王亞麗 陳煜東 王益軍

摘要：?株高影響株型建成，與抗倒性、收獲指數(shù)以及最終產(chǎn)量相關(guān)。對(duì)矮稈材料的研究有助于豐富對(duì)株高調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)。在前期研究中，對(duì)玉米矮稈材料D11的農(nóng)藝與生理特征進(jìn)行了分析。本研究基于高世代回交群體，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)矮稈材料D11的基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行解析。與株高正常植株相比，矮稈材料中共檢測(cè)到2 537個(gè)差異表達(dá)的基因，其中1 120個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、1 417個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。功能注釋、GO富集、通路富集的結(jié)果表明，差異表達(dá)基因參與細(xì)胞延伸、細(xì)胞骨架功能、微管組織、葉綠體功能、植物激素合成代謝等。差異表達(dá)基因最顯著富集的通路與糖酵解相關(guān)。共表達(dá)分析結(jié)果表明，編碼果糖-1，6-雙磷酸酶的基因與多個(gè)差異表達(dá)基因存在功能關(guān)聯(lián)。該研究結(jié)果揭示了玉米矮稈材料中的基因表達(dá)調(diào)控，為后續(xù)玉米株高調(diào)控節(jié)點(diǎn)的發(fā)掘提供了參考。

關(guān)鍵詞：?矮稈;高世代回交群體;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;共表達(dá);玉米

中圖分類號(hào)：?S513.035.3??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A??文章編號(hào)：?1000-4440（2021）02-0280-09

Abstract：?Plant height affects plant type and is related to lodging resistance， harvest index and final yield. The research on dwarf plants helps to improve the understanding of plant height regulation mechanism. In previous studies， the agronomic and physiological characteristics of maize dwarf material D11 were analyzed. In this study， based on the advanced backcross population， the gene expression regulation of D11 was analyzed by transcriptome sequencing. A total of 2 537 differentially expressed genes （DEGs） were identified，including 1 120 up-regulated and 1 417 down-regulated DEGs. Functional annotation， GO enrichment and pathway enrichment analysis results indicated that DEGs were involved in cell expansion， cytoskeletal function， microtubule organization， chloroplast function， phytohormone homeostasis. The pathway most significantly enriched by DEGs was related to glycolysis. The gene encoding fructose-1，6-bisphosphatase was functionally related to several DEGs. The results of this study reveal the gene expression regulation in maize dwarf materials， and provide a reference for the subsequent exploration of maize plant height regulatory modes.

Key words：?dwarf plant;advanced backcross population;transcriptome sequencing;co-expression;maize

株高是重要的農(nóng)藝性狀，影響抗倒性、光合效率、收獲指數(shù)和最終產(chǎn)量?！熬G色革命”期間，產(chǎn)量的提高主要得益于株型與農(nóng)藝措施的改良。改良的高產(chǎn)品種具有半矮稈性狀、較高的氮肥同化效率、優(yōu)良的抗倒性[1]。控制高產(chǎn)品種半矮稈性狀的基因已被克隆。水稻的半矮稈基因semidwarf1 （sd1）編碼負(fù)責(zé)赤霉素合成的酶GA 20-oxidase2 （GA20ox2）[2-3]。小麥株高降低是由于Reduced height （Rht）基因的變異所導(dǎo)致，Rht編碼DELLA蛋白，參與赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。“綠色革命”期間，半矮稈性狀主要是由于赤霉素合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變所導(dǎo)致。除了赤霉素，其他植物激素，例如生長(zhǎng)素、油菜素內(nèi)酯、獨(dú)腳金內(nèi)酯等植物激素也與株高調(diào)控相關(guān)。生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)異常導(dǎo)致玉米和高粱植株矮化[5]。玉米嚴(yán)重矮化表型是由于編碼油菜素內(nèi)酯合成酶brassinosteroid C-6 oxidase基因的突變所導(dǎo)致[6]。油菜素內(nèi)酯信號(hào)通路的改變同樣能導(dǎo)致玉米植株矮化[7]。植物激素獨(dú)腳金內(nèi)酯誘導(dǎo)豌豆幼莖伸長(zhǎng)[8]。除了植物激素，表觀調(diào)控因子也影響株高。通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析，調(diào)控玉米株高的表觀因子被發(fā)掘[9]。

玉米株高是由微效多基因控制的性狀[10]。通過(guò)連鎖分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析，已有大量調(diào)控玉米株高的QTL/靶點(diǎn)被發(fā)掘[10-11]。其中，一些玉米株高QTL已被圖位克隆，例如qPH3.1、qph1[12-13]。QTL克隆是發(fā)掘玉米株高調(diào)控靶點(diǎn)的重要方法。通過(guò)玉米矮稈突變體研究，亦能為株高調(diào)控機(jī)制的解析提供重要參考。在前期研究中，實(shí)驗(yàn)室鑒定到1份玉米矮稈材料Dwarf11 （D11），矮稈材料D11的農(nóng)藝性狀、生理特征已被初步分析[14]?；诟咄繙y(cè)序的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，被用來(lái)研究植物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可用于SNP發(fā)掘、可變剪輯預(yù)測(cè)、融合轉(zhuǎn)錄本鑒定、基因表達(dá)分析等[15]。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，結(jié)合熒光定量PCR驗(yàn)證、基因功能注釋、通路富集分析、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等，對(duì)高世代回交D11矮稈群體的基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了分析，所得結(jié)果有助于解析矮稈基因D11介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為后續(xù)玉米株高調(diào)控靶點(diǎn)的解析提供參考。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

矮稈材料D11與玉米自交系Mo17雜交，獲得F1代。通過(guò)連續(xù)5個(gè)世代的回交，獲得高世代回交群體BC5。在高世代回交群體BC5中，與株高正常植株相比，矮稈材料株高顯著降低。本研究采用高世代回交群體BC5中的株高正常植株與矮稈植株作為試驗(yàn)材料。

1.2?RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建與高通量測(cè)序

在高世代回交群體BC5中，取三葉期幼莖，采用RNeasy Plant Mini Kit （QIAGEN）試劑盒進(jìn)行RNA提取。提取RNA的質(zhì)量與濃度用NanoDrop 2000 spectrophotometer、Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行測(cè)定。mRNA通過(guò)帶有oligo（dT）的磁珠進(jìn)行吸附。吸附的mRNA片段，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA末端修復(fù)，加腺嘌呤，連接接頭。連接產(chǎn)物進(jìn)一步純化，用于PCR擴(kuò)增。回收400～500 bp大小的產(chǎn)物，采用RNA Seq Library Preparation Kit進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。測(cè)序前，文庫(kù)質(zhì)量采用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System進(jìn)行qPCR檢測(cè)。合格的文庫(kù)基于125 bp成對(duì)模式，在Illumina Hiseq2500 platform進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3?差異表達(dá)基因發(fā)掘

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的原始序列，首先進(jìn)行質(zhì)量控制。接頭序列、低質(zhì)量reads（含有超過(guò)50%低質(zhì)量堿基的reads、未知堿基數(shù)超過(guò)5%的reads、測(cè)序質(zhì)量低于10的低質(zhì)量堿基）被剔除。采用SOAPaligner/soap2，過(guò)濾后的reads比對(duì)到玉米參考基因組[16]。比對(duì)結(jié)果質(zhì)量控制后，采用Cufflinks進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝[17]。通過(guò)計(jì)算每1×106 reads中來(lái)自于某基因每1 000堿基長(zhǎng)度的reads數(shù) （RPKM），對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行度量。本研究中，表達(dá)變化≥2、發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤率（FDR）≤0.05的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。

1.4?差異表達(dá)基因生物信息學(xué)分析

差異表達(dá)基因功能注釋通過(guò)BLAST 進(jìn)行。玉米基因功能注釋使用maizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù) （https：//www.maizegdb.org/）。水稻、擬南芥中差異表達(dá)基因的同源基因通過(guò)BLASTP獲得，所用數(shù)據(jù)庫(kù)分別為RGAP （http：//rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）與Araport （https：//www.araport.org/）。Gene ontology （GO）富集分析：首先基于Gene Ontology Consortium （http：//www.geneontology.org/） 數(shù)據(jù)庫(kù)，將差異表達(dá)基因比對(duì)到GO term[18]。確定每個(gè)GO term的差異表達(dá)基因數(shù)，超幾何分布檢驗(yàn)用來(lái)發(fā)掘顯著富集的GO term。通過(guò)Bonferroni校正，獲得校正P值。校正P值小于0.05為差異表達(dá)基因顯著富集的GO term。通路富集分析采用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行[19]。校正P值小于0.05為差異表達(dá)基因顯著富集的通路。

1.5?熒光定量PCR分析

RNA樣品用RNase-free DNase I （QIAGEN） 處理，采用M-MLV reverse transcriptase （Promega）反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。采用SYBR qPCR master mix （TaKaRa），在7500 Real-Time PCR System （ABI）上進(jìn)行熒光定量PCR。每個(gè)樣品重復(fù)3次。18S rRNA基因作為內(nèi)參基因。用2-△△Ct方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量[20]。

2?結(jié)果與分析

2.1?高世代群體矮稈材料表型及基因表達(dá)分析

玉米矮稈材料D11與自交系Mo17雜交。通過(guò)連續(xù)5個(gè)世代的回交，獲得高世代回交群體BC5。在高世代回交群體BC5中，與株高正常植株相比，矮稈材料株高極顯著降低（圖1）。

為了發(fā)掘矮稈材料中差異表達(dá)基因，取高世代回交群體中株高正常植株與矮稈植株，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、過(guò)濾，Clean reads比對(duì)到玉米參考基因組，對(duì)株高正常植株與矮稈植株中的基因表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在株高正常植株中檢測(cè)到超過(guò)30 000個(gè)基因的表達(dá)。在矮稈植株中檢測(cè)到近30 000個(gè)基因的表達(dá)（圖2）。

2.2?轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)掘差異表達(dá)基因

為了發(fā)掘矮稈材料中差異表達(dá)基因，比對(duì)的reads通過(guò)計(jì)算RPKM值對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行度量。通過(guò)比較株高正常植株和矮稈植株的基因表達(dá)量，進(jìn)行差異表達(dá)基因發(fā)掘。本研究中，基因表達(dá)變化≥2、發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤率≤0.05的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)基因。根據(jù)上述設(shè)定的閾值，共發(fā)掘到2 537個(gè)差異表達(dá)基因。與株高正常植株相比，其中1 120個(gè)基因在矮稈材料中表達(dá)量上升、1 417個(gè)基因在矮稈材料中表達(dá)量下降。

2.3?轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示的差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示的差異表達(dá)基因，設(shè)計(jì)引物（表1），進(jìn)行熒光定量PCR分析，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。

采用2-△△Ct方法，對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。差異表達(dá)基因熒光定量PCR與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)量的決定系數(shù)（R2）為0.72（圖3）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的差異表達(dá)基因可靠，由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的差異表達(dá)基因可用于后續(xù)分析。

2.4?差異表達(dá)基因功能

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示的差異表達(dá)基因，首先在maizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行功能注釋。此外，發(fā)掘水稻、擬南芥中差異表達(dá)基因的同源基因。玉米數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有功能注釋的差異表達(dá)基因，通過(guò)其水稻、擬南芥中的同源基因進(jìn)行功能注釋。功能注釋的結(jié)果表明，差異表達(dá)基因參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。基于矮稈材料表型，本研究集中分析可能與矮稈表型相關(guān)的差異表達(dá)基因。與株高正常植株相比，矮稈材料中與細(xì)胞伸長(zhǎng)相關(guān)的ARF GTPase家族成員基因差異表達(dá)，與微管組織、細(xì)胞骨架、木質(zhì)素合成、維管束組織發(fā)育相關(guān)的基因差異表達(dá)。矮稈材料葉片變寬、微卷，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，檢測(cè)到與葉片發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因。例如，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子、MYB轉(zhuǎn)錄因子等。此外，矮稈材料葉緣白化。在矮稈材料中，與葉綠素合成、葉綠體功能相關(guān)的基因差異表達(dá)，例如編碼參與葉綠素合成Mg-螯合酶基因、編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白的基因、調(diào)控葉綠素降解的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因等。差異表達(dá)基因還參與生長(zhǎng)素、油菜素內(nèi)酯、細(xì)胞分裂素等植物激素的合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程（表2）。

本研究所用矮稈材料對(duì)外源赤霉素施用敏感。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果表明，與株高正常植株相比，矮稈材料中與赤霉素合成代謝、信號(hào)通路相關(guān)的基因差異表達(dá)。與赤霉素合成相關(guān)的4個(gè)基因差異表達(dá)，包括上調(diào)的GA20ox5基因，下調(diào)的Dwarf1、dwarf3、KO1基因。與赤霉素代謝相關(guān)的2個(gè)GA2ox基因均下調(diào)表達(dá)。與赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的6個(gè)基因，包括赤霉素受體基因、F-box蛋白基因等，其中2個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、4個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。與赤霉素通路調(diào)控相關(guān)的5個(gè)基因，在矮稈材料中均下調(diào)表達(dá)（表3）。

2.5?差異表達(dá)基因GO與通路富集分析

基于Gene Ontology Consortium resource數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析。設(shè)定了較嚴(yán)格的閾值（校正P值<0.05）用來(lái)發(fā)掘差異表達(dá)基因顯著富集的GO term。在生物學(xué)過(guò)程中，差異表達(dá)基因富集在碳水化合物合成代謝、光合作用等過(guò)程。在分子功能方面，差異表達(dá)基因最顯著富集的GO term與結(jié)構(gòu)組分相關(guān)。為了進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)通路，采用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析。與GO富集分析類似，校正P值<0.05作為顯著富集KEGG通路篩選的標(biāo)準(zhǔn)。KEGG通路富集的結(jié)果表明，差異表達(dá)基因最顯著富集的通路與糖酵解相關(guān)。差異表達(dá)基因可能參與糖的合成與代謝。此外，差異表達(dá)基因顯著富集的通路與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸合成、光合作用等過(guò)程相關(guān)（表4）。

2.6?差異表達(dá)基因共表達(dá)分析

共表達(dá)分析有助于發(fā)掘基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，為后續(xù)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入解析提供參考。本研究對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示的差異表達(dá)基因進(jìn)行了共表達(dá)分析。結(jié)果表明，Class I-like SAM-binding甲基轉(zhuǎn)移酶基因（ID： GRMZM2G064759）下調(diào)表達(dá)。在基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，該基因與10個(gè)差異表達(dá)基因互作，包括DUF947結(jié)構(gòu)域蛋白基因（ID： GRMZM2G051197）、寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)類蛋白基因（ID： GRMZM2G434935）等。果糖-1，6-雙磷酸酶編碼蛋白基因（ID： GRMZM2G306732）上調(diào)表達(dá)，是共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。該基因與多個(gè)差異表達(dá)基因功能相關(guān)，包括編碼纖維素-1，7-雙磷酸酶的shbp1基因、編碼磷酸核酮糖激酶基因（ID： GRMZM2G026024）等?；蚬脖磉_(dá)分析的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示的差異表達(dá)基因可能存在一定的功能關(guān)聯(lián)。

3?討論

本研究所用矮稈材料是田間自然突變所產(chǎn)生，表現(xiàn)為植株矮化。在前期研究中，對(duì)該矮稈材料的農(nóng)藝、生理特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，外源赤霉素施用可以使該矮稈材料的株高變高，表明該矮稈材料屬于赤霉素敏感型矮稈種質(zhì)[14]。本研究基于高世代回交種質(zhì)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)矮稈材料的基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了解析。采用高世代回交種質(zhì)，有利于降低遺傳背景對(duì)基因表達(dá)的影響，提高轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。在高世代回交群體中，與株高正常植株相比，矮稈材料中共檢測(cè)到2 537個(gè)基因差異表達(dá)，其中1 120個(gè)基因上調(diào)表達(dá)、1 417個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。差異表達(dá)基因功能注釋、GO富集、通路富集的結(jié)果表明，差異表達(dá)基因參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞延伸、微管組成、木質(zhì)素合成、葉綠素合成、葉綠體功能、植物激素合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。供試矮稈材料的矮化可能與細(xì)胞延伸的缺陷相關(guān)。葉綠素合成、葉綠體功能的異常，可能與矮稈材料的葉緣白化相關(guān)。木質(zhì)素合成的變化與矮稈材料莖稈質(zhì)地的改變相關(guān)[14]。不同生物學(xué)過(guò)程存在一定的關(guān)聯(lián)性。例如，植物激素赤霉素、生長(zhǎng)素、油菜素內(nèi)酯、細(xì)胞分裂素、獨(dú)腳金內(nèi)酯等互作，協(xié)同調(diào)控了多個(gè)生物學(xué)過(guò)程[21-25]。此外，已有證據(jù)表明，植物激素赤霉素影響葉綠體的產(chǎn)生[26]。本研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，供試矮稈材料中存在著復(fù)雜的正向、反向、交叉基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而影響矮稈材料的表型。

通過(guò)比較不同矮稈材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以發(fā)掘共有的、特異的差異表達(dá)基因，為矮稈基因介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析提供科學(xué)依據(jù)。通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，未能獲得d1、d3、d5、br2、na2、bv1、D8、D9等玉米矮稈材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過(guò)將本研究獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)中玉米矮稈材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，有助于發(fā)掘本研究矮稈材料中特異的差異表達(dá)基因，特異差異表達(dá)基因的發(fā)掘可以為供試矮稈材料基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析提供重要參考。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）