曹迷霞 陳奇 楊劍 劉夢(mèng)倩 賈妮娜 韋英益 胡庭俊

摘要：【目的】探究山豆根多糖（SSP）對(duì)豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）感染RAW264.7細(xì)胞增殖活性及炎癥相關(guān)因子的影響，揭示SSP對(duì)PCV2感染免疫細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的調(diào)控作用?！痉椒ā縋CV2體外感染RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型，以不同濃度（25、50、100、200、400、800和1600 μg/mL）SSP進(jìn)行培養(yǎng)處理，然后采用CCK-8和ELISA分別測(cè)定SSP對(duì)PCV2體外感染RAW264.7細(xì)胞增殖活性及炎癥相關(guān)因子（IL-1β、IL-8和MCP-1）分泌水平和胞內(nèi)環(huán)氧合酶-1（COX-1）活性的影響?！窘Y(jié)果】與細(xì)胞對(duì)照組相比，SSP濃度≤400 μg/mL對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性無顯著影響（P>0.05），但SSP濃度達(dá)800和1600 μg/mL時(shí)RAW264.7細(xì)胞增殖活性極顯著降低（P<0.01，下同），且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖活性呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，于培養(yǎng)48 h時(shí)達(dá)最低值。PCV2感染RAW264.7細(xì)胞后其增殖活性極顯著降低，炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-8和MCP-1分泌水平及胞內(nèi)COX-1活性極顯著升高;100～400 μg/mL SSP能極顯著提高PCV2感染RAW264.7細(xì)胞增殖活性，且能有效降低RAW264.7細(xì)胞的IL-1β、IL-8和MCP-1分泌水平及胞內(nèi)COX-1活性。具體表現(xiàn)為：與PCV2模型組相比，100 ?g/mL SSP能顯著降低PCV2感染RAW264.7細(xì)胞的IL-1β和MCP-1分泌水平（P<0.05，下同）;200 ?g/mL SSP能極顯著降低PCV2感染RAW264.7細(xì)胞的MCP-1分泌水平，同時(shí)顯著降低細(xì)胞IL-1β和IL-8的分泌水平及胞內(nèi)COX-1活性;400 ?g/mL SSP能極顯著降低PCV2感染RAW264.7細(xì)胞的IL-1β、IL-8和MCP-1分泌水平及胞內(nèi)COX-1活性?！窘Y(jié)論】SSP對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性無顯著影響，也未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用，且100～400 μg/mL SSP能極顯著提高PCV2感染RAW264.7細(xì)胞增殖活性，并通過調(diào)節(jié)PCV2感染免疫細(xì)胞的炎癥相關(guān)因子水平而發(fā)揮抗炎作用。

關(guān)鍵詞： 豬圓環(huán)病毒Ⅱ型;山豆根多糖;RAW264.7細(xì)胞;增殖活性;炎癥相關(guān)因子

中圖分類號(hào)： S853.74? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）02-0439-09

Abstract：【Objective】This study aimed to investigate the proliferation activity and inflammation-related factors of Sophora subprostrate polysaccharide（SSP） on porcine circovirus Ⅱ（PCV2） infected RAW264.7 cells， and to reveal its regulation on PCV2 infected immune cells inflammation-related factors. 【Method】 Established the inflammatory model of PCV2 infected RAW264.7 cells in vitro， and then cultured with different concentrations（25， 50， 100， 200， 400， 800 and 1600 μg/mL） of SSP. CCK-8 method was used to determine the proliferation activity of RAW264.7 cells and PCV2 infec-ted RAW264.7 cells with SSP at different concentrations. The effect of SSP at different concentrations on inflammation-related factors（IL-1β， IL-8， MCP-1 and COX-1） in PCV2 infected RAW264.7 cells were determined by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）. 【Result】Compared with the cell control group， the results showed that the concentration of SSP≤400 μg/mL had no significant effect on RAW264.7 cell viability（P>0.05）， but SSP concentrations at 800 μg/mL and 1600 μg/mL? extremely significantly decreased the viability of RAW264.7 cells（P<0.01，the same below）. After PCV2 infection， the proliferation activity of RAW264.7 cells was extremely decreased， the secretion levels of inflammatory cytokines IL-1β， IL-8 and MCP-1 and the activity of intracellular COX-1 were extremely increased. 100-400 μg/mL of SSP exttemely increased the viability of PCV2 infected RAW264.7 cells， and the secretion levels of IL-1β， IL-8， MCP-1 and the activity of COX-1 in RAW264.7 cells were decreased compared to PCV2 group. Compared with PCV2 model group， 100 μg/mL of SSP significantly decreased IL-1β and MCP-1 secretion levels in PCV2 infected RAW264.7 cells（P<0.05， the same below）; 200 μg/mL of SSP extremely decreased the secretion level of MCP-1， significantly decreased the secretion levels of? IL-1β and IL-8， and the activity of COX-1 in PCV2 infected RAW264.7 cells; SSP at 400 μg/mL of could extremely reduce the levels of IL-1β， IL-8 and MCP-1 and the activity of COX-1 in PCV2 infected RAW264.7 cells. 【Conclusion】 SSP has no significant effect on the proliferation activity of RAW264.7 cells， and shows no cytotoxicity. 100-400 μg/mL of SSP extremely increases the proliferation activity of PCV2 infected RAW264.7 cells， and play an anti-inflammatory effect via regulating the secretion levels of inflammation-related factors.

Key words： porcine circovirus Ⅱ;? Sophora subprostrate polysaccharide; RAW264.7 cell; proliferation activity; inflammation-related factors

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960715）; Project of Guangxi Graduate Education Innovation（YCBZ2020004）

0 引言

【研究意義】豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus）的成員之一，無囊膜，含有共價(jià)閉合的環(huán)狀單鏈DNA基因組，主要包括PCV I型（PCV1）、PCV II型（PCV2）和PCV III型（PCV3）等基因型（劉國(guó)陽等，2019;張柱青等，2019;蘇芮等，2020）。其中，PCV1對(duì)豬為非致病性，而PCV2和PCV3均對(duì)豬表現(xiàn)出致病性（賀會(huì)利等，2017）。PCV2能引發(fā)一大類免疫抑制性的多系統(tǒng)傳染病，主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)（鄧文芳等，2020）。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是PCV2的靶細(xì)胞，PCV2感染可引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥、皮炎和腎病綜合征、增生性壞死性間質(zhì)性肺炎和繁殖障礙等，是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（Porcine circovirus associated disease，PCVD）的主要病原（方博，2019;沈順新和和玉丹，2020）。山豆根多糖（Sophora subprostrate polysaccharide，SSP）是一種從越南槐（Sophora tonkinensis Gapnep.）根和根莖中經(jīng)干燥后提取獲得的多糖，具有多種生物活性，如抗炎、抗氧化、抗病毒及抗腫瘤等（彭湘君等，2012）。山豆根多糖可通過調(diào)節(jié)一氧化氮（NO）分子水平而影響免疫細(xì)胞內(nèi)的cAMP/cGMP和6-keto-PGF1信號(hào)體系，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫功能（帥學(xué)宏等，2010）。已有研究證實(shí)，山豆多糖通過抑制PCV2的CAP基因復(fù)制而增強(qiáng)免疫功能，達(dá)到抗病毒效果（Sun et al.，2020）。因此，明確SSP對(duì)PCV2感染細(xì)胞增殖活性及其相關(guān)炎癥因子分泌水平的調(diào)節(jié)作用，可為PCVD的綜合防控提供新思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】炎癥是機(jī)體對(duì)致炎因子產(chǎn)生的一種應(yīng)答性反應(yīng)，而炎癥細(xì)胞因子是指參與炎癥反應(yīng)的各類細(xì)胞因子（Yao et al.，2016;Ho et al.，2020）。SSP可調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，緩解炎癥癥狀。Su等（2013）研究表明，SSP可緩解PCV2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激，降低PCV2感染細(xì)胞中活性氧（ROS）和NO生成，抑制過氧化物酶（MPO）活性和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)。路海濱等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，以SSP處理Lewis肺癌小鼠后其血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平均顯著升高，即SSP可通過調(diào)節(jié)血清TNF-α和VEGF水平以緩解炎癥反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤效果。Yang等（2020）探究SSP對(duì)PCV2感染RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)及組蛋白乙?；揎椀挠绊?，發(fā)現(xiàn)SSP通過增加組蛋白去乙?；福℉DAC）活性和HDAC基因表達(dá)，以降低H3和H4的乙?；讲⒓せ頝F-κB/MAPKs/c-Jun信號(hào)通路，即通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)一步抑制炎癥反應(yīng)。此外，陳云等（2014）研究表明，山豆根多糖硫酸酯（sBSRPS）可作為抗Ⅰ型鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus 1，DHV-1）藥物的重要組分。Chen等（2014，2018）、Voronov等（2014）通過對(duì)比分析SSP和sBSRPS對(duì)DHV-1在鴨肝細(xì)胞上復(fù)制及釋放的影響，發(fā)現(xiàn)SSP和sBSRPS均能較好地發(fā)揮體外抗DHV-1作用，且sBSRPS的抗病毒效果更明顯，能有效抑制DHV-1的體外復(fù)制和釋放。何淼等（2020）也研究證實(shí)，SSP和sBSRPS均具有明顯的體外抗DHV-1活性，且sBSRPS的抗病毒效果優(yōu)于SSP，可顯著下調(diào)DHV-1的體外復(fù)制和釋放，即sBSRPS在體外對(duì)DHV-1具有良好的拮抗作用?？梢姡瑂BSRPS具備良好的抗病毒活性，可作為主要成分用于研發(fā)抗病毒新型藥物?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】PCV2作用于細(xì)胞或組織會(huì)促使炎癥細(xì)胞因子上調(diào)表達(dá)，尤其是TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10等細(xì)胞因子，但這些炎癥細(xì)胞因子的分泌時(shí)間段及上調(diào)幅度各不相同，其變化可能是病毒通過刺激炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂，最終促進(jìn)PCV2感染相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展（李?；ǖ?，2016;石坤等，2016;崔貝貝，2017;譚紅連等，2017;張蕾等，2018）。至今尚無研究報(bào)道SSP對(duì)PCV2感染免疫細(xì)胞增殖活性及炎癥相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過建立PCV2體外感染RAW264.7細(xì)胞的炎癥模型，以不同濃度SSP處理后采用CCK-8和ELISA分別測(cè)定SSP對(duì)PCV2體外感染RAW264.7細(xì)胞增殖活性及其炎癥相關(guān)因子（IL-1β、IL-8和MCP-1）分泌水平和胞內(nèi)環(huán)氧合酶-1（COX-1）活性的影響，旨在揭示SSP對(duì)PCV2感染免疫細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

PCV2（SH株）為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室分離獲得，后經(jīng)本課題組采用豬腎細(xì)胞系（PK-15細(xì)胞）增殖保存;RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù);SSP由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取獲得;脂多糖（LPS）購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑包括DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco）、胎牛血清（Gibco）、青鏈霉素混合液（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）、蛋白酶K[生工生物工程（上海）股份有限公司]、飽和酚（上海索萊寶生物科技有限公司）、CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;LA Taq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司;小鼠IL-1β（Lot.M191008-001a）、IL-8（Lot.M191008-104a）、MCP-1（Lot.M191008-113a）和COX-1（Lot.M191008-135a）等ELISA試劑盒購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司。

1. 2 RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇傳代與培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后用含10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)液稀釋并移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待瓶底細(xì)胞貼壁融合至70%～80%后進(jìn)行傳代，連續(xù)穩(wěn)定傳代3次后即可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1. 3 PCV2增殖及鑒定

將RAW264.7細(xì)胞稀釋至5×104個(gè)/mL，按100 μL/孔添加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將-80 ℃保存的PCV2接種至RAW264.7細(xì)胞，2 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3次后加入含5% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融3次后5000 r/min離心5 min，提取DNA。采用PCR檢測(cè)病毒核酸，根據(jù)GenBank已公布PCV2的ORF-2基因設(shè)計(jì)引物（F：5'-CACTTCTTTCGTTTTC AG-3'和R：5'-TTTATCACTTCGTAATGGT-3'），并委托深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：Ex Taq DNA聚合酶12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 40 s，55.5 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1. 4 CCK-8測(cè)定SSP對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

將RAW264.7細(xì)胞稀釋至5×104個(gè)/mL，按100 μL/孔添加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其貼壁長(zhǎng)成單層細(xì)胞融合至70%。如表1所示，分別設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、LPS陽性對(duì)照組及不同濃度藥物組，其中，細(xì)胞對(duì)照組只加入10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)液，LPS陽性對(duì)照組加入終濃度為1 μg/mL的LPS（以10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)液稀釋），不同濃度藥物組加入終濃度分別為25、50、100、200、400、800和1600 μg/mL的SSP（以10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)液稀釋），每組4個(gè)重復(fù)孔，進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48和72 h后，每孔分別加入10.0 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育4 h，于450 nm處測(cè)定吸光值。

1. 5 CCK-8測(cè)定SSP對(duì)PCV2感染RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

根據(jù)1.4的試驗(yàn)結(jié)果，篩選出SSP濃度25、50、100、200和400 μg/mL作為后續(xù)試驗(yàn)劑量。RAW264.7細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，調(diào)整其細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，按100 μL/孔添加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜使其貼壁融合至70%。分別設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、PCV2模型組及不同濃度藥物組（表2），每組4個(gè)重復(fù)，進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)。PCV2模型組和不同濃度藥物組先用103 TCID50 PCV2懸液孵育感染2 h，棄病毒懸液后以PBS洗滌3次，再加入終濃度分別為25、50、100、200和400 μg/mL的SSP，細(xì)胞對(duì)照組和PCV2模型組加入10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于培養(yǎng)12、24、48和72 h后，各處理組每孔分別加入10.0 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育4 h，于450 nm處測(cè)定吸光值。

1. 6 SSP對(duì)PCV2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)因子分泌水平的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，添加至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，1000 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待其貼壁后進(jìn)行試驗(yàn)處理，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、LPS陽性對(duì)照組、PCV2模型組及不同濃度（100、200和400 ?g/mL）藥物組（表3），每組3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)。細(xì)胞對(duì)照組加入500 ?L DMEM培養(yǎng)液，LPS對(duì)照組加入500 ?L終濃度為1 ?g/mL的LPS， PCV2模型組和不同濃度藥物組加入500 ?L的103 TCID50 PCV2懸液感染孵育2 h，棄病毒懸液，PBS洗3次;不同濃度藥物組分別加入1000 μL含不同終濃度（100、200和400 ?g/mL）SSP的10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)液，細(xì)胞對(duì)照組、LPS陽性對(duì)照組和PCV2模型組則加入1000 μL的10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)液。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液置于1.5 mL滅菌EP管中，4 ℃下1500 r/min離心5 min，收集上清液，按ELISA試劑盒說明進(jìn)行IL-1β、IL-8、MCP-1和COX-1測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PCV2在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的增殖鑒定結(jié)果

RAW264.7細(xì)胞接種PCV2后，反復(fù)凍融裂解RAW264.7細(xì)胞，釋放病毒，提取病毒DNA，檢測(cè)所提取DNA在260 nm和280 nm處的吸光值，得知A260/A280比值為1.81，表明提取獲得的病毒DNA不存在蛋白質(zhì)污染，純度較高。以病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到單一明亮的目的條帶（圖1），擴(kuò)增片段大?。?154 bp）與預(yù)期結(jié)果相符，即RAW264.7細(xì)胞成功感染PCV2。

2. 2 SSP對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

采用CCK-8檢測(cè)SSP對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果（表4）顯示，LPS處理RAW264.7細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的增殖活性均高于細(xì)胞對(duì)照組，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，以培養(yǎng)24 h時(shí)的細(xì)胞增殖活性最高，與細(xì)胞對(duì)照組間存在極顯著差異（P<0.01，下同）。SSP濃度≤400 μg/mL時(shí)，在各時(shí)間點(diǎn)的RAW264.7細(xì)胞增殖活性均無顯著差異（P>0.05，下同）;但SSP濃度達(dá)800和1600 μg/mL時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)的RAW264.7細(xì)胞增殖活性極顯著低于細(xì)胞對(duì)照組，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖活性呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，于培養(yǎng)48 h時(shí)達(dá)最低值。因此，在后續(xù)研究中SSP使用濃度不宜超過400 μg/mL。

2. 3 SSP對(duì)PCV2感染RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

由表5可知，PCV2感染RAW264.7細(xì)胞后，其增殖活性極顯著降低，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖活性整體上呈逐漸降低趨勢(shì)，于培養(yǎng)72 h時(shí)降至最低值。以25～50 μg/mL SSP培養(yǎng)PRV2感染RAW264.7細(xì)胞能有效提高細(xì)胞增殖活性，且培養(yǎng)72 h的細(xì)胞增殖活性極顯著高于PCV2模型組;以100～400 μg/mL SSP培養(yǎng)PRV2感染RAW264.7細(xì)胞能極顯著提高細(xì)胞增殖活性，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其細(xì)胞增殖活性越高，故選擇100～400 ?g/mL SSP進(jìn)行后續(xù)研究。

2. 4 SSP對(duì)PCV2感染RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)因子分泌水平的影響

由表6可知，PCV2感染RAW264.7細(xì)胞后，其細(xì)胞IL-1β、IL-8和MCP-1分泌水平及胞內(nèi)COX-1活性均極顯著升高。與PCV2模型組相比，100 ?g/mL SSP能顯著降低PCV2感染RAW264.7細(xì)胞的IL-1β和MCP-1分泌水平（P<0.05，下同）;200 ?g/mL SSP能極顯著降低PCV2感染RAW264.7細(xì)胞的MCP-1分泌水平，同時(shí)顯著降低細(xì)胞IL-1β和IL-8的分泌水平及胞內(nèi)COX-1活性;400 ?g/mL SSP能極顯著降低PCV2感染RAW264.7細(xì)胞的IL-1β、IL-8和MCP-1分泌水平及胞內(nèi)COX-1活性。表明100～400 ?g/mL的SSP能通過降低PCV2感染RAW264.7細(xì)胞的IL-1β、IL-8和MCP-1分泌水平及胞內(nèi)COX-1活性，以緩解病毒引起的炎癥反應(yīng)。

3 討論

山豆根化學(xué)成分含量豐富，藥用價(jià)值高。SSP是山豆根的主要活性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗癌、抗病毒及抗氧化等多種生物活性（Cheng et al.，2013;Ji et al.，2014）。本研究通過測(cè)定SSP對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響，以明確SSP對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞毒性影響的濃度范圍，從而篩選出SSP對(duì)PCV2感染RAW264.7細(xì)胞增殖活性影響的最適宜濃度，進(jìn)一步揭示SSP的抗炎作用，結(jié)果顯示，在25～400 ?g/mL濃度范圍內(nèi)SSP對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性無顯著影響，也未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用，但SSP濃度為800～1600 ?g/mL時(shí)極顯著抑制RAW264.7細(xì)胞增殖活性，與Gan等（2018）的研究結(jié)果相似，即1.78～35.60 μmol/L SSP對(duì)雞胚肝細(xì)胞無細(xì)胞毒性，且對(duì)黃曲霉毒素誘導(dǎo)的雞胚肝細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。

炎癥是動(dòng)物機(jī)體對(duì)各種致炎因素引起損傷產(chǎn)生的防御性反應(yīng)，而炎癥相關(guān)因子在炎癥過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如IL-1β、IL-6、IL-8、COX-1和MCP-1等可促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集、活化及炎癥介質(zhì)釋放（Kandalam and Clark，2010;Yin et al.，2018;Xiao et al.，2020）。IL-1β是一種重要的促炎因子，在細(xì)胞免疫中扮演重要角色，能與TNF-α產(chǎn)生相互協(xié)同作用，通過激活靶細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路而參與炎癥反應(yīng)，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用（Wulster-Radcliffe et al.，2004;Li et al.，2020）;MCP-1是炎癥反應(yīng)的促發(fā)劑，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集，且具有多種生物活性，包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、刺激免疫應(yīng)答及參與炎癥反應(yīng)等（Ou et al.，2020;Weber et al.，2020）;IL-8在免疫應(yīng)答的全過程中發(fā)揮重要作用，能吸引炎癥細(xì)胞進(jìn)入組織部位，激活巨噬細(xì)胞及增強(qiáng)其殺傷活性（Mohamed et al.，2020）;COX-1與炎癥發(fā)生密切相關(guān)，受致炎因素刺激后，可分泌前列腺素（PGE2），活化小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而釋放促炎介質(zhì)IL-1、IL-6、TNF6、NO及PG等參與炎癥反應(yīng)（Liedtke et al.，2012）。已有研究表明，PCV2感染免疫細(xì)胞可導(dǎo)致炎癥相關(guān)因子的表達(dá)發(fā)生改變，尤其是IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α和免疫調(diào)節(jié)因子IFN-γ（Borghetti et al.，2013）。汪偉等（2016）對(duì)PCV2體外感染3D4/21細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，PCV2感染對(duì)炎癥相關(guān)因子IL-1β和IL-8的表達(dá)起促進(jìn)作用。在本研究中，采用103 TCID50的PCV2感染RAW264.7細(xì)胞后，其細(xì)胞IL-1β、IL-8和MCP-1分泌水平及胞內(nèi)COX-1活性均極顯著升高，說明PCV2能刺激RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥相關(guān)因子，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，即PCV2感染誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建成功。

近年來，有關(guān)中藥活性多糖對(duì)免疫細(xì)胞炎癥相關(guān)因子分泌的調(diào)節(jié)作用研究逐漸增多。李勝亮等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10 mg/L LPS刺激后肺血管內(nèi)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6和IL-8增多;仲芳等（2009）研究表明，姜黃素可下調(diào)LPS誘導(dǎo)人類腎小管近端上皮細(xì)胞MCP-1和IL-8的分泌;陳瀟等（2012）在研究靈芝多糖對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防與治療作用機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，其高劑量組的血清TNF-α分泌水平較模型組顯著降低，表明靈芝多糖可有效抑制炎癥相關(guān)因子的分泌;王松等（2012）研究顯示，復(fù)方甘草酸苷可明顯降低LPS誘發(fā)RAW264.7細(xì)胞生成促炎因子NO、TNF-α、IL-1β和IL-6，并促進(jìn)抗炎因子IL-10表達(dá);Liu等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，酸棗多糖對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝毒性損傷有顯著治療作用;Xue等（2015）研究表明，黃芪多糖可通過抑制氧化應(yīng)激和阻斷NF-κB途徑來抑制PCV2復(fù)制。本研究結(jié)果顯示，PCV2感染RAW264.7細(xì)胞后極顯著提高其IL-1β、IL-8和MCP-1分泌水平及胞內(nèi)COX-1活性，而100～400 ?g/mL SSP能顯著或極顯著降低PCV2感染RAW264.7細(xì)胞IL-1β、IL-8、MCP-1分泌水平及胞內(nèi)COX-1活性，與Sun等（2020）的研究結(jié)果相似?？梢姡琒SP是通過調(diào)節(jié)PCV2感染免疫細(xì)胞的炎癥相關(guān)因子水平而發(fā)揮抗炎作用。

4 結(jié)論

SSP對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性無顯著影響，也未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用，且100～400 μg/mL SSP能顯著提高PCV2感染RAW264.7細(xì)胞增殖活性，并通過調(diào)節(jié)PCV2感染免疫細(xì)胞的炎癥相關(guān)因子水平而發(fā)揮抗炎作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）