史喜絹，劉原子，張大俊，侯 景，申超超，楊 博，張 婷，袁興國(guó)，任瑞瑞，杜曉華*，張克山*，鄭海學(xué)，劉湘濤

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)感染偶蹄動(dòng)物引起的一種烈性傳染病[1-3]。FMDV是微RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的成員，已知有O、A、C、Asia1和SAT1、SAT2、SAT3 7種血清型，成熟的FMDV粒子無(wú)囊膜，具有二十面體對(duì)稱(chēng)性[4-6]。FMDV全基因組約為8 400 bp，含有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框(ORF)，ORF編碼的多聚蛋白被病毒自身編碼的蛋白酶(L、2A、3C)切割成4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[7-9]。FMDV可利用自身編碼的蛋白進(jìn)化形成抑制或逃避宿主先天性免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)其自身在宿主體內(nèi)的存活和復(fù)制[10]。FMDV前導(dǎo)蛋白酶(LPro)通過(guò)降低IFN-α/β和干擾素刺激因子的早期分泌水平，從而阻止宿主蛋白的合成[11]。FMDV 3A蛋白能抑制病毒觸發(fā)的IFN-β信號(hào)通路，從而逃避宿主免疫反應(yīng)[12]。同樣，宿主也可以識(shí)別病原體并激發(fā)炎癥反應(yīng)來(lái)抑制病毒復(fù)制[13]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一些宿主蛋白在FMDV復(fù)制過(guò)程中起重要作用，如DCTN3與FMDV 3A結(jié)合負(fù)調(diào)控FMDV復(fù)制[14]。

CTSS是半胱氨酸蛋白酶家族中具有內(nèi)切肽酶活性的重要成員，由N端16 aa信號(hào)肽(SP)、前肽和成熟肽331個(gè)氨基酸組成的非活化酶原，其活化需要蛋白酶裂解其N(xiāo)端前肽或由各種因素誘導(dǎo)[15]。CTSS酶活性是其發(fā)揮功能的關(guān)鍵，如棕櫚酸酯抑制組織蛋白酶誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞侵襲從而抗血管生成，部分是通過(guò)抑制CTSL和CTSS活性而起作用的[16]。CTSS的N端有3個(gè)凹槽(S1、S2 和S3)與底物的特異性結(jié)合相關(guān)，這一特性也決定了半胱氨酸蛋白酶抑制劑的特異性；該基因C端有一個(gè)與底物結(jié)合的位點(diǎn)，即S1’，在酶與主要組織相容性復(fù)合體二類(lèi)分子(MHC-Ⅱ)保守區(qū)的特異性結(jié)合中起關(guān)鍵作用[17]。CTSS主要在樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)[18]，其參與細(xì)胞外基質(zhì)、抗血管生成肽和黏附蛋白的降解，促進(jìn)新生血管形成和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[19]。CTSS通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK和JNK1 途徑參與甲基原薯蕷皂苷(methyl protodioscin,MP)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬[20]；通過(guò)激活NF-κB和caspase-3 從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡并增加其化學(xué)敏感性[21]；也可通過(guò)激活CD74調(diào)控趨化因子CCL2的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生影響[22]。目前對(duì)CTSS的研究主要集中在自身免疫性疾病[23]、心血管疾病[24]及腫瘤相關(guān)疾病[25]，目前尚無(wú)有關(guān)病原體方面的報(bào)道。

初乳在抵抗病原感染中具有重要作用[26]。本團(tuán)隊(duì)前期應(yīng)用iTRAQ技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)母豬初乳中CTSS的含量顯著高于常乳，但目前對(duì)宿主CTSS在病原感染中的作用研究較少，宿主CTSS在FMDV感染中的作用及其調(diào)控機(jī)制至今尚不明確。為闡明宿主CTSS在FMDV-O感染過(guò)程中發(fā)揮的作用，本研究探究了FMDV-O感染和宿主CTSS的相互調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)宿主CTSS能夠抑制FMDV-O在PK-15細(xì)胞中復(fù)制，而FMDV-O感染增加了宿主CTSS酶活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CTSS促進(jìn)FMDV-O誘導(dǎo)的抗病毒細(xì)胞因子產(chǎn)生，明確了豬源CTSS抑制FMDV-O復(fù)制的初步原因。本研究結(jié)果為更深層次探究豬源CTSS在FMDV-O觸發(fā)的免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

口蹄疫病毒毒株FMDV O/MYA98/BY/2010、PK-15細(xì)胞和FMDV-O抗體由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫與新發(fā)病流行病學(xué)團(tuán)隊(duì)保存；兔多克隆抗體CTSS購(gòu)于Abcam公司；鼠抗Flag單抗、鼠抗Myc單抗、鼠抗β-actin單抗、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購(gòu)于Thermo Scientific公司。

大腸桿菌DH5α感受態(tài)、LATaqDNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶、RNA抽提試劑Trizol、5×Prime script RT Master Mix、SYBR Permix ExTaqII和蛋白預(yù)染Marker均購(gòu)于寶生物工程大連有限公司； LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Invitrogen公司；Opti-MEM、0.25% EDTA胰酶和胎牛血清(FBS)均購(gòu)于Gibco公司；MEM細(xì)胞培養(yǎng)液和PBS溶液購(gòu)于建順公司；ECL顯色劑購(gòu)于Thermo Scientific公司；NP-40裂解液和PMSF購(gòu)于碧云天公司；織蛋白酶S試劑盒(貨號(hào)ab65306)購(gòu)于艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；CTSS干擾序列由上海吉瑪制藥有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 CTSS真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank公布的CTSS基因序列(XM_021089893.1)設(shè)計(jì)合成CTSS引物，引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ，以pcDNA3.1為載體，構(gòu)建pcDNA3.1-CTSS-Myc真核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切和序列測(cè)定。

1.2.2CTSS基因 RNAi序列設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的CTSS基因序列(XM_021089893.1)設(shè)計(jì)并合成CTSS RNAi序列。分別設(shè)計(jì)了3對(duì)針對(duì)CTSS基因的RNAi序列。

1.2.3 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和病毒感染 將細(xì)胞消化后接種于細(xì)胞板中,待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～90%時(shí)，將質(zhì)粒與Lip2000試劑(DNA∶Lip2000=1 μg∶2 μL) 分別加至Opti-MEM中，混合后靜置15 min，將Opti-MEM混合物直接加至細(xì)胞中，將細(xì)胞放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。用無(wú)血清的MEM清洗細(xì)胞，用無(wú)血清的MEM將FMDV-O稀釋至MOI為1.0時(shí)感染PK-15細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h之后，棄去病毒液，用含2% FBS的MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后12 h收取2份細(xì)胞樣品，一份用于RT-qPCR，分別檢測(cè)CTSS和FMDV-O轉(zhuǎn)錄水平的變化，并以豬源GAPDH作為內(nèi)參；一份用于Western blot，分別檢測(cè)CTSS和FMDV-O蛋白水平的變化，并以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.4 RT-qPCR 收集細(xì)胞樣品，采用Triozl法提取細(xì)胞總RNA，利用合成好的引物進(jìn)行絕對(duì)定量和相對(duì)定量檢測(cè)[1]。相關(guān)定量擴(kuò)增引物信息見(jiàn)表2。

表2 引物序列信息

1.2.5 CTSS酶活性測(cè)定 利用組織蛋白酶S活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)ab65306；Abcam)提供的裂解液裂解細(xì)胞，離心取50 μL上清于96孔板，加等量反應(yīng)緩沖液和10 mmol·L-1Ac-VVR-AFC(CTSS底物),根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理。使用SpectraMax M5熒光計(jì)在400 nm激發(fā)波長(zhǎng)和505 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量熒光。

1.2.6 Western blot 收樣并處理細(xì)胞樣品，加入適量的NP-40裂解液(PMSF 1 mol·L-1)；充分裂解后，12 000 r·min-1離心10 min，取上清加入含β-巰基乙醇的5×SDS Loading Buffer，100 ℃變性10～15 min,按20 μL的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳[1]，最后用高分辨圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行ECL顯影并保存結(jié)果。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，應(yīng)用 GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行分析并作圖，運(yùn)用獨(dú)立樣品T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，*.P<0.05表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**.P<0.01表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異，***.P<0.001表示數(shù)據(jù)間具有極顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 FMDV-O感染PK-15細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)源性CTSS表達(dá)

將PK-15細(xì)胞鋪于35 mm小皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，用MOI為1的FMDV-O感染PK-15細(xì)胞，在0、4、8、12 h后收取細(xì)胞樣品，利用RT-qPCR和Western blot方法檢測(cè)內(nèi)源性CTSS的變化。結(jié)果表明FMDV-O感染PK-15細(xì)胞后內(nèi)源性的CTSS蛋白水平(圖1A)和轉(zhuǎn)錄水平(圖1B)均高于對(duì)照組，提示FMDV-O感染可促進(jìn)宿主細(xì)胞內(nèi)源性CTSS的表達(dá)。

A. Western blot檢測(cè)CTSS蛋白水平的變化；B. RT-qPCR檢測(cè)CTSS轉(zhuǎn)錄水平的變化；*.P<0.05

2.2 CTSS重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)驗(yàn)證

構(gòu)建pcDNA3.1-CTSS-Myc重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定，10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可在1 000 bp處見(jiàn)目的條帶，在5 000 bp 見(jiàn)載體條帶(圖2A)。經(jīng)測(cè)序后進(jìn)一步確定該真核質(zhì)粒構(gòu)建成功。將構(gòu)建的pcDNA3.1-CTSS-Myc以不同的劑量分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，24 h后收取細(xì)胞樣品，處理樣品并進(jìn)行Western blot驗(yàn)證其表達(dá)情況，結(jié)果表明pcDNA3.1-CTSS-Myc重組質(zhì)粒在PK-15細(xì)胞中呈劑量依賴(lài)性表達(dá)(圖2B)。

A. 雙酶切鑒定結(jié)果(M. DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. BamHⅠ和XhoⅠ酶切產(chǎn)物)；B. Western blot驗(yàn)證CTSS蛋白在PK-15細(xì)胞表達(dá)

2.3 FMDV-O感染能上調(diào)CTSS酶活性

轉(zhuǎn)染0.25 μg CTSS重組質(zhì)粒至PK-15細(xì)胞，20 h后用FMDV-O(MOI=1)感染細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不用病毒刺激的Mock組，收取0、2、4、6、8、10、12、14 h 細(xì)胞樣品，裂解細(xì)胞用Fluorometric Method檢測(cè)CTSS酶活性。結(jié)果表明，F(xiàn)MDV-O感染能上調(diào)CTSS酶活性，且隨著FMDV-O感染時(shí)間的增加，CTSS的活性也隨之增加(圖3)。

圖3 FMDV-O感染上調(diào)CTSS酶活性

2.4 過(guò)表達(dá)CTSS能抑制FMDV-O復(fù)制

轉(zhuǎn)染1、2、4 μg pcDNA3.1-CTSS-Myc至PK-15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后用MOI為1的FMDV-O感染細(xì)胞，12 h后收取細(xì)胞樣品，檢測(cè)其對(duì)FMDV-O復(fù)制的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)隨著CTSS表達(dá)量增加(圖4A、C)，F(xiàn)MDV-O復(fù)制水平呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性降低(圖4B、C)。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)CTSS抑制FMDV-O在PK-15細(xì)胞中復(fù)制。

A. RT-qPCR檢測(cè)CTSS轉(zhuǎn)錄水平的變化；B. RT-qPCR檢測(cè)FMDV-O拷貝數(shù)的變化；C. Western blot檢測(cè)CTSS和FMDV-O蛋白水平的變化; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001

2.5 CTSS siRNA干擾序列的篩選及其對(duì)FMDV-O復(fù)制的促進(jìn)作用

為進(jìn)一步確定宿主CTSS對(duì)FMDV-O復(fù)制的影響，針對(duì)CTSS設(shè)計(jì)合成3對(duì)特異性siRNA(表1)，將siRNA-2947、siRNA-3629、siRNA-3458分別轉(zhuǎn)染至PK-15細(xì)胞, 在24和36 h分別收取樣品，用RT-qPCR方法選擇干擾效果最好的序列，結(jié)果顯示編號(hào)siRNA-2947的干擾效果最好(圖5A)。在此試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-2947，以NC siRNA為對(duì)照，36 h后用等量FMDV-O(MOI=1)感染細(xì)胞，12 h后收取細(xì)胞樣品，用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)siRNA-2947對(duì)FMDV復(fù)制的影響，結(jié)果表明siRNA-2947能下調(diào)宿主CTSS的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)FMDV-O在PK-15細(xì)胞中復(fù)制(圖5B、C)。

表1 干擾序列信息

A. RT-qPCR檢測(cè)CTSS轉(zhuǎn)錄水平的變化；B. RT-qPCR檢測(cè)FMDV-O拷貝數(shù)的變化；C. Western blot檢測(cè)CTSS和FMDV-O蛋白水平的變化; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001

2.6 過(guò)表達(dá)CTSS促進(jìn)FMDV-O誘導(dǎo)的宿主抗病毒細(xì)胞因子產(chǎn)生

為明確豬源CTSS抑制FMDV-O復(fù)制的原因，檢測(cè)宿主CTSS是否影響由FMDV-O感染誘導(dǎo)的抗病毒細(xì)胞因子產(chǎn)生。在PK-15細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染CTSS和pcDNA3.1，24 h后感染FMDV-O(MOI=1)，并設(shè)無(wú)FMDV-O感染對(duì)照組，12 h后收集細(xì)胞處理樣品。RT-qPCR結(jié)果顯示，CTSS可促進(jìn)FMDV誘導(dǎo)的IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-4的mRNA水平,說(shuō)明宿主CTSS能激活FMDV-O誘導(dǎo)的宿主抗病毒細(xì)胞因子產(chǎn)生。

*.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001

3 討 論

CTSS是一種溶酶體蛋白酶，主要在抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)，其活性調(diào)節(jié)對(duì)于MHC-Ⅱ信號(hào)傳導(dǎo)及CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)激活非常重要[27]。有研究報(bào)道CTSS活性可以由腸道菌群調(diào)節(jié)，共生體觸發(fā)生理性CTSS活性；病原體引起病理性CTSS活性增加，導(dǎo)致T細(xì)胞活化和增殖[28]。而本研究發(fā)現(xiàn)FMDV-O感染PK-15細(xì)胞可上調(diào)內(nèi)源性CTSS的表達(dá)并增強(qiáng)CTSS活性。

FMDV以其自身優(yōu)勢(shì)拮抗宿主免疫應(yīng)答進(jìn)而達(dá)到成功感染宿主的目的，當(dāng)然其生命周期也受不同宿主因素影響[29-32]。有文獻(xiàn)報(bào)道熱休克蛋白DNAJA3與VP1互作并通過(guò)自噬/溶酶體途徑降解VP1，從而減弱VP1對(duì)IFN-β信號(hào)通路的拮抗作用，最終抑制FMDV復(fù)制[30]。本研究發(fā)現(xiàn)FMDV-O感染PK-15細(xì)胞可上調(diào)內(nèi)源性CTSS的表達(dá)并增強(qiáng)CTSS活性，過(guò)表達(dá)CTSS抑制FMDV-O在PK-15細(xì)胞中復(fù)制，而下調(diào)內(nèi)源性CTSS能促進(jìn)FMDV-O復(fù)制。有報(bào)道稱(chēng)CTSS能使CX3CL1與CX3CR1相互作用，將免疫細(xì)胞募集到炎癥部位增加CX3CL1脫落進(jìn)入間質(zhì)，從而改變自身免疫性淚腺炎和淚腺分泌[33]；干燥綜合征患者淚液中CTSS活性升高可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生[34]；缺乏CTSS會(huì)增加高血壓小鼠線粒體的受損并提高ROS水平和NF-κB活性，從而調(diào)節(jié)心臟炎癥和纖維化[35]。筆者隨后檢測(cè)了CTSS對(duì)抗病毒細(xì)胞因子mRNA水平的影響，RT-qPCR結(jié)果顯示CTSS可促進(jìn)FMDV-O誘導(dǎo)的IL-6、IL-10、IL-4、IFN-α、IFN-β、IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示CTSS可能參與炎癥反應(yīng)。天然殺傷細(xì)胞(NKT)可募集并激活其他先天免疫細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)多種免疫反應(yīng)，以加劇肝的炎癥反應(yīng)，但CTSB和CTSS抑制劑可降低LPS誘導(dǎo)的炎癥過(guò)程中NKT細(xì)胞的活化[36]，進(jìn)一步說(shuō)明CTSS可能與炎癥有關(guān)。FMDV在進(jìn)化過(guò)程中獲得了許多逃避宿主免疫系統(tǒng)的策略[37], 例如FMDV 3A通過(guò)破壞RIG-Ⅰ、MDA5和VISA蛋白的表達(dá)而抑制病毒觸發(fā)的IFN-β信號(hào)通路[12]；FMDV VP3降解JAK1以抑制IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[38]； LPro可以抑制天然免疫下游抗病毒細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而促進(jìn)病毒的復(fù)制[39-41]，本文雖然檢測(cè)了抗病毒細(xì)胞因子的變化，但機(jī)體的免疫系統(tǒng)是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，宿主除了通過(guò)調(diào)控干擾素信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒功能；還可以通過(guò)自噬和凋亡途徑影響病毒復(fù)制，比如PCBP2和FMDV VP0互作可以通過(guò)凋亡途徑促進(jìn)FMDV復(fù)制[42]。這說(shuō)明CTSS促進(jìn)FMDV-O誘導(dǎo)的抗病毒細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可能是宿主CTSS抑制FMDV-O復(fù)制的原因之一，具體詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本研究首次證實(shí)了CTSS在FMDV-O感染過(guò)程中發(fā)揮抗病毒作用的新功能，為宿主 CTSS拮抗FMDV-O感染方面的研究提供了理論依據(jù)，也為下一步探究豬源CTSS在FMDV-O觸發(fā)的免疫應(yīng)答中的作用積累了素材；此外，本研究結(jié)果也提示CTSS可能作為抑制FMDV-O復(fù)制的潛在靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

4 結(jié) 論

FMDV-O感染與宿主CTSS之間具有相互調(diào)控作用，F(xiàn)MDV-O感染PK-15細(xì)胞顯著上調(diào)內(nèi)源CTSS表達(dá)并增強(qiáng)CTSS酶活性；過(guò)表達(dá)CTSS能抑制FMDV-O在PK-15細(xì)胞中復(fù)制，利用特異性siRNA干擾CTSS表達(dá)可以促進(jìn)FMDV-O復(fù)制，并且 CTSS能促進(jìn)FMDV-O誘導(dǎo)的IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-4細(xì)胞因子上調(diào)表達(dá)，明確了CTSS抑制FMDV-O復(fù)制的初步原因，具體機(jī)制將是下一步研究的方向和重點(diǎn)。