杜清普，趙 英，王瑞紅，遲玉杰,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

雞蛋質(zhì)優(yōu)價(jià)廉，富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素以及各種微量礦物質(zhì)元素，是一種營養(yǎng)豐富且均衡的動(dòng)物性食品，深受世界各國消費(fèi)者的青睞。蛋黃作為雞蛋中營養(yǎng)價(jià)值更高的部分，因具有良好的功能特性和諸多免疫活性物質(zhì)而廣泛應(yīng)用于食品、制藥和生命科學(xué)等領(lǐng)域[1]。

冰蛋黃是以鮮雞蛋經(jīng)清洗、去殼后分離出的蛋黃為原料，經(jīng)過勻漿、過濾、巴氏殺菌等一系列加工工藝，最后冷凍處理而成的蛋制品。冷凍作為食品貯藏保鮮技術(shù)之一，不僅可以最大限度地保留蛋黃的營養(yǎng)成分，而且可以有效延長其貨架期。然而，Moran[2]研究指出低溫冷凍會(huì)破壞蛋黃蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并使其變性，進(jìn)而使蛋黃流動(dòng)性不可逆地降低，降低程度受冷凍溫度、冷凍時(shí)間等條件的影響。閆崢蓉等[3]研究表明，相比于鮮蛋黃，凍藏180 d的蛋黃經(jīng)自然解凍后自由水含量降低，黏性系數(shù)、表面疏水性增大。Liu Jingyuan等[4]用凍融后的蛋黃加熱制備凝膠時(shí)發(fā)現(xiàn)，凍融蛋黃的彈性模量、黏性模量及最低成膠溫度均高于鮮蛋黃。Harrison等[5]研究發(fā)現(xiàn)在90 d凍藏期內(nèi)，自然解凍后蛋黃的乳化性表現(xiàn)出先下降、后回升、再略微下降的變化規(guī)律。

凍融對(duì)蛋黃功能特性的影響會(huì)使其在食品工業(yè)中的加工應(yīng)用受到限制，合理運(yùn)用解凍技術(shù)是解決此問題的有效途徑之一。目前，食品工業(yè)中常采用的解凍方法有自然解凍、低溫解凍、靜水解凍、流水解凍和微波解凍等，多應(yīng)用于水產(chǎn)品、畜產(chǎn)品的加工與研究[6-8]。然而，關(guān)于解凍方法或解凍條件對(duì)蛋黃品質(zhì)的影響卻鮮見報(bào)道。本研究采用室溫自然解凍、靜水浴解凍、超聲波解凍、微波解凍4 種方法，對(duì)比分析了各解凍方法對(duì)冰蛋黃乳化特性、凝膠特性等主要功能特性的影響，并探究解凍后蛋黃理化特性和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，旨在選出一種適用于冰蛋黃的解凍方法，從而減少凍融對(duì)蛋黃品質(zhì)的劣變影響，并進(jìn)一步改善蛋黃的功能特性，同時(shí)為冰蛋黃的解凍方法在不同應(yīng)用需求下的選擇提供參考，并為其工業(yè)化生產(chǎn)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

褐殼雞蛋購于哈爾濱市忠君連鎖超市，4 ℃冷藏備用；自采購日起，雞蛋冷藏時(shí)間不超過7 d。

乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)G-250染液、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9012型電熱恒溫箱、HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司；NN-GD576M型微波爐 日本松下微波爐有限公司；T18型高速勻漿機(jī) 德國IKA公司；TGL-20B型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TA.XT plus型質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro Systems公司；Mastersizer 2000型激光粒度儀 英國Marlven公司；F-4700型熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；inVia型激光顯微拉曼光譜儀 英國Renishaw公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備與處理

鮮蛋清洗、去殼后分離出蛋黃，用鑷子挑除系帶，將其在濾紙上輕輕滾動(dòng)以清除卵黃膜表面殘余的蛋清，然后劃破卵黃膜使蛋黃流出。300 r/min攪拌蛋黃10 min后，過濾以除去殘留的卵黃膜。將其在恒溫箱60.6 ℃下殺菌處理3.5 min后冷卻至室溫，得到鮮蛋黃。取30 mL鮮蛋黃置于經(jīng)過相同條件殺菌處理的50 mL離心管中，在－18 ℃下冷凍6 h得到冰蛋黃。參照表1中的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)冰蛋黃進(jìn)行解凍處理。

表1 冰蛋黃的4 種解凍方法Table 1 Four thawing methods for frozen egg yolk

1.3.2 解凍復(fù)溫曲線的測定

取出經(jīng)過冷凍處理的30 mL冰蛋黃，對(duì)其進(jìn)行室溫自然解凍、靜水浴解凍、超聲波解凍時(shí)，將熱電偶溫度計(jì)探頭插于蛋黃幾何中心，實(shí)時(shí)測定蛋黃中心溫度；進(jìn)行微波解凍時(shí)，將光纖測溫儀傳感光纖插于蛋黃幾何中心測定溫度。

1.3.3 濁度與蛋白質(zhì)溶解性的測定

濁度根據(jù)Kurisaki等[9]的方法進(jìn)行測定。用0.15 mol/L NaCl溶液配制0.5 g/100 mL蛋黃溶液，漩渦振蕩1 min使其充分溶解。以0.15 mol/L NaCl溶液為對(duì)照組，使用紫外分光光度計(jì)測定660 nm波長處的吸光度，以此表示為濁度。

蛋白質(zhì)溶解性參照孫燕婷等[10]的方法測定。取上述0.5 g/100 mL蛋黃溶液，10 000 r/min離心3 min。取200 μL上清液加至4 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，靜置20 min。以200 μL 0.15 mol/L NaCl溶液混合4 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液為對(duì)照組，測定595 nm波長處的吸光度。根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋黃溶液的可溶性蛋白質(zhì)量濃度，單位mg/mL，以可溶性蛋白質(zhì)量濃度表示蛋白溶解性。

1.3.4 乳化特性的測定

乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）、乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）參照Pearce[11]和Jiang Shanshan[12]等的方法測定，并略作調(diào)整。用0.15 mol/L NaCl溶液配制0.5 g/100 mL蛋黃溶液，漩渦振蕩1 min。取20 mL蛋黃溶液加入5 mL大豆油（水相與油相體積比為4∶1），10 000 r/min均質(zhì)1 min后立即從底部吸取0.5 mL乳狀液移入49.5 mL的0.1 g/100 mL SDS溶液中，漩渦振蕩10 s。以0.1 g/100 mL SDS溶液作為對(duì)照組，測定500 nm波長處的吸光度A0。根據(jù)式（1）計(jì)算EAI。

式中：n為乳狀液稀釋倍數(shù)；ρ為蛋黃質(zhì)量濃度/（mg/mL）；b為光程（1 cm）；φ為油相體積分?jǐn)?shù)（0.2）。

距初次吸取乳狀液5 min后重復(fù)上述步驟，測得吸光度A5min。根據(jù)式（2）計(jì)算ESI。

式中：Δt為間隔時(shí)間5 min。

1.3.5 凝膠特性的測定

參考毋引子等[13]的方法進(jìn)行質(zhì)構(gòu)剖面分析（texture profile analysis，TPA），使用質(zhì)構(gòu)儀和P/0.5型探頭測定蛋黃的凝膠特性。取30 mL蛋黃于50 mL燒杯中，85 ℃水浴加熱20 min制備凝膠，室溫冷卻12 h后測定其凝膠強(qiáng)度和凝膠硬度。測試參數(shù)設(shè)置為測前速率5 mm/s、測試速率1 mm/s、測后速率5 mm/s、行進(jìn)距離10 mm、觸發(fā)力5 g。

1.3.6 質(zhì)構(gòu)特性的測定

參考Ramaswamy等[14]的方法，通過反擠壓流變學(xué)利用質(zhì)構(gòu)儀、A-BE型探頭測定蛋黃的硬度、稠度、內(nèi)聚性及黏性。測試參數(shù)設(shè)置為測前速率5 mm/s、測試速率1 mm/s、測后速率2 mm/s、行進(jìn)距離15 mm、觸發(fā)力5 g。

1.3.7 粒徑及其分布的測定

取一定量的蛋黃用超純水稀釋10 倍，漩渦振蕩至充分溶解。參照Campbell等[15]使用Mastersizer 2000型粒度分析儀測定D4,3、d0.1、d0.5、d0.9及粒徑分布曲線。其中，D4,3表示體積平均粒徑，d0.1、d0.5、d0.9分別指體積占比累計(jì)10%、50%、90%的平均粒徑。測試參數(shù)設(shè)置為顆粒折射率1.460、分散劑折射率1.330、粒徑檢測范圍0.02～2 000 μm。

1.3.8 表面疏水性的測定

表面疏水性參考Shen Xue等[16]的方法，利用ANS作為熒光探針進(jìn)行測定。用1×PBS（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4）配制8 mmol/L ANS溶液和質(zhì)量濃度依次為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL的蛋黃溶液。10 000 r/min離心3 min，取4 mL上清液加入至20 μL ANS溶液并立刻漩渦振蕩5 s，然后避光靜置反應(yīng)20 min。使用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度，測試參數(shù)設(shè)置為激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長470 nm、狹縫寬度3.0 nm。以濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制擬合曲線，以擬合曲線斜率作為表面疏水性指數(shù)（H0），以H0表征表面疏水性。

1.3.9 巰基與二硫鍵含量的測定

參考Beveridge等[17]的方法，利用Ellman試劑測定蛋黃游離巰基、表面巰基以及二硫鍵含量。用Tris-Gly緩沖液（含0.086 mol/L Tris、0.1 mol/L Gly及4 mmol/L EDTA，用HCl調(diào)pH值至8.0）配制1 g/100 mL蛋黃溶液，漩渦振蕩3 min。避光條件下用Tris-Gly緩沖液配制4 mg/mL DTNB溶液，即得Ellman試劑。取0.1 mL Ellman試劑加入至5 mL蛋黃溶液，室溫下避光反應(yīng)20 min后，5 000 r/min離心15 min后取上清液。以0.1 mL Ellman試劑混合5 mL Tris-Gly緩沖液為對(duì)照組，測定上清液于412 nm波長處的吸光度A412nm。根據(jù)式（3）計(jì)算蛋黃游離巰基含量。

式中：n為蛋黃溶液稀釋倍數(shù)；ρ為蛋黃質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

Tris-Gly緩沖液加入8 mol/L尿素制得Urea-Tris-Gly緩沖液，再加入10 mmol/Lβ-巰基乙醇制得βME-Urea-Tris-Gly緩沖液，用Urea-Tris-Gly緩沖液和βME-Urea-Tris-Gly緩沖液分別替代Tris-Gly緩沖液重復(fù)上述方法分別測定上清液A412nm，并按照公式（3）計(jì)算表面巰基含量、總巰基含量。根據(jù)式（4）計(jì)算二硫鍵含量。

1.3.10 拉曼光譜的測定與分析

參考Herrero等[18]的方法，將蛋黃均勻涂抹于載玻片上用于拉曼光譜掃描。測試參數(shù)為：拉曼頻移范圍400～2 000 cm－1，激發(fā)波長532 nm，發(fā)射功率50 mW，峰位誤差小于3 cm－1，以苯丙氨酸峰位歸屬（1 003±1）cm－1作為歸一化因子。運(yùn)用OMINIC軟件校準(zhǔn)拉曼光譜基線、檢測峰位歸屬，采用PeakFit 4.12軟件定量分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

每組數(shù)據(jù)平行測定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用SPSS 25.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)平均值的多重比較采用Duncan法，并進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05表示差異顯著。采用OriginPro 9.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 各解凍方法下冰蛋黃的復(fù)溫曲線

冰蛋黃在室溫自然解凍、靜水浴解凍、超聲波解凍及微波解凍方法下復(fù)溫至25 ℃所需時(shí)間依次縮短，分別為213.5、37.5、21.0、0.5 min（圖1）。在室溫自然解凍、靜水浴解凍、超聲波解凍的過程中，蛋黃中心溫度升至（－0.7±0.1）℃時(shí)變化趨勢較為平緩，表明此時(shí)蛋黃正在進(jìn)行由固相至液相的相轉(zhuǎn)變。Lopez等[19]的研究也指出蛋黃的凝固點(diǎn)為－0.65 ℃。相比于室溫自然解凍，靜水浴解凍的復(fù)溫時(shí)間縮短了82.44%。這是因?yàn)樵谕葴囟?、壓力及自然?duì)流等條件下，水的對(duì)流換熱系數(shù)和導(dǎo)熱系數(shù)均大于空氣，故靜水浴的熱傳遞作用更強(qiáng)，解凍所需時(shí)間較短[20]。超聲波解凍的復(fù)溫時(shí)間為靜水浴解凍復(fù)溫時(shí)間的56.00%，可能是超聲波通過機(jī)械效應(yīng)與空化作用使分子處于機(jī)械振動(dòng)狀態(tài)，瞬間產(chǎn)生高溫、高壓條件，繼而加速復(fù)溫過程[21]。4 種解凍方法中，微波解凍的復(fù)溫速率最快。然而進(jìn)行微波解凍時(shí)，蛋黃內(nèi)產(chǎn)生局部凝膠化的現(xiàn)象，解凍后有少量凝膠微粒形成。這是因?yàn)榈包S內(nèi)部部分冰晶先于其他冰晶融化成極性水分子，加劇了微波的吸收。譚明堂等[8]也發(fā)現(xiàn)魷魚在微波解凍下呈現(xiàn)局部燒焦的現(xiàn)象。

圖1 各解凍方法下冰蛋黃的復(fù)溫曲線Fig.1 Rewarming curves of frozen egg yolk with different thawing methods

2.2 解凍方法對(duì)蛋黃濁度與蛋白質(zhì)溶解性的影響

蛋白質(zhì)溶解性是反映蛋黃水合性質(zhì)的重要指標(biāo)，也是評(píng)價(jià)其功能特性的基礎(chǔ)指標(biāo)；濁度則能直觀反映蛋黃組分的聚集、交聯(lián)程度。本研究以蛋黃溶液的吸光度表示濁度，以其中可溶性蛋白的質(zhì)量濃度表示蛋白質(zhì)溶解性。

如圖2所示，室溫自然解凍后蛋黃的濁度最高（1.78），且可溶性蛋白的質(zhì)量濃度最低，僅為0.298 mg/mL。這表明冷凍使低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）及其他可溶性蛋白結(jié)構(gòu)遭到破壞，疏水基團(tuán)暴露并發(fā)生疏水相互作用從而形成聚集體，宏觀表現(xiàn)為水溶性的降低[22]。同時(shí)，這也表明蛋白質(zhì)溶解性與濁度呈一定的負(fù)相關(guān)性。靜水浴解凍下蛋黃的可溶性蛋白質(zhì)量濃度僅高于室溫自然解凍蛋黃，且與鮮蛋黃無顯著性差異（P＞0.05），說明加快復(fù)溫速率可以起到減緩冷凍致使LDL變性聚集的作用。蛋黃經(jīng)過超聲波解凍和微波解凍后的可溶性蛋白質(zhì)量濃度無顯著性差異（P＞0.05），相對(duì)于鮮蛋黃分別提高10.73%、14.39%。這表明在微波的影響下，蛋白質(zhì)聚集體因次級(jí)鍵遭到破壞而分散，其內(nèi)部的極性基團(tuán)得以暴露，從而使溶解性增強(qiáng)；超聲波則通過機(jī)械作用產(chǎn)生空穴效應(yīng)，使聚集體結(jié)構(gòu)逐漸疏松，更多的極性基團(tuán)接觸到水相，疏水性多肽朝向脂質(zhì)部分，最終使其溶解性增強(qiáng)[23]。張春紅等[24]的研究也表明短期微波處理可以增強(qiáng)大豆分離蛋白質(zhì)溶解性，溶解性隨處理時(shí)間延長而上升。

圖2 解凍方法對(duì)蛋黃濁度與蛋白質(zhì)溶解性的影響Fig.2 Effects of thawing methods on turbidity and protein solubility of egg yolk

2.3 解凍方法對(duì)蛋黃乳化特性的影響

EAI和ESI是評(píng)價(jià)蛋黃乳化性的兩個(gè)重要參數(shù)。EAI反映乳化劑在油、水兩相中自由擴(kuò)散并吸附于兩相界面處使兩相間接“相溶”的能力；ESI則反映乳化劑易于在油-水界面附著，維持乳狀液體系穩(wěn)定的能力[23]。

由圖3可知，蛋黃的乳化活性與蛋白質(zhì)溶解性的變化趨勢基本相同，表明EAI與可溶性蛋白質(zhì)量濃度具有一定的正相關(guān)性。相比于鮮蛋黃，蛋黃在室溫下自然解凍后EAI降低10.65%、ESI降低6.98%，且均顯著低于其他解凍方法（P＜0.05）。靜水浴解凍后蛋黃的EAI與鮮蛋黃的差異不顯著（P＞0.05），但ESI顯著高于鮮蛋黃（P＜0.05）。超聲波解凍和微波解凍下蛋黃的EAI分別為8.54、8.61 m2/g，雖然兩者均較高且無顯著性差異（P＞0.05），但超聲波解凍后蛋黃的ESI顯著高于微波解凍（P＜0.05）。這可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚硎褂?水界面處蛋白質(zhì)與油相的疏水相互作用力增強(qiáng)，親水基團(tuán)進(jìn)入水相使兩相界面的界面張力減小，導(dǎo)致被包埋的油滴難以聚集；也可能是蛋黃經(jīng)過微波解凍后粒徑分布不均，乳狀液體系自身紊亂所致[25]。李楊等[26]的研究也發(fā)現(xiàn)利用超聲處理可以有效改善大豆分離蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

圖3 解凍方法對(duì)蛋黃乳化活性與乳化穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of thawing methods on emulsifying activity and emulsion stability of egg yolk

2.4 解凍方法對(duì)蛋黃凝膠特性的影響

凝膠特性是反映蛋白質(zhì)變性、交聯(lián)的宏觀特征之一。凝膠的形成既依賴于蛋白質(zhì)分子之間的共價(jià)鍵相互作用，也與蛋白質(zhì)和水的偶極-偶極相互作用有關(guān)。凝膠強(qiáng)度的差異性取決于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布、氨基酸組成以及肽鏈長度的差異性[27]。

如圖4所示，蛋黃經(jīng)過冷凍并在室溫下自然解凍后，所制備熱凝膠的凝膠強(qiáng)度下降11.75%。靜水浴解凍、超聲波解凍后蛋黃的凝膠強(qiáng)度和凝膠硬度都處于較低水平，且差異均不顯著（P＞0.05）。微波解凍下蛋黃的凝膠強(qiáng)度介于鮮蛋黃和室溫自然解凍之間，但其凝膠硬度超出鮮蛋黃9.41%并顯著高于其他解凍方法（P＜0.05）。這說明在微波輻照的影響下，蛋黃蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變使疏水基團(tuán)暴露，并通過共價(jià)作用和疏水相互作用形成膠束，最終形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)[28]。這也與微波解凍導(dǎo)致蛋黃局部產(chǎn)生凝膠微粒的現(xiàn)象相吻合。閆虹等[28]的研究也指出微波處理可使白鰱魚糜的凝膠特性得到有效提高。

圖4 解凍方法對(duì)蛋黃凝膠強(qiáng)度與凝膠硬度的影響Fig.4 Effects of thawing methods on gel strength and hardness of egg yolk

2.5 解凍方法對(duì)蛋黃質(zhì)構(gòu)特性的影響

凍融后的蛋黃形態(tài)為半固態(tài)，在縱向剪切力的作用下，其橫截面產(chǎn)生屈服應(yīng)力并宏觀表現(xiàn)出一定的黏性、彈性等質(zhì)構(gòu)特性。反擠壓流變學(xué)已用于多項(xiàng)觸變性流體、半固體等樣品的研究[14,29]。依據(jù)反擠壓流變學(xué)對(duì)蛋黃質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行測定，結(jié)果可以直觀地反映出蛋黃蛋白質(zhì)的變性程度。

從表2可以看出，室溫自然解凍對(duì)蛋黃流動(dòng)性的影響最大，該方法解凍后蛋黃的硬度、稠度、內(nèi)聚性及黏性均顯著高于鮮蛋黃和其他解凍方法（P＜0.05）。其次是靜水浴解凍，該方法下蛋黃的黏性是鮮蛋黃的4.66 倍。超聲波解凍后蛋黃的硬度、稠度、黏性與內(nèi)聚性均高于鮮蛋黃，但差異均不顯著（P＞0.05）。相比于鮮蛋黃，微波解凍使蛋黃的硬度、內(nèi)聚性顯著增大（P＜0.05），分別提高1.59、2.36 倍。相對(duì)于其他3 種解凍方法，室溫自然解凍下蛋黃的質(zhì)構(gòu)特性變化較大，究其原因，可能是靜水浴解凍、超聲波解凍及微波解凍均使冰蛋黃中蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)加劇，創(chuàng)造出有利于因凍融而形成的共價(jià)鍵斷裂的條件，同時(shí)蛋白質(zhì)分子難以穩(wěn)定接觸并發(fā)生相互作用，最終使蛋黃流動(dòng)性增強(qiáng)[30]。

表2 解凍方法對(duì)蛋黃質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 2 Effects of thawing methods on textural properties of egg yolk

2.6 解凍方法對(duì)蛋黃粒徑及其分布的影響

2.6.1 解凍方法對(duì)蛋黃粒徑的影響

各解凍方法下蛋黃的平均粒徑如表3所示。其中D4,3顯示出蛋黃在室溫下自然解凍后的粒徑整體較大，而采用其他方法進(jìn)行解凍可以對(duì)D4,3增加起到不同程度的抑制效果。鮮蛋黃的d0.1、d0.5、d0.9分別為4.56、25.44、47.12 μm，通過比較鮮蛋黃和經(jīng)室溫自然解凍處理的蛋黃粒徑可以發(fā)現(xiàn)，凍融處理使d0.1減小69.96%、d0.5減小46.50%，而d0.9增大3.77 倍，表明凍融過程中所形成的大粒徑顆粒是由小粒徑顆粒聚集而成，進(jìn)一步印證了室溫自然解凍下蛋黃濁度較大的研究結(jié)果。Au等[31]也報(bào)道了冷凍處理會(huì)使蛋黃“顆?！苯M分的粒徑增大、凝膠性增強(qiáng)，并且這是由脂蛋白或載脂蛋白在低溫環(huán)境中發(fā)生交聯(lián)聚集所致。相比于室溫自然解凍，微波解凍后蛋黃的平均粒徑較小，其D4,3為10.76 μm。張海華等[32]利用微波處理小麥面筋蛋白時(shí)也得到了平均粒徑減小的結(jié)果。微波解凍下蛋黃的d0.1、d0.5均顯著小于超聲波解凍（P＜0.05），但其d0.9達(dá)到28.54 μm，為后者的1.94 倍，表明微波解凍下蛋黃中有凝膠微粒初步形成。

表3 解凍方法對(duì)蛋黃粒徑的影響Table 3 Effects of thawing methods on particle size of egg yolk

2.6.2 解凍方法對(duì)蛋黃粒徑分布的影響

圖5反映了蛋黃經(jīng)不同解凍方法處理后粒徑分布的情況。室溫自然解凍后蛋黃的粒徑分布較為分散，且在100～1 000 μm范圍內(nèi)檢測出大量顆粒。Relkin等[33]指出乳狀液的平均粒徑越小，粒徑分布越均勻，其乳化性越好，這解釋了室溫自然解凍下蛋黃乳化性較差的原因。與室溫自然解凍相比，靜水浴解凍后蛋黃的粒徑分布趨于集中，說明用靜水浴解凍后的蛋黃制備出的乳狀液更加穩(wěn)定。超聲波解凍后蛋黃的粒徑分布較為均勻，幾乎呈單峰且近似于正態(tài)分布，因此在該解凍方法下蛋黃制備出的乳狀液體系穩(wěn)定性最好[34]。微波解凍后蛋黃的D4,3與超聲波解凍的差異不顯著（P＞0.05），但微波解凍下蛋黃的粒徑分布呈現(xiàn)雙峰，印證了微波解凍下蛋黃的乳化活性與超聲波解凍無顯著性差異（P＞0.05），乳化穩(wěn)定性卻顯著低于超聲波解凍（P＜0.05）的結(jié)果。

圖5 解凍方法對(duì)蛋黃粒徑分布的影響Fig.5 Effects of thawing methods on particle size distribution of egg yolk

2.7 解凍方法對(duì)蛋黃表面疏水性的影響

表面疏水性指數(shù)能夠反映蛋白質(zhì)表面所暴露疏水性氨基酸殘基的相對(duì)含量，其越大表示蛋白質(zhì)構(gòu)象展開程度越大[35]。由圖6可知，鮮蛋黃H0為3 873.30，而蛋黃經(jīng)過冷凍并在室溫下自然解凍后增至4 835.30。這是由蛋黃經(jīng)過冷凍處理后蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，使包埋在內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露所致。彭歡歡等[36]在研究凍藏期間河蟹肌原纖維蛋白生化特性的變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白的表面疏水性隨冷凍時(shí)間延長而上升。靜水浴解凍后蛋黃的H0最高（5 079.63）（P＜0.05），相比于鮮蛋黃增大31.14%。這進(jìn)一步表明冰蛋黃在室溫下自然解凍時(shí)，脂蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致其脂質(zhì)部分伸出蛋白質(zhì)表面，形成疏水環(huán)境，因蛋白質(zhì)變性而暴露的疏水基團(tuán)之間發(fā)生疏水相互作用，使得表面疏水性有所降低；而靜水浴解凍削弱了蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)的相互作用[3,37]，因此該解凍方法下蛋白質(zhì)的表面疏水性較強(qiáng)。超聲波解凍和微波解凍后蛋黃的H0均顯著低于其他解凍方法（P＜0.05），且兩者無顯著性差異（P＞0.05），印證了這兩種解凍方法下蛋白質(zhì)溶解性較高的研究結(jié)果。梁雯雯等[38]的研究也指出微波解凍下鰱魚肌球蛋白的表面疏水性低于靜水解凍。

圖6 解凍方法對(duì)蛋黃表面疏水性的影響Fig.6 Effects of thawing methods on surface hydrophobicity of egg yolk

2.8 解凍方法對(duì)蛋黃巰基與二硫鍵含量的影響

作為半胱氨酸的活性殘基，巰基易于氧化形成二硫鍵，對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的形成與改變發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[39]。各解凍方法對(duì)蛋黃游離巰基、表面巰基及二硫鍵含量的影響如圖7所示。室溫自然解凍下蛋黃的游離巰基含量最低，僅為3.07 μmol/g，相比于鮮蛋黃減少了36.96%，而二硫鍵含量最高（11.71 μmol/g），相比于鮮蛋黃增加了17.33%。這表明在凍融處理的影響下，蛋黃蛋白質(zhì)分子之間的巰基氧化結(jié)合形成二硫鍵。Chen Zhenjia等[40]研究指出巰基含量的減少也可能是其發(fā)生氧化重排形成其他氧化產(chǎn)物所致。超聲波解凍后蛋黃游離巰基、表面巰基的含量與微波解凍近似，但超聲波解凍下蛋黃的二硫鍵含量顯著低于微波解凍（P＜0.05），表明超聲波作用可使蛋黃總巰基含量減少。李弓中等[41]的研究表明蛋清液的總巰基含量隨超聲時(shí)間延長呈下降的趨勢。通過對(duì)比各解凍方法下蛋黃的表面巰基含量與可溶性蛋白質(zhì)量濃度的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)兩者呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)性，說明巰基與水分子之間的氫鍵作用也是影響蛋白質(zhì)溶解性的因素之一。

圖7 解凍方法對(duì)蛋黃巰基與二硫鍵含量的影響Fig.7 Effects of thawing methods on contents of sulfhydryl groups and disulfide bonds in egg yolk

2.9 各解凍方法下蛋黃的拉曼光譜及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量

2.9.1 各解凍方法下蛋黃的拉曼光譜

拉曼激光經(jīng)過分子產(chǎn)生非彈性散射時(shí)，其波長、頻率會(huì)發(fā)生改變，散射光與激發(fā)光的光頻差稱為拉曼頻移。拉曼頻移取決于分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的變化，因此拉曼光譜可用于分子結(jié)構(gòu)的純定性或高度定量分析。在拉曼光譜中，有酰胺III帶（波數(shù)1 230～1 350 cm－1）、酰胺I帶（波數(shù)1 600～1 700 cm－1）以及所包含的肽鍵C＝O伸縮振動(dòng)帶、N—H彎曲振動(dòng)帶（波數(shù)1 665 cm－1）等以拉曼光強(qiáng)的形式反映出的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，也有諸如色氨酸吲哚環(huán)（波數(shù)759 cm－1）、酪氨酸殘基（波數(shù)830 cm－1和850 cm－1）等所處微環(huán)境變化的反饋信息[34]。依據(jù)譜峰的峰位歸屬，可以對(duì)經(jīng)過不同方法解凍的蛋黃蛋白質(zhì)構(gòu)象變化情況進(jìn)行分析，從而深入了解各解凍方法影響蛋黃功能特性的作用機(jī)制。

由圖8可知，各方法解凍后的蛋黃均在波數(shù)1 004 cm－1附近呈現(xiàn)高強(qiáng)度譜峰（歸屬于苯丙氨酸苯環(huán)伸縮振動(dòng)），該譜峰因受外界環(huán)境影響較小而常被用作歸一化因子。冰蛋黃于室溫下自然解凍后脂蛋白烷基鏈C＝C伸縮振動(dòng)（波數(shù)1 522 cm－1附近譜峰）強(qiáng)度與鮮蛋黃相比有所減弱，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)C＝C與水分子—OH基共價(jià)結(jié)合使其含量減少所致[42]。超聲波解凍、微波解凍后的蛋黃均在波數(shù)1 157 cm－1和1 443 cm－1附近呈現(xiàn)拉曼光譜峰強(qiáng)度高于鮮蛋黃的譜峰（歸屬于脂肪族氨基酸非對(duì)稱C—H彎曲振動(dòng)），而室溫自然解凍和靜水浴解凍下該譜峰強(qiáng)度均略低于鮮蛋黃，表明低溫冷凍使蛋白質(zhì)發(fā)生變性聚集的同時(shí)，脂肪族疏水性基團(tuán)被包埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，繼而導(dǎo)致C—H振動(dòng)強(qiáng)度減弱，拉曼頻移減小，并且該過程受靜水浴快速復(fù)溫的影響而有所緩和；微波、超聲波則是利用機(jī)械效應(yīng)使分子運(yùn)動(dòng)加劇，對(duì)聚集體結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行不同程度的破壞，將處于包埋狀態(tài)以及原有的疏水性基團(tuán)暴露至極性微環(huán)境下[34]，最終使譜峰強(qiáng)度恢復(fù)并高于鮮蛋黃。該研究結(jié)果與各解凍方法對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)溶解性、乳化性影響的研究結(jié)果表現(xiàn)出高度一致性。

圖8 各解凍方法下蛋黃的拉曼光譜Fig.8 Raman spectra of frozen egg yolk thawed by different thawing methods

2.9.2 解凍方法對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的影響

蛋白質(zhì)分子中肽鍵之間的氫鍵、分子間的范德華力等次級(jí)鍵是使其二級(jí)結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定的主要作用力。低溫、超聲波及微波作用會(huì)使次級(jí)鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致蛋黃蛋白質(zhì)原有二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而重排形成新的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象。有研究指出，在拉曼光譜酰胺I帶中：波數(shù)1 626～1 638 cm－1拉曼譜帶歸屬于β-折疊；波數(shù)1 640～1 648 cm－1拉曼譜帶歸屬于無規(guī)卷曲；波數(shù)1 648～1 657 cm－1拉曼譜帶歸屬于α-螺旋；波數(shù)1 673～1 686 cm－1拉曼譜帶歸屬于β-轉(zhuǎn)角[43-44]。通過對(duì)酰胺I帶內(nèi)不同譜帶的拉曼曲線峰面積進(jìn)行積分，可計(jì)算出蛋白質(zhì)4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

如表4所示，α-螺旋是蛋黃蛋白質(zhì)中含量最高的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在鮮蛋黃中相對(duì)含量為34.80%。對(duì)比微波解凍后的蛋黃和鮮蛋黃可知，微波解凍使蛋黃α-螺旋相對(duì)含量顯著減少（P＜0.05），并向其他結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。郝天舒等[45]在研究微波處理對(duì)米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)影響時(shí)得到了相同的結(jié)果。Blume等[46]也指出α-螺旋含量的減少有利于凝膠三維網(wǎng)絡(luò)的形成，這解釋了微波解凍下蛋黃凝膠硬度較大這一現(xiàn)象。蛋黃經(jīng)冷凍并在室溫下自然解凍后，氫鍵含量較多、結(jié)構(gòu)規(guī)則有序的β-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)含量顯著增多（P＜0.05），解釋了蛋黃經(jīng)過凍融后流動(dòng)性較低，內(nèi)聚性、黏性等質(zhì)構(gòu)特性較高的現(xiàn)象。冰蛋黃經(jīng)超聲波解凍處理后，β-折疊相對(duì)含量由19.27%降低至16.08%，無規(guī)卷曲相對(duì)含量由17.02%增加至20.59%，這與李弓中等[41]研究發(fā)現(xiàn)蛋清蛋白質(zhì)β-折疊、無規(guī)卷曲含量隨超聲作用時(shí)間延長而分別減少、增多的研究結(jié)果類似。從β-轉(zhuǎn)角的結(jié)果來看，室溫自然解凍、靜水浴解凍均使其相對(duì)含量降低，而超聲波解凍、微波解凍均使其相對(duì)含量上升，與蛋黃蛋白質(zhì)溶解性呈現(xiàn)出一致的規(guī)律。這可能是因?yàn)棣?轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)多含有帶電荷的極性氨基酸殘基，且該結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)于球狀蛋白表面，有利于使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加松散，故β-轉(zhuǎn)角含量越高，蛋白質(zhì)溶解性越強(qiáng)[47]。

表4 解凍方法對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的影響Table 4 Effects of thawing methods on protein secondary structures in egg yolk

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明不同解凍方法對(duì)冰蛋黃的蛋白質(zhì)溶解性、乳化特性、凝膠特性及表面疏水性等功能、理化特性有不同程度的影響，并證明超聲波解凍是較適用于冰蛋黃的解凍方法。

室溫自然解凍下冰蛋黃的復(fù)溫時(shí)間最長，為213.5 min。該方法解凍后蛋黃的濁度最高（1.78），二硫鍵含量最高（11.71 μmol/g），且蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊相對(duì)含量最高，表明該解凍方法下蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集程度最高。靜水浴解凍后蛋黃的乳化活性、乳化穩(wěn)定性均顯著低于超聲波解凍（P＜0.05），并且該解凍方法下蛋黃的表面疏水性最強(qiáng)，相比于鮮蛋黃增大31.14%。冰蛋黃經(jīng)超聲波解凍后D4,3最?。?.69 μm），且粒徑分布最為集中。該解凍方法下蛋黃的硬度、內(nèi)聚性、黏性等質(zhì)構(gòu)特性均較低且與鮮蛋黃無顯著性差異（P＞0.05）。而且與鮮蛋黃相比，超聲波解凍后蛋黃的蛋白質(zhì)溶解性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性均有所改善。微波解凍下冰蛋黃的復(fù)溫時(shí)間最短，僅為0.5 min。但該解凍方法下蛋黃的二硫鍵含量顯著高于超聲波解凍（P＜0.05），且粒徑分布較為分散，蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量最低，解凍后蛋黃中有凝膠微粒形成。