楊威，馮艷飛，任國鑫，高樹仁

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院/黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗室，大慶163319）

玉米（Zea mays L.）是世界上重要的糧食作物，北方春玉米區(qū)是我國玉米主產(chǎn)區(qū)之一，占我國玉米播種面積的30%左右。而在這些地區(qū)春季低溫冷害經(jīng)常發(fā)生，嚴(yán)重限制玉米種子萌發(fā)和幼苗的生長發(fā)育，甚至可能會導(dǎo)致玉米生長后期籽粒品質(zhì)及產(chǎn)量下降[1-3]。因此，篩選并鑒定耐低溫玉米種質(zhì)資源，為培育耐低溫玉米品種就顯得尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)，低溫會影響玉米等植物細(xì)胞的酶活性、膜系統(tǒng)以及各項生理生化指標(biāo)[4]。游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)滲透壓大小來降低低溫脅迫對細(xì)胞酶蛋白質(zhì)和生物膜的傷害[3-5]。楊德光等[5]通過低溫脅迫對玉米發(fā)芽及幼苗各項生理特性的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下玉米幼苗的MDA含量、POD活性、SOD活性變化趨勢均為先升后降，低溫脅迫初期上升較快，恢復(fù)初期下降較快，即使恢復(fù)生長后，各指標(biāo)均高于常溫處理。于海瑞等[6]利用單一變量法分析玉米幼苗低溫脅迫后生長發(fā)育和生理變化發(fā)現(xiàn)，MDA含量和SOD活性均在低溫脅迫12 h后達(dá)到峰值，POD活性36 h達(dá)到峰值。彭云玲等[7]對44份玉米自交系進(jìn)行低溫脅迫性狀鑒定，使用隸屬函數(shù)法進(jìn)行耐寒性綜合評價，結(jié)果表明低溫處理后，POD和SOD活性有相似的變化趨勢，而且隨著低溫時間加長，下降幅度逐漸增大，由于材料不同，少則下降5.29%，多則下降74.95%。根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)，通過分析不同品種的保護(hù)酶活性和丙二醛含量下降或上升幅度大小可以為篩選耐寒種質(zhì)提供理論參考。

因此，試驗以前期萌芽期低溫脅迫實(shí)驗獲得的4份玉米種質(zhì)資源為研究對象，三葉一心期進(jìn)行低溫脅迫，通過觀察植株表型和測定葉片生理生化指標(biāo)來進(jìn)一步鑒定其對低溫脅迫的響應(yīng)，為玉米耐低溫種質(zhì)資源評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

4份玉米自交系，其中C71、東91和京33為萌芽期低溫不敏感型，東46為萌芽期低溫敏感型，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)玉米育種研究室提供。

1.2 試驗設(shè)計

選擇玉米種粒均勻飽滿一致的自交系種子，置于28℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽，萌發(fā)后在每個自交系中挑選出長勢一致并且生長旺盛的種子播種于土壤中，每盆播種5株，每個材料播種8盆，待生長至三葉一心期，每個材料各取4盆分別置于24℃和6℃的培養(yǎng)箱中，24℃處理為對照組，48 h后取出，稱量鮮重，并保存于冰盒內(nèi)，測定生理生化指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)的測定方法

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定采用紫光分光光度法[8]、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定和過氧化物酶（POD）活性測定采用于晶[9]的方法、丙二醛（MDA）含量測定采用楊德光[5]的方法、游離脯氨酸采用磺基水楊酸法測定[10-11]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定[12]，采用蒽酮法測定可溶性糖含量[13-14]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗圖表用Excel 2010制作，使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗。顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株表型及葉片含水量變化分析

從圖1A可以看出，在6℃處理48 h后，4個自交系材料葉片均出現(xiàn)萎蔫、下卷現(xiàn)象，其中東91較其它供試材料植株長勢整齊，其余材料均出現(xiàn)少量植株傾斜；圖1B顯示，低溫脅迫后C71、京33、東46與對照相比鮮重顯著下降，而東91鮮重有下降但不顯著，4個材料鮮重下降幅度分別為28.3%、16%、19.2%、9.1%。以上結(jié)果說明，低溫脅迫后自交系東91耐低溫能力可能要比其他材料表現(xiàn)好，能夠很好適應(yīng)環(huán)境變化。

圖1 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片表型及鮮重分析Fig.1 The leaf phenotype and fresh weight analysis of different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.2 玉米苗期葉片膜質(zhì)化程度分析

2.2.1 丙二醛（MDA）含量

從圖2可以看出，6℃低溫脅迫48 h后，自交系C71、京33、東91的丙二醛含量均顯著上升，上升幅度分別為400%、200%、600%，而自交系東46與對照相比下降但不顯著，下降幅度為20%。以上結(jié)果說明，東91和京33經(jīng)低溫脅迫后葉片組織過氧化程度較重。

圖2 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片丙二醛（MDA）含量分析Fig.2 The content analysis of MDA in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.2.2 電導(dǎo)率分析

從圖3可以看出，6℃處理48 h后，4個供試材料的電導(dǎo)率和對照相比變化均顯著，其中自交系C71、東46與東91的葉片電導(dǎo)率均顯著提高，分別增加16.1%、29.8%和34.3%，而京33電導(dǎo)率顯著降低，降低幅度為20.3%。實(shí)驗結(jié)果說明，低溫脅迫導(dǎo)致細(xì)胞膜透性受到破壞，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，其中C71電導(dǎo)率增加最小，分析其耐低溫脅迫能力可能最好，京33的電導(dǎo)率較對照降低可能由實(shí)驗誤差引起。

圖3 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片電導(dǎo)率分析Fig.3 The analysis of conductivity in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.3 玉米苗期葉片保護(hù)酶活性分析

2.3.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性

從圖4可以看出，在6℃處理48 h后，4個玉米自交系品種的PAL活性與對照相比變化差異均顯著，其中C71、京33、東46顯著下降，分別下降了56.3%、21.2%和41%，而東91顯著上升，上升61.2%。以上結(jié)果說明，自交系東91低溫脅迫后，植株葉片PAL活性比較高，PAL能夠提高植株的抗逆性，所以東91可能更能夠適應(yīng)低溫環(huán)境。

圖4 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性分析Fig.4 The activity analysis of PAL in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性

從圖5可以看出，在6℃處理48 h后，4個玉米自交系品種的SOD活性與對照相比變化均顯著上升。自交系C71、京33、東46、東91的SOD活性分別上升31.5%、42.5%、96.6%、27.4%。以上結(jié)果說明，東46低溫脅迫后，植株葉片SOD活性上升幅度最大，分析其可能對低溫響應(yīng)最敏感。

圖5 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性比較Fig.5 The activity analysis of SOD in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.3.3 過氧化物酶（POD）活性

從圖6可以看出，6℃處理48 h后，4個玉米自交系品種的POD活性與對照相比變化均顯著，其中京33、東46和東91顯著上升，上升幅度分別為184.6%、85.7%、59.1%，而C71顯著下降，下降幅度為45.8%。以上結(jié)果說明，自交系京33經(jīng)低溫脅迫后POD活性提高最顯著，僅從指標(biāo)考慮分析其耐低溫能力可能較其他自交系表現(xiàn)好。

圖6 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片過氧化物酶（POD）活性分析Fig.6 The activity analysis of POD in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.4 玉米苗期葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量分析

2.4.1 脯氨酸含量

從圖7可以看出，6℃低溫脅迫48 h后，和對照相比自交系C71、京33和東91葉片脯氨酸含量均有所增加，分別提高112.4%、76.2%和105.6%，且差異顯著，而自交系東46的脯氨酸含量降低6.4%，但差異不顯著。該結(jié)果說明，自交系C71經(jīng)低溫脅迫后脯氨酸含量增加顯著，其耐低溫能力可能較好，其次為東91。

圖7 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片游離脯氨酸含量分析Fig.7 The content analysis of proline in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.4.2 可溶性糖含量

由圖8可知，和對照相比6℃低溫脅迫48 h后，自交系京33和東91可溶性糖含量均有所增加，分別提高36.0%和9.7%，其中京33差異顯著而東91差異不顯著，而C71與東46可溶性糖含量分別降低54.9%和72.9%，且差異顯著。該結(jié)果說明，根據(jù)可溶性糖含量變化分析，京33和東91耐低溫能力可能要優(yōu)于C71和東46。

圖8 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片可溶性糖含量分析Fig.8 The content analysis of soluble sugar in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

2.4.3 可溶性蛋白含量

從圖9可以看出，和對照相比6℃低溫脅迫48 h后，4個自交系材料的可溶性蛋白含量均有所提高，C71、京33、東46和東91分別提高56.2%、44.4%、22.9%和43.1%，且差異均顯著，增加量由大到小依次為C71>京33>東91>東46。僅根據(jù)可溶性蛋白含量分析，自交系C71的耐低溫能力可能要好于其他供試材料。

圖9 6℃與24℃處理后不同玉米自交系苗期葉片可溶性蛋白含量分析Fig.9 The content analysis of soluble protein in different inbred lines at seedling stage under 6℃and 24℃treatment

3 討論

低溫脅迫對植物生理生化的響應(yīng)比較復(fù)雜，涉及細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及抗氧化酶活性等變化[15]。

丙二醛（MDA）含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn)，MDA在植物中的含量多少也可以作為判斷植株抗低溫能力的指標(biāo)之一[16]。黃偉超等[17]研究表明，低溫脅迫下，葉片內(nèi)的丙二醛（MDA）含量會明顯升高。研究與前人研究結(jié)果基本一致，隨著低溫時間的加長，其MDA含量上升，細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度逐漸加重，但自交系東46的MDA含量明顯低于其他自交系，分析其可能耐低溫能力強(qiáng)。

通過植物細(xì)胞外滲透液導(dǎo)電性的差異能確定膜透性的大小，推測膜的受傷程度與對寒冷抗性強(qiáng)弱。楊猛[18]的實(shí)驗發(fā)現(xiàn)耐冷性弱的自交系相對電導(dǎo)率上升幅度較大，說明低溫的傷害往往作用于質(zhì)膜，使質(zhì)膜的選擇透過性發(fā)生改變或喪失，導(dǎo)致溶質(zhì)外滲，因此質(zhì)膜的透性變化可顯示細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的受損程度。有研究[19]認(rèn)為抗寒性越強(qiáng)的細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)膜的透性在低溫條件下增加的越小，也就是說耐低溫的品種電導(dǎo)率增加的幅度小，從試驗中發(fā)現(xiàn)4個自交系的電導(dǎo)率變化均極為顯著，但京33的增加量較少，說明其耐低溫能力可能較強(qiáng)。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）能夠?qū)⒈奖彼岽呋D(zhuǎn)化為肉桂酸，在農(nóng)業(yè)工業(yè)中，肉桂酸可以作為生長促進(jìn)劑和長效殺菌劑，在植物體內(nèi)抵御外界不良環(huán)境的迫害，所以苯丙氨酸解氨酶的活性增強(qiáng)進(jìn)而可以提高植物的抗逆性[20]。研究與范樹國等[21]的研究結(jié)果相似，玉米幼苗的PAL活性在低溫條件下增強(qiáng)，實(shí)驗中，C71、京33、東46品種與對照比較均呈下降趨勢，其中自交系東91苯丙氨酸解氨酶活性最高，說明自交系東91的耐低溫性可能較強(qiáng)。

超氧化物歧化酶（SOD）作為抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能夠清除植物體內(nèi)的ROS（活性氧），大量的實(shí)驗顯示SOD可有效提高植物的抗逆性，對細(xì)胞起著重要的保護(hù)作用，同時抗性品種也可以通過SOD酶活性指標(biāo)輔助選擇[22]。張宇婷等[23]研究表明，在逆境脅迫下，植物體內(nèi)的SOD活性顯著增強(qiáng)以清除大量的活性氧，維持植物正常生理活動。研究與前人的研究結(jié)果相似，在低溫條件下，各玉米自交系苗期葉片超氧化物歧化酶活性與對照相比均呈上升趨勢，其中C71超氧化物歧化酶活性最高，說明C71的耐低溫性可能較強(qiáng)。

過氧化物酶（POD）是生物界廣泛存在的、在植物體內(nèi)活性較高的一種保護(hù)酶，是酶保護(hù)系統(tǒng)中缺一不可的重要組成部分，它與植物的氧化作用、呼吸作用和生長素在體內(nèi)的化學(xué)作用休戚相關(guān)，對保護(hù)機(jī)體免受活性氧的損害可以起到十分重要的作用[24]。在逆境脅迫下，POD活性升高，清除植物體內(nèi)的活性氧，保護(hù)植物體免受逆境環(huán)境的影響，研究與上述林植芳等[25]的研究結(jié)果相似，在低溫條件下，京33、東46、東91品種與對照相比過氧化物酶活性均呈上升趨勢，其中京33過氧化物酶活性上升幅度最大且最高。

在低溫脅迫下SOD活性增加明顯的自交系則POD活性不敏感，甚至降低，例如C71；而低溫促使POD活性較高的自交系SOD的活性表現(xiàn)比較弱或者沒有明顯變化，從而證明了植物抗低溫過程中保護(hù)酶系統(tǒng)的各種酶是相互協(xié)調(diào)配合起作用，而不是僅僅依靠某個酶的活性變化起到抗低溫的效果。

植物受脅迫后合成親水的脯氨酸和可溶性蛋白來維持植物細(xì)胞膨脹狀態(tài)，因此脯氨酸和可溶性蛋白含量與植物脅迫耐受性密切相關(guān)。郝小琴等對玉米幼苗低溫脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脯氨酸含量逐漸增加[26]，實(shí)驗結(jié)果也驗證了該觀點(diǎn)。在低溫條件下，玉米的生長發(fā)育狀態(tài)與環(huán)境因素的關(guān)系密切，游離脯氨酸含量增加可以保持生物大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，實(shí)驗中6℃低溫處理后C71的游離脯氨酸含量明顯增加，說明其耐低溫性可能較強(qiáng)。

可溶性糖作為光合作用的產(chǎn)物之一，可以合成纖維素組成細(xì)胞壁、轉(zhuǎn)化組成其他有機(jī)物如核苷酸和核酸，分解產(chǎn)物是其他許多有機(jī)物的合成原料，植物為了適應(yīng)低溫、干旱等逆境條件，會主動積累可溶性糖來降低冰點(diǎn)和滲透勢?？扇苄蕴鞘欠€(wěn)定原生質(zhì)體與細(xì)胞膜的重要物質(zhì)[27]，它的增加能夠幫助植物細(xì)胞抵御逆境脅迫，試驗中C71的可溶性糖含量顯著下降，說明C71的耐低溫能力可能較弱。自交系C71與東46出現(xiàn)可溶性糖含量降低的原因可能與其耐寒性較弱有關(guān)，這兩種自交系在6℃低溫處理后受到傷害，難以正常生產(chǎn)可溶性糖從而導(dǎo)致其含量降低。

蛋白質(zhì)是構(gòu)成原生質(zhì)的基礎(chǔ)物質(zhì)，在作物的生長發(fā)育中，細(xì)胞的增長分裂與新細(xì)胞的形成必須有蛋白質(zhì)的參與。玉米葉片中的可溶性蛋白能夠幫助其減弱外界環(huán)境脅迫對玉米的損傷，可溶性蛋白含量增加可以保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并且增加其對外界環(huán)境脅迫的抗性[29]，而實(shí)驗發(fā)現(xiàn)京33自交系的可溶性蛋白含量增加的最為顯著，所以推測京33品種的抗寒性可能較強(qiáng)。

4 結(jié)論

試驗結(jié)果可以得出，自交系東91的鮮重下降幅度最小，PAL活性上升幅度最大，SOD活性和POD活性均呈顯著上升趨勢，比其他品種具有一定的耐低溫優(yōu)勢，自交系東91綜合各項指標(biāo)略優(yōu)于自交系京33，自交系京33綜合各項指標(biāo)優(yōu)于東46、C71，綜合東46各項指標(biāo)除MDA含量比其他3個品種低之外，均沒有明顯優(yōu)勢。基于以上分析得出各品種耐低溫性強(qiáng)弱為東91>京33>C71>東46，該結(jié)果與前期萌芽期低溫脅迫鑒定結(jié)果具有一致性。實(shí)驗初步證明了玉米苗期葉片在低溫脅迫后保護(hù)酶活性和丙二醛含量會有所變化，并會對不良環(huán)境起到一定的抵抗作用，玉米苗期耐低溫性不是某一種酶或代謝產(chǎn)物決定的，是多個生理生化反應(yīng)的綜合表現(xiàn)，選育苗期抗低溫玉米品種是一個復(fù)雜的過程，還需進(jìn)一步探討。