檢測方法[13]。徐福壽等采用生理生化鑒定、Biolog生化鑒定和脂肪酸鑒定等方法對P. fuscovaginae進行了鑒定研究[13]。傳統(tǒng)生化方法往往費時且對菌種純度、操作等要求比較高，熒光定量PCR、數(shù)字PCR對于檢測設備條件要求高，成本高。且相關研究所使用的標準菌株及病理材料數(shù)量有限，有必要進行檢測特異性及準確性方面的驗證。

本研究采用國家標準中B.glumae、X. oryzae pv. oryzae和X.oryzae pv. oryzicola的特異性檢測引物[1011]，并根據(jù)水稻細菌性葉鞘褐腐病PfsI/R quorum sensing 位點設計引物，以期建立快速、靈敏且特異性高的多重PCR方法對水稻中B.glumae、P.fuscovaginae以及X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola進行同步檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌：水稻細菌性谷枯病菌、水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌和水稻細菌性葉鞘褐腐病菌菌株，購自英國國家植物病原菌種保存中心（NCPPB）;其他對照菌株分別來源于水稻種子中自然分離和購自美國國家菌種保藏中心（ATCC）、中國國家菌種保藏中心（CGMCC）和NCPPB。具體菌株來源及編號見表1。

試劑：PCR反應液MasterMix（2×），DNA Marker，為北京天根試劑公司產品。

儀器：PCR擴增儀（Applied Biosystems），凝膠成像儀（Bio-RAD）。

1.2 DNA提取

制備菌懸液：取營養(yǎng)瓊脂平板上新鮮菌落（生長24～48 h）至PS液體培養(yǎng)基[10]，振蕩培養(yǎng)16 h±2 h（培養(yǎng)條件：28℃±1℃、180 r/min）后取1 mL菌液，8 000 r/min離心5 min，棄上清，用1.5 mL 0.01 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液將沉淀重懸，重復離心、洗滌3次，用1 mL PBS重懸菌體，96℃滅活5 min，-20℃保存?zhèn)溆?。多重PCR檢測將振蕩培養(yǎng)的菌液各取500 μL混合后，再按以上操作離心收集菌體。采用10倍稀釋法進行菌液濃度測定。按照薩姆布魯克等[15]的方法提取細菌DNA。

1.3 引物設計及合成

gryB基因因其分辨率高等特點，廣泛應用于細菌近源種的鑒定[16]，針對B.glumae的gryB基因（GenBank AB207074）設計特異性引物，BG-F3：5′-GCAGCGGCAAGGAAGACG-3′;BG-R3：5′-GTCGTCGCCCGACGTCTC-3′，PCR產物大小為317 bp。 參考Mattiuzzo等的研究[4]，利用水稻細菌性葉鞘褐腐病菌保守的N-?；呓z氨酸內酯（AHL）群體感應（QS）系統(tǒng)中PfsI/R系統(tǒng)的編碼基因PfsI/R quorum sensing（GenBankFN598970.1）設計擴增水稻細菌性葉鞘褐腐病菌的上下游引物，PfsI/R-F： 5′-AGTGAATGGGAGTGCCAGGAC-3′;PfsI/R-R： 5′-TGTAGCGAAATAACCCGAGCC-3′，預期擴增片段大小為494 bp。比對GenBank 水稻白葉枯病菌和水稻細菌性條斑病菌的含鐵細胞接受因子基因（putative siderophore receptor gene， GenBank AF3257323）的保守序列，設計引物F1：5′-GAATATCAGCATCGGCAACAG-3′;R1：5′-TACCGGAGCTGCGCGTT-3′，兩種病菌預期擴增片段大小均為152 bp。引物由Invitrogen公司合成。

1.4 PCR擴增及產物測序

PCR擴增體系：2×PCR Mix 25 μL、10 μmol/L引物（工作濃度10 pmol/μL）F1、R1各1.0 μL，BG-F3、BG-R3各0.75 μL，PfsI/R-F、PfsI/R-R各05 μL，DNA模板（1～10 ng/μL）2 μL，用ddH2O補足至50 μL反應體系。反應程序：96℃ 5 min;96℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán);最后72℃ 5 min。

電泳檢測：PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為120 V，紫外凝膠成像儀進行電泳觀察。由上海生工生物工程有限公司進行PCR產物測序。

1.5 特異性和靈敏度檢測

單一目標菌多重PCR檢測特異性試驗：PCR擴增參試的單一菌株，對PCR產物進行電泳檢測。

多目標菌多重PCR檢測特異性試驗：提取A1、B11、C7、F1按體積等比兩兩混合的菌液DNA，提取等比混合的A1、B11、F1，A8、C7、F2以及A1、B11、C7、F1等3組組合的菌液DNA，采用設計的3對引物同時擴增提取的DNA，電泳檢測PCR產物。

多重PCR靈敏度檢測試驗：將濃度為106cfu/mL的A1、B11、F1以及A8、C7、F2目標菌菌液等比例混合，采用10倍稀釋法將目標菌液制備至濃度均為106、105、104、103、102 cfu/mL和10 cfu/mL，提取DNA并進行PCR擴增，電泳檢測PCR產物。

1.6 應用多重PCR技術檢測水稻種子

對來自安徽、四川、湖南、海南和廣西等地的58個水稻種子樣品進行多重PCR檢測。用滅菌蒸餾水沖洗水稻種子3次后，取10 g加入90 mL 0.001%吐溫磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），將種子充分破碎后，立即取1.5 mL液體至離心管內，8 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用滅菌蒸餾水重懸后重復離心3次，得到的沉淀進行DNA提取及多重PCR擴增，擴增條件見1.4，其中擴增體系中DNA模板（1～10 ng/μL）加入體積為5 μL。分別以A1、B11、C5和F1菌液浸泡經無菌水沖洗表面后的水稻種子，晾干后作為陽性帶菌材料進行試驗。

2 結果與分析

2.1 多重PCR單一目標菌特異性檢測

對單個參試菌株提取的DNA，使用BG-F3和BG-R3、PfsI/R-F和PfsI/R-R、F1和R1 3對引物的混合反應體系進行PCR擴增，結果顯示，多重PCR反應能同時特異性地擴增出B.glumae、P.fuscovaginae、X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola，混合反應體系擴增B.glumae得到PCR產物片段為317 bp，擴增P.fuscovaginae得到PCR產物片段為494 bp，擴增X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola得到PCR產物片段為152 bp，片段大小均與預期一致，同時對菌株CK1～CK16提取的DNA進行多重PCR擴增，均未擴增出目的條帶（圖1）。在GenBank中對擴增產物的測序結果進行比對分析，證明得到的PCR產物與設計的目標菌片段大小一致，其中PfsI/R-F和PfsI/R-R、BG-F3和BG-R3擴增的PCR產物與GenBank中的P.fuscovaginae、B. glumae序列同源性大于99%，F(xiàn)1和R1擴增的產物與X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola序列同源性大于97%。

2.2 多重PCR多目標菌檢測結果

結果顯示，多重PCR反應體系同步擴增B.glumae、P.fuscovaginae以及X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola，均能擴增出與目的片段大小一致的條帶（圖2），而采用多重PCR擴增其他參試菌株時，均未出現(xiàn)目標條帶。說明同時應用3對引物進行目標菌的多重PCR檢測，引物間無相互干擾，檢測特異性強，可采用該方法對B.glumae、P.fuscovaginae以及X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola進行檢測。

2.3 多重PCR靈敏度檢測

提取不同濃度的混合菌液的DNA后，采用多重PCR反應體系進行PCR靈敏度檢測。結果顯示，菌液濃度為103 cfu/mL時，能有效地檢測出4種細菌（圖3），檢測靈敏度可達到103 cfu/mL菌液濃度。

2.4 多重PCR技術在水稻種子檢測中的應用

對采自不同地區(qū)的58份水稻種子樣本進行多重PCR檢測，其中陽性對照檢測結果正常，安徽的8個種子樣品、四川的12個種子樣品、湖南稻區(qū)的20個種子樣品、廣西的10個種子樣品和海南的8個種子樣品均未檢測出水稻細菌性谷枯病菌或水稻細菌性葉鞘褐腐病菌，有17個樣本檢測出水稻白葉枯病菌或水稻細菌性條斑病菌。

3 討論

水稻細菌性谷枯病、水稻細菌性葉鞘褐腐病以及水稻白葉枯病和水稻細菌性條斑病，4種病害均可通過種子傳播，宿主廣泛，具有較強的侵染性，導致水稻減產嚴重，其中水稻細菌性谷枯病、水稻細菌性葉鞘褐腐病在我國尚無大面積病害發(fā)生的報道。同時，進口國對于我國出口的雜交稻種不斷提出新的檢疫要求，影響我國稻種的順利出口。因此，無論是在水稻種植的各個環(huán)節(jié)還是在稻種的調運過程中，及時開展水稻病害的快速檢測，為防止病害的大面積傳播、跨境傳播、有害生物的入境以及稻種的順利出口都提供了必要的技術保障。再者，為方便進出口貿易，降低倉儲成本和保障商品品質，目前海關等部門大力推行“快檢快放”“快速通關”等一系列政策，提高通關效率，由此對檢疫速度提出了更高的要求，也是目前口岸檢疫部門的迫切需求。

目前，國內外關于幾種病害的檢測技術主要以常規(guī)生理生化檢測和分子檢測為主。其中傳統(tǒng)的生理生化檢測方法操作復雜，耗時長，部分植物病原菌受其生長時間長的影響，其生理生化特征不穩(wěn)定，因此，傳統(tǒng)生化檢測不能完全適用于快速檢測鑒定。相對于單一檢測某種目標菌的PCR檢測方法，多重PCR檢測能在一次反應中同時檢測多種目標菌，李云飛等利用多重PCR診斷水稻白葉枯病和細菌性條斑病的復合發(fā)生[5]，Maeda等建立了多重PCR檢測B.plantarii、B.glumae 和 B.gladioli的方法[17]，相關方法的建立極大地縮短了檢測時間，實現(xiàn)了對目標細菌的快速鑒別。多重PCR檢測技術的建立在及時預防病害的傳播、防止外來有害生物的入侵、提高通關效率、保障我國雜交稻種的順利出口等各方面提供了快速有效的解決方法。

本研究建立的三重PCR于同一反應體系中同步檢測B.glumae、P.fuscovaginae以及X.oryzae pv. oryzae或X.oryzae pv. oryzicola 4種水稻病菌，3對檢測引物相互間無干擾，在反應條件一致的情況下，能夠特異性地同步擴增出各菌株目標基因，達到對目標菌快速、低成本檢測鑒定的目的。其中X.oryzae pv. oryzae和X. oryzae pv. oryzicola同為稻黃單胞菌屬，均屬于我國進境植物檢疫性有害生物，本多重PCR方法中用1對引物同時檢測2種有害病原菌，減少了多重PCR中引物的相互干擾，對于快速篩選健康植物材料和保障“快速驗放”提供了技術支持。通過對我國不同地區(qū)的水稻種子的檢測結果表明，B.glumae和P.fuscovaginae在國內未發(fā)現(xiàn)有攜帶發(fā)生。因此，加強對入境物種攜帶B.glumae和P.fuscovaginae的控制和檢疫，嚴防輸入是有效防止相關病害在我國發(fā)生和傳播的關鍵。

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（責任編輯：田 喆）