施文廣 梁金虎 馮美茹 李佳琪 黃李坤 張雪慧 鄧祖軍

摘要：【目的】分析藥源植物檀香紫檀內(nèi)生真菌多樣性及其代謝產(chǎn)物抗菌活性，為尋找新型抗菌活性物質(zhì)提供參考。【方法】從廣東藥科大學(xué)中藥園采集3株健康檀香紫檀的根、莖、葉組織樣品，采用組織分離法分離其內(nèi)生真菌;結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)檀香紫檀內(nèi)生真菌進(jìn)行分類(lèi)和鑒定;分別采用紙片擴(kuò)散法和菌絲生長(zhǎng)速率法研究代表性內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC44102、痢疾桿菌（Shigella dysenteriae）CMCC51252、傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）CMCC50115、白色念珠菌（C. albicans）ATCC10231和黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC98003的抗菌活性?！窘Y(jié)果】從450塊檀香紫檀組織中共分離到337株內(nèi)生真菌，其中來(lái)自葉172株、莖66株、根99株，隸屬15個(gè)屬。葉部?jī)?nèi)生真菌的相對(duì)分離率和定殖率最高，均為79.63%;葉部、根部和莖部的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)分別為1.02、0.93和0.64，三者間差異顯著（P<0.05）。木霉屬（Trichoderma sp.）為根部?jī)?yōu)勢(shì)屬，相對(duì)分離率為28.28%;青霉屬（Penicillium sp.）為莖部和葉部的優(yōu)勢(shì)屬，相對(duì)分離率分別為46.97%和52.91%。45株代表性內(nèi)生真菌發(fā)酵液抗菌活性測(cè)定結(jié)果顯示，有16株內(nèi)生真菌（35.56%）對(duì)金黃色葡萄球菌、傷寒沙門(mén)氏菌、大腸埃希菌和痢疾桿菌具有抑菌活性;36株（80.00%）對(duì)白色念珠菌和黑曲霉具有抑菌活性;有15株（33.33%）對(duì)6種測(cè)試細(xì)菌和真菌均具抑制活性，其中菌株L9（Colletotrichum sp.）代謝產(chǎn)物的抗菌活性最好，對(duì)黑曲霉抑制活性達(dá)67.35%，對(duì)其余5種測(cè)試菌的抑菌圈直徑均大于10 mm?！窘Y(jié)論】檀香紫檀內(nèi)生真菌類(lèi)群分布具有一定的器官組織特異性，物種多樣性較豐富，且蘊(yùn)含有較高比例的抗細(xì)菌和抗真菌活性菌株，可為新型抗菌活性物質(zhì)的篩選與開(kāi)發(fā)提供菌株資源。

關(guān)鍵詞： 檀香紫檀;內(nèi)生真菌;生物多樣性;抗菌活性

中圖分類(lèi)號(hào)： S792.29;S182? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）02-0538-09

Abstract：【Objective】The aim of this study was to investigate the biological diversity and antimicrobial activities of endophytic fungi of Pterocarpus santanilus，providing reference for new antimicrobial active substances. 【Method】Samples of roots， stems and leaves of three healthy P. santanilus plants were collected from the Chinese Medicine Garden of Guangdong Pharmaceutical University in Guangzhou. The endophytic fungi of P. santanilus were isolated by tissue block isolation method and were identified by morphological and molecular biological methods. The antimicrobial activities of endophytic fungi fermentation broth against Staphylococcus aureus CMCC26003， Escherichia coli CMCC44102， Shigella dysenteriae CMCC51252，Salmonella typhimurium CMCC50115，Candida albicans ATCC10231 and Aspergillus niger CMCC98003 were studied by the paper disk diffusion method and mycelium growth rate method respectively. 【Result】A total of 337 endophytic fungi were isolated from 450 P. santanilus tissues（172 in leaves， 66 in stems and 99 in roots）， belonging to 15 genera. The relative isolation rate and colonization rate of endophytic fungi in leaves were the highest， they were both 79.63%. The diversity index of endophytic fungi in leaves， stems and roots were 1.02， 0.93 and 0.64 respectively， and there was significant difference among them（P<0.05）. Trichoderma sp. genus was the dominant genus in root， and the relative isolation rate was 28.28%. Penicillium sp. genus was the dominant endophytic fungi genus of stems and leaves， and the relative isolation rates were 46.97% and 52.91% respectively. The results of the antimicrobial activities of the 45 endophytic fungi fermentation broth from P. santanilus showed that 16 strains（35.56%） had the antibacterial activity against E. coli CMCC44102， S. aureus CMCC26003， S. typhimurium CMCC50115 and S. dysenteriae CMCC51252; 36 strains（80.00%） showed the inhibition activity against C.albicans ATCC10231and A.niger CMCC98003.? And 15 strains（33.33%） could inhibit the growth of all the six pathogens. L9（Colletotrichum sp.） showed the best antimicrobial activities. It had an inhibitory activity of 67.35% against A. niger CMCC98003 and the diameter of inhibition zones against the other five pathogens were all more than 10 mm.【Conclusion】Theendophytic fungi communityin P. santanilus istissue specific， and the species diversity of P. santanilus endophytic fungi is rich， and there is a high proportion of endophytic fungi with good antibacterial and antifungal activities. The endophytic fungi of P. santanilus provide strain resources for screening and development of new antimicrobial active substances.

Key words： Pterocarpus santanilus; endophytic fungi; bio-diversity; antimicrobial activities

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31971384）

0 引言

【研究意義】藥用植物是抗菌藥物的重要來(lái)源，但許多藥用植物生長(zhǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng)，人工栽培推廣較慢，產(chǎn)量低，資源供應(yīng)較緊缺（沈徐婷和丁志山，2018;趙小惠等，2019），單純從藥用植物體提取和開(kāi)發(fā)藥用活性成分已很難滿足人類(lèi)的需求（呂婉婉等，2018）。同時(shí)，隨著微生物耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重和超級(jí)細(xì)菌的頻繁出現(xiàn)（李昕等，2020），已有抗菌藥物也已不能完全滿足臨床抗菌治療的需求。因此，尋找藥用植物的替代資源以及開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物顯得尤為迫切，對(duì)于緩解植物藥來(lái)源匱乏，豐富臨床抗菌藥物庫(kù)具有重要意義。檀香紫檀（Pterocarpus santanilus Linn. f.）為蝶形花科（Papilionaceae）紫檀屬（Pterocarpus）木本植物，在熱帶原始森林自然分布（Arunkumar and Joshi，2014）。檀香紫檀除作為名貴木材在家具和工藝品方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值外，還具有較高的藥用價(jià)值。檀香紫檀的心材、樹(shù)皮、種子和葉片提取物被發(fā)現(xiàn)具有多種藥理活性（Bulle et al.，2016a;Donga et al.，2017;陳仁利和曾杰，2018; Akhouri et al.，2020），主要應(yīng)用于護(hù)肝及口腔疾病、皮膚病、神經(jīng)過(guò)敏等疾病的治療（Bulle et al.，2016b）。檀香紫檀作為一種具有廣泛藥理活性的藥源植物，市場(chǎng)需求量大，但檀香紫檀被過(guò)度砍伐，目前其野生資源已近枯竭，市場(chǎng)供應(yīng)極為緊缺（Arunkumar and Joshi，2014;Teixeira da Silva et al.，2019）。因此，尋找可行的替代資源以解決檀香紫檀資源緊缺問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)其藥用資源的充分挖掘和利用已成為檀香紫檀產(chǎn)業(yè)面臨的一個(gè)重要課題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】藥用植物內(nèi)生真菌已成為天然活性代謝產(chǎn)物的一個(gè)重要資源庫(kù)，而且相對(duì)于藥用植物，內(nèi)生真菌更易繁殖，因而內(nèi)生真菌為解決藥用植物資源緊缺，全面挖掘和利用其蘊(yùn)含的藥用資源提供了新思路（羅利瓊等，2016;郭順星，2018）。植物內(nèi)生真菌作為一類(lèi)長(zhǎng)期生活在宿主體內(nèi)的共生真菌，一般情況下不會(huì)導(dǎo)致宿主出現(xiàn)明顯病害癥狀（Deng et al.，2014;顏楨靈等，2019）。藥用植物內(nèi)生真菌生境較特殊，且與宿主植物存在緊密的共生關(guān)系，大量研究表明藥用植物內(nèi)生真菌不僅普遍存在與宿主植物類(lèi)似的生理活性的次生代謝產(chǎn)物，還蘊(yùn)含著大量的具有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)和廣泛生理活性的次生代謝產(chǎn)物（楊鼎超等，2017;Venieraki et al.，2017;張曉云等，2020;Mangan-yi and Ateba，2020）。Martínez-Luis等（2012）從紫茉莉（Guapira standleyana）葉中的內(nèi)生真菌Aspergillus sp. strain F1544中分離到5種具有抗寄生蟲(chóng)活性的化合物（Pseurotin A、14-norpseurotin A、FD-838、Pseurotin D、Fumoquinone B）;Uzor等（2016）發(fā)現(xiàn)從藥用植物法氏花椒（Fagara zanthoxyloides）葉中分離到的內(nèi)生真菌茶擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis thea）可產(chǎn)生對(duì)呼吸道合胞病毒增殖具有顯著抑制活性的氯異硫氰酸（Chloroisosulochrin）;Prihantini和Tachibana（2017）發(fā)現(xiàn)從藥用植物杜英（Elaeocarpus chinensis）的內(nèi)生真菌Pseudocercospora sp. ESL 02中分離到的土曲霉酸（Terreic acid）和6-甲基水楊酸（6-methylsalicylic acid）具有很強(qiáng)的抗氧化活性，其DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）自由基清除活性半抑制濃度（IC50）分別高達(dá)0.22和3.87 mmol/L;Kornsakulkarn等（2018）從藥用植物南酸棗[Choerospondias axillaris（Roxb.） Burtt. et Hill]的黑孢霉屬（Nigrospora sp.）內(nèi)生真菌Nigrospora sp. BCC 47789代謝產(chǎn)物中分離到一種對(duì)口腔表皮樣癌細(xì)胞（KB）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和人肺癌細(xì)胞（NCI-H187）均具細(xì)胞毒性的新的氫蒽醌（Nigrosporone A）;Venkateswarulu等（2018）發(fā)現(xiàn)分離自藥用植物欖仁果（Terminalia pallida）的內(nèi)生真菌Cladosporium delicatulum產(chǎn)生的白花丹素（5-hydroxyl-2-methylnaptalene-1，4-dione）具有很強(qiáng)的抗真菌活性，其對(duì)白色念珠菌（Candida albicans）、熱帶念珠菌（C. tropicalis）、稻小核菌（Sclerotium oryzae）和串珠鐮孢菌（Fusarium moniliforme）的最小抑菌濃度（MIC）均不高于12.5 mg/mL;Manganyi等（2019）發(fā)現(xiàn)南非傳統(tǒng)藥用植物Sceletium tortuosum L.內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）GG 008的發(fā)酵液對(duì)蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC 10876表現(xiàn)出明顯的抑菌活性。目前，藥用植物檀香的提取物也已發(fā)現(xiàn)具有多種藥理活性，Wu等（2011）從檀香紫檀心材分離到對(duì)人類(lèi)中性粒細(xì)胞分泌彈性蛋白酶具有抑制活性的新的菲二酮（Pterolinus K）和查爾酮（Pterolinus L）;Bulle等（2016a）發(fā)現(xiàn)檀香紫檀心材的甲醇提取物可通過(guò)降低脂質(zhì)過(guò)氧化的速率，增強(qiáng)抗氧化防御機(jī)制來(lái)減輕小鼠酒精誘發(fā)的肝損傷，顯示出較好的護(hù)肝作用;Li等（2018）從檀香紫檀心材提取物中分離到3種新型的倍半萜烯（Canusesnol L、12，15-dihydroxycurcumene和Canusesnol K）;Akhouri等（2020）發(fā)現(xiàn)檀香紫檀種子提取物可抑制由DMBA[7，12-dimethylbenz（α）-anthracene]誘導(dǎo)的乳腺癌在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，研究者們已陸續(xù)對(duì)多種藥用植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，但仍有大量藥用植物的內(nèi)生真菌資源有待研究和開(kāi)發(fā)（武艷霜等，2019）。檀香紫檀作為一類(lèi)資源緊缺的重要藥源植物，關(guān)于其內(nèi)生真菌生物多樣性及活性物質(zhì)的研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用組織分離法從檀香紫檀的根、莖和葉等部位分離內(nèi)生真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和基于ITS-rDNA序列分析方法對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定，闡明檀香紫檀各部位內(nèi)生真菌的類(lèi)群結(jié)構(gòu)和生物多樣性特征，為檀香紫檀內(nèi)生真菌藥用資源的挖掘和利用提供前期基礎(chǔ);同時(shí)，通過(guò)紙片擴(kuò)散法和菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)一步分析檀香紫檀內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抗細(xì)菌和抗真菌活性，篩選出具有優(yōu)良抗菌活性的內(nèi)生真菌菌株，為抗菌活性物質(zhì)提供資源庫(kù)，也為解決檀香紫檀資源緊缺、充分利用其藥用資源供新思路。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試藥用植物 供試3株檀香紫檀（Pterocarpus santanilus Linn. f.）2年生，株高約0.5 m、樹(shù)干直徑約2 cm，于2019年7月采自廣東藥科大學(xué)中藥園（東經(jīng)113°24′31.8″，北緯23°03′31.9″）。3株檀香紫檀用無(wú)菌袋包裝，4 ℃低溫保存于廣東藥科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)系研究室。用無(wú)菌剪刀從檀香紫檀剪出450塊大小均一的植物組織用于分離內(nèi)生真菌，其中根部組織138塊、莖部組織96塊、葉部組織216塊。

1. 1. 2 供試病原菌 供試細(xì)菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC44102、痢疾桿菌（Shigella dysenteriae）CMCC51252、傷寒沙門(mén)氏菌（Salmone-lla typhimurium）CMCC50115;供試真菌：白色念珠菌（C. albicans）ATCC10231、 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC98003。以上菌株均由廣東藥科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)研究室提供。

1. 1. 3 供試試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）和營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖固體（PDA）和液體（PDB）培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）;真菌DNA提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司），PCR預(yù)混液（含Taq DNA聚合酶）、引物（ITS1F：5'-CT TGGTCATTTAGAGAAGTAA-3'，ITS4：5'-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3'）和DNA Marker[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 內(nèi)生真菌的分離與純化 檀香紫檀內(nèi)生真菌分離和純化參考Cao等（2002）的方法。

1. 2. 2 內(nèi)生真菌鑒定 真菌用載玻片培養(yǎng)法（Cao et al.，2002）培養(yǎng)后，光學(xué)顯微鏡下對(duì)其菌絲、孢子和子實(shí)體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，分類(lèi)鑒定依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》（魏景超，1979）。內(nèi)生真菌的分子鑒定參考Deng等（2014）的方法進(jìn)行，具體步驟：使用真菌DNA提取試劑盒抽提內(nèi)生真菌總DNA，利用引物ITS1F和ITS4 PCR擴(kuò)增其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（Internal transcribed spacer，ITS）。PCR反應(yīng)體系25.0 μL： 2×Pro Taq Master Mix（dye plus）12.5 μL，1.0 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 min，72 ℃ 90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。ITS-rDNA序列的測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)。選取與高相似性序列同屬不同種的模式菌株序列作為參考序列，并選取與待測(cè)菌株親緣關(guān)系適中的同科不同屬序列作為外類(lèi)群，利用MEGA 7.0采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 2. 3 內(nèi)生真菌抗菌活性篩選 從分離獲得的內(nèi)生真菌中挑選不同菌屬的代表性菌株用于抗菌活性篩選。在含100 mL PDB液體培養(yǎng)基的300 mL錐形瓶中接入活化好的內(nèi)生真菌，28 ℃、160 r/min液體發(fā)酵5～7 d。發(fā)酵液先經(jīng)8層滅菌紗布過(guò)濾收集，再12000 r/min離心5 min冷凍離心，上清液用0.22 ?m微孔濾膜過(guò)濾，得到的無(wú)菌發(fā)酵液于4 ℃保存?zhèn)溆?。檀香紫檀?nèi)生真菌發(fā)酵液抗菌活性（細(xì)菌和白色念珠菌）檢查采用紙片擴(kuò)散法（張麗等，2019）;參考Li等（2018）采用菌絲生長(zhǎng)抑制法分析內(nèi)生真菌對(duì)黑曲霉的抑制效果。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

檀香紫檀內(nèi)生真菌的定殖率（CR）、分離率（IF）、相對(duì)分離頻率（RF）、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H'）、均勻度指數(shù)（E）和相似性指數(shù)（Cs）參考劉軍等（2018）的方法進(jìn)行計(jì)算和分析。檀香紫檀根、莖和葉的定殖率、分離率和多樣性指數(shù)比較采用Duncans多重比較法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 檀香紫檀內(nèi)生真菌分離率和定殖率分析

從450塊檀香紫檀組織中共分離到337株內(nèi)生真菌，其中來(lái)自葉172株、莖66株、根99株（表1） 。檀香紫檀內(nèi)生真菌總分離率和定殖率均為74.89%;內(nèi)生真菌在檀香紫檀各部位的定殖率和分離率排序?yàn)槿~（79.63%和79.63%）>根（71.74%和71.74%）>莖（68.75%和68.75%），各部位內(nèi)生真菌的定殖率與分離率變化規(guī)律相同。

2. 2 檀香紫檀內(nèi)生真菌的類(lèi)群組成分析

結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS-rDNA序列分析對(duì)337株內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果（表2）表明，337株內(nèi)生真菌隸屬于15個(gè)屬，優(yōu)勢(shì)屬為青霉屬（Penicillium，占40.95%）和炭疽屬（Collectorichum，占18.40%）。檀香紫檀各部位的內(nèi)生真菌類(lèi)群分布存在較大差異，其中，根部共分離到9個(gè)屬的內(nèi)生真菌，木霉屬（Trichoderma，占28.28%）為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群;莖部和葉部各分離到10個(gè)屬和6個(gè)屬的內(nèi)生真菌，優(yōu)勢(shì)類(lèi)群均為青霉屬，分別占莖部和葉部?jī)?nèi)生真菌數(shù)的46.97%和52.91%。在檀香紫檀分離到的15個(gè)屬中，根、莖和葉3個(gè)部位均存在炭疽屬、間座殼屬（Diaporthe）、青霉屬和擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）4個(gè)屬;木霉屬分布在根和莖2個(gè)部位，鏈格孢屬（Alternaria）分布在莖和葉2個(gè)部位;Barssia、鐮孢霉屬（Fusarium）、Gliocladiopsis和毛色二孢屬（Lasiodiplodia）4個(gè)屬只分布在根部，殼多孢屬（Stagonospora）、擬青霉屬（Purpureocillium）、擬盾殼霉屬（Paraconiothyrium）和Setophaeosphaeria 4個(gè)屬只分布在莖部，而曲霉屬（Aspergillus）只分布在葉部。

2. 3 檀香紫檀不同部位內(nèi)生真菌多樣性和相似性分析

檀香紫檀內(nèi)生真菌總體生物多樣性指數(shù)為1.90，各部位內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)依次為葉（1.02）>根（0.93）>莖（0.64），各部位內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)差異顯著（P<0.05，下同）;各部位內(nèi)生真菌均勻度指數(shù)依次為葉（0.57）>根（0.42）>莖（0.28），各部位內(nèi)生真菌均勻度指數(shù)差異顯著（表3）。

根據(jù)Jaccard相似性系數(shù)原理，當(dāng)相似性指數(shù)介于0.00～0.25時(shí)為極不相似，0.25～0.50為中等不相似，0.50～0.75為中等程度相似，0.75～1.00為極為相似。從表3可看出，莖與葉、根與莖和根與葉的內(nèi)生真菌類(lèi)群結(jié)構(gòu)均為中等程度相似，相似性指數(shù)分別為0.63、0.53和0.53。

2. 4 檀香紫檀內(nèi)生真菌對(duì)病原細(xì)菌和病原真菌的抑菌活性

從337株內(nèi)生真菌中挑選不同菌屬的45株代表性菌株進(jìn)行抗菌活性測(cè)定。結(jié)果（表4）顯示，有16株（占35.56%）內(nèi)生真菌對(duì)金黃色葡萄球菌、傷寒沙門(mén)氏菌、大腸埃希菌和痢疾桿菌4種測(cè)試細(xì)菌具有抑菌活性，36株（占80.00%）內(nèi)生真菌對(duì)白色念珠菌和黑曲霉2種測(cè)試真菌具有抑菌活性，有15株（占33.33%）內(nèi)生真菌對(duì)6種測(cè)試病原菌表現(xiàn)出抑制活性，分別為L(zhǎng)2（青霉菌Penicillium sp.）、L3（炭疽菌Collectorichum sp.）、L6（鏈格孢菌Alternaria sp.）、L9（炭疽菌Collectorichum sp.）、L10（炭疽菌Collectorichum sp.）、L11（曲霉菌Aspergillus sp.）、L14（曲霉菌Aspergillus sp.）、S5（炭疽菌Collectorichum sp.）、R2（Gliocla-diopsis sp.）、R3（炭疽菌Collectorichum sp.）、R9（間座殼菌Diaporthe sp.）、R10（炭疽菌Collectorichum sp.）、R11（炭疽菌Collectorichum sp.）、R12（間座殼菌Diaporthe sp.）和R17（毛色二孢菌Lasiodiplodia sp.），其中菌株L9的抑菌能力尤為突出，對(duì)黑曲霉的抑制活性達(dá)67.35%，對(duì)其余5種測(cè)試菌的抑菌直徑均大于10 mm。根據(jù)BLAST結(jié)果可知，菌株L9的ITS與GenBank中C. vietnamense strain CBS 125478（MH863700.1）的同源性為99.23%?；谡婢鶬TS-rDNA序列構(gòu)建菌株L9系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖1）顯示，菌株L9與越南炭疽菌（C. vietname-nse）中的2個(gè)序列[C. vietnamense strain CBS 125478（MH863700.1）和C. vietnamense strain CBS 125477（MH863699.1）]的親緣關(guān)系相對(duì)較近，構(gòu)成一個(gè)支持度為83%的聚類(lèi)分支，暫將其鑒定為炭疽菌屬真菌。

3 討論

本研究從檀香紫檀不同部位組織中分離獲得15屬共337株內(nèi)生真菌，表明檀香紫檀分布著較豐富的內(nèi)生真菌資源。檀香紫檀內(nèi)生真菌的總定殖率、總分離率和總多樣性指數(shù)分別為74.89%、74.89%和1.90，與其他研究中報(bào)道的熱帶、亞熱帶植物的分離水平較接近（臧威等，2014），但高于多數(shù)已報(bào)道的北方溫帶藥用植物（朱軍等，2015），可能由于相對(duì)于北方溫帶地區(qū)，熱帶和亞熱帶地區(qū)環(huán)境濕度大和降水多，從而更有利于內(nèi)生真菌的侵染和定殖（Porras-Alfaro and Bayman，2011;臧威等，2014）。與朱軍等（2015）的研究結(jié)果類(lèi)似，本研究也發(fā)現(xiàn)檀香紫檀根部?jī)?nèi)生真菌的生物多樣性指數(shù)高于莖部。土壤微生物是植物內(nèi)生真菌的主要來(lái)源，其生物多樣性高，更容易通過(guò)根部傷口或開(kāi)口侵染進(jìn)入植物根部，這可能是根部?jī)?nèi)生真菌生物多樣性相對(duì)較高的重要原因（Torsvik and ?vre?s，2002;Compant et al.，2016;Fesel and Zuccaro，2016）。從檀香紫檀中共分離到15個(gè)屬的內(nèi)生真菌，木霉屬為根部的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，莖部和葉部的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群均為青霉屬。在15個(gè)屬的內(nèi)生真菌中，有9個(gè)屬只在根、莖、葉中的一個(gè)部位有分布，其中，Barssia、鐮孢霉屬、Gliocladiopsis和毛色二孢屬只分布在根部，殼多孢屬、擬青霉屬、擬盾殼霉屬和Setophaeosphaeria只分布在莖部，而曲霉屬僅在葉部有分布，表明檀香紫檀內(nèi)生真菌類(lèi)群分布具有一定的器官與組織專一性，可能是由檀香紫檀體內(nèi)不同部位的微環(huán)境差異所造成（Comby et al.，2016）。此外，Barssia、Setophaeosphaeria和殼多孢屬的內(nèi)生真菌在檀香紫檀有特異性分布，在其他藥用植物中尚未分離到，可能與檀香紫檀體內(nèi)獨(dú)特的微環(huán)境有關(guān)（王景儀等，2020）。

藥用植物內(nèi)生真菌已成為新藥開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要資源庫(kù)，其不僅可合成與藥用植物相同或相似的活性物質(zhì)，而且還蘊(yùn)含大量的新結(jié)構(gòu)和新活性的次生代謝產(chǎn)物（Ancheeva et al.，2020）。目前多種抗腫瘤、抗病毒和抗菌活性物質(zhì)已在藥用植物內(nèi)生真菌中分離到（Chen et al.，2016）。檀香紫檀樹(shù)皮與葉的提取物被證實(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等多種病原細(xì)菌及白色念珠菌、新型隱球菌、光滑念珠菌等酵母菌具有良好的抑制活性（Zamare et al.，2013;Donga et al.，2017），研究者還在檀香紫檀多個(gè)部位的提取物分離到多種新結(jié)構(gòu)的活性物質(zhì)（Krishnaveni and Srinivasa Rao，2000;Kesari et al.，2004;Li et al.，2018），但目前未見(jiàn)關(guān)于檀香紫檀內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物研究的相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)檀香紫檀中45株代表性內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抗菌活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，有16株內(nèi)生真菌對(duì)金黃色葡萄球菌、傷寒沙門(mén)氏菌、大腸埃希菌和痢疾桿菌等4種測(cè)試細(xì)菌具有抑菌活性，36株內(nèi)生真菌對(duì)白色念珠菌和黑曲霉2種測(cè)試真菌具有抑菌活性，15株內(nèi)生真菌對(duì)6種測(cè)試病原菌均表現(xiàn)出抑制活性，表明檀香紫檀存在較高比例的具有抗菌活性的內(nèi)生真菌菌株，為全面挖掘檀香紫檀的抗菌活性物質(zhì)提供了菌株資源，同時(shí)也為解決檀香紫檀資源緊缺、科學(xué)利用其藥用資源供了新思路，但其具體的活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及生理功能有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

檀香紫檀內(nèi)生真菌類(lèi)群分布具有一定的器官組織特異性，物種多樣性較豐富，且蘊(yùn)含有較高比例的抗細(xì)菌和抗真菌活性菌株，可為新型抗菌活性物質(zhì)的篩選與開(kāi)發(fā)提供菌株資源。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）