劉志恬，董玉鵬，李永才，畢 陽，李寶軍，景春苑

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

早酥梨（Pyrus bretchneidericv.Zaosu）是以‘蘋果梨'為母本、‘身不知'為父本雜交選育而成的早熟梨品種。該品種具有良好的栽培性狀和較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，在甘肅表現(xiàn)出長勢優(yōu)良、結(jié)果早、豐產(chǎn)、果實(shí)個(gè)大、品質(zhì)好等特性[1]。因其果肉細(xì)膩雪白、汁多味甜，果皮翠綠且薄，品質(zhì)佳、上市早等優(yōu)點(diǎn)，成為我國栽培廣泛的早熟梨品種之一[2]。早酥梨通常采收于夏季高溫時(shí)節(jié)，快速的品質(zhì)劣變及腐敗致使采后果實(shí)損失嚴(yán)重，制約了早酥梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3]。其中由互隔交鏈孢霉（Alternaria alternata）引起的黑斑病是早酥梨采后主要的病害之一[4]，A.alternata能在室溫或低溫環(huán)境下快速生長而使果實(shí)腐敗變質(zhì)，并在生長過程中產(chǎn)生多種有毒代謝產(chǎn)物，對人類和動(dòng)物健康造成潛在安全風(fēng)險(xiǎn)[5]。目前主要采用化學(xué)殺菌劑控制梨果實(shí)采后病害，但長期使用化學(xué)殺菌劑會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境污染，并危害人體健康[6]。因此，尋求和開發(fā)更加安全、高效的天然防腐劑以防治A.alternata引起的早酥梨黑斑病迫在眉睫[7]。

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是25～35 個(gè)賴氨酸殘基通過α-羥基和ε-氨基之間形成酰胺鍵構(gòu)成的同型均聚多肽[8]，由小白鏈霉菌經(jīng)發(fā)酵作用產(chǎn)生，在人體內(nèi)可分解成必需氨基酸——賴氨酸[9]，其分子質(zhì)量約為5 kDa[10]。因具有效價(jià)高、安全無毒、水溶性好、作用pH值范圍廣、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、抑菌譜廣等特點(diǎn)，ε-PL已被廣泛用作食品防腐劑[11]。研究表明相對分子質(zhì)量在3 600～4 300之間的ε-PL具有高抑菌活性[12]。李誠等[13]的研究發(fā)現(xiàn)ε-PL對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黃曲霉菌等的生長均有顯著的抑制效果，且ε-PL的抑菌活性隨其濃度的增加而增強(qiáng)。肖媛等[14]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為1 600、3 200、6 400 mg/L的ε-PL處理可顯著降低柑橘果實(shí)酸腐病的發(fā)病率和病斑直徑。Li Hua等[15]研究發(fā)現(xiàn)150 mg/L的ε-PL能顯著抑制棗灰霉病離體菌絲生長、孢子萌發(fā)和芽管伸長，質(zhì)量濃度達(dá)到4 000 mg/L時(shí)能夠完全抑制棗灰霉病的發(fā)生。吳倩等[16]研究發(fā)現(xiàn)20 mg/Lε-PL處理對厚皮甜瓜采后致腐病菌爪甲曲霉有一定的抑制作用。Liu Kewei等[17]研究發(fā)現(xiàn)ε-PL處理會(huì)刺激指狀青霉活性氧的產(chǎn)生，加速細(xì)胞質(zhì)膜過氧化，進(jìn)而導(dǎo)致丙二醛的積累。Wei Meilin等[18]研究發(fā)現(xiàn)ε-PL處理導(dǎo)致粉紅單端孢孢子表面粗糙收縮，嚴(yán)重破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜完整性。同時(shí)孟岳成等[19]研究發(fā)現(xiàn)ε-PL能使黃曲霉細(xì)胞膜通透性增加，線粒體嵴模糊，細(xì)胞核降解，蛋白質(zhì)及核酸泄露，細(xì)胞空腔化，細(xì)胞生理代謝紊亂。目前有關(guān)ε-PL對梨果實(shí)黑斑病菌A.alternata的抑菌作用及其機(jī)理鮮見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)以梨果實(shí)黑斑病菌A.alternata為研究對象，研究天然防腐劑ε-PL對A.alternata生長的抑制作用和對黑斑病的控制作用，并進(jìn)一步探討其可能的抑菌機(jī)理，以期為將ε-PL作為天然防腐殺菌劑在果蔬采后病害控制應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

早酥梨采摘于甘肅省景泰縣條山農(nóng)場，挑選大小一致、無機(jī)械損傷、無病蟲害的果實(shí)，紙箱包裝后運(yùn)達(dá)實(shí)驗(yàn)室，于低溫條件（（3±2）℃）、相對濕度85%的冷庫中貯藏待用。

A.alternata由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后實(shí)驗(yàn)室分離于貯藏過程中自然發(fā)病的梨果實(shí)，純化、鑒定后于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基保存待用。

ε-PL 鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；線粒體膜電位熒光探針（JC-1） 北京索萊寶科技有限公司；毒素標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；氯化鈉、硫酸鎂和乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21FSIC光學(xué)顯微鏡、DDS-370型微型電導(dǎo)儀日本奧林巴斯工業(yè)有限公司；UV2450型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；H-1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)有限公司；AWL-1002-M實(shí)驗(yàn)室超純水儀 美國艾科浦國際有限公司；U-LH100-3型熒光顯微鏡 上海永科光學(xué)儀器公司；1290-6040型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1A.alternata孢子懸浮液的配制

參照高春麗等[20]的方法并略作修改，在無菌操作條件下向培養(yǎng)5 d的A.alternata培養(yǎng)皿中倒入少量無菌水，并加入少量質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01% Tween-80，用滅菌的涂布器輕刮，將所得溶液通過4 層紗布過濾到滅菌三角瓶中，用無菌水稀釋，在混合器上振蕩15 s，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制成1×106個(gè)/mL孢子懸浮液。

1.3.2ε-PL處理后A.alternata生長情況分析

1.3.2 .1ε-PL處理后A.alternata菌落直徑的測定

參照刁春英等[21]的方法，并作修改。稱取5、10、15、20 mg的ε-PL分別溶解于100 mL滅過菌的PDA培養(yǎng)基中，混合均勻，倒入直徑為7 cm的培養(yǎng)皿中。待培養(yǎng)基凝固后，分別接種28 ℃培養(yǎng)7 d直徑為8 mm的A.alternata菌餅，然后于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，每隔1 d測量其菌落直徑，以不添加ε-PL的PDA培養(yǎng)基作為對照。每個(gè)處理3 個(gè)平行，重復(fù)3 次。

1.3.2 .2ε-PL處理后A.alternata生物量的測定

按1.3.2.1節(jié)所述操作，待培養(yǎng)基凝固后在其表面鋪上無菌玻璃紙，分別接種28 ℃培養(yǎng)7 d的直徑為8 mm的A.alternata菌餅，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后取下玻璃紙，稱質(zhì)量并收集菌絲體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以培養(yǎng)前后菌餅連同玻璃紙的質(zhì)量差表征生物量。以不添加ε-PL的PDA培養(yǎng)基作為對照，每個(gè)處理3 個(gè)平行，重復(fù)3 次。

1.3.3ε-PL處理后早酥梨黑斑病病斑直徑的測定

參照張彥東等[22]的方法并作修改。選擇大小均勻、無病無損傷的早酥梨果實(shí)，浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的NaClO溶液消毒2 min，之后用蒸餾水沖洗，晾干，再用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液對果實(shí)表皮進(jìn)行擦拭消毒，然后用直徑3 mm的打孔鐵釘均勻地在果實(shí)赤道部位打3 個(gè)孔，每孔中接種1.3.1節(jié)所述濃度為1×106個(gè)/mL的A.alternata孢子懸浮液20 μL，在接種2 h后向每個(gè)孔中各接入10 μL的質(zhì)量濃度分別為400、800、1 200、1 600 mg/L的ε-PL溶液。以無菌水作為對照。在室溫下晾干，用規(guī)格為30 cm×45 cm、厚0.02 mm的市售保鮮袋包裝，室溫條件下，以十字交叉法每隔2 d測一次果實(shí)的病斑直徑，每個(gè)處理用果9 個(gè)，每個(gè)處理分別重復(fù)3 次。

1.3.4ε-PL處理后A.alternata孢子細(xì)胞膜的完整性測定

1.3.4 .1 PI染色檢測ε-PL處理后A.alternata孢子細(xì)胞膜完整性

參照沈科萍[23]的方法，并作修改。準(zhǔn)確吸取0.8 mL 1.3.1節(jié)所述濃度為1×106個(gè)/mLA.alternata孢子懸浮液于1.5 mL無菌離心管中，在5 000×g條件下離心5 min，棄上清液，在孢子沉淀中加入0.8 mL質(zhì)量濃度分別為100、200 mg/L的ε-PL溶液，28 ℃溫育2 h，5 000×g離心5 min，棄上清液，立即向孢子沉淀中加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0），室溫下避光靜置30 min，離心，棄上清液，加入PBS（pH 7.0）1 mL進(jìn)行洗滌，離心，棄上清液，最后加入1 mL PBS（pH 7.0），用U-LH100-3型熒光顯微鏡（激發(fā)波長為620 nm）進(jìn)行觀察拍照并用計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)染色率。以無菌水處理作為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 .2ε-PL處理后A.alternata菌絲體電導(dǎo)率的測定

菌絲體電導(dǎo)率測定參照Meng Xianghong等[24]的方法，并作修改。在無菌條件下，將滅過菌的PDA培養(yǎng)基均勻倒入直徑60 mm培養(yǎng)皿中，待凝固后將無菌的玻璃紙小心鋪在培養(yǎng)基表面，接種培養(yǎng)7 d直徑為8 mm的A.alternata菌餅，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后取下玻璃紙并收集上面的菌絲體。準(zhǔn)確稱取0.25 g菌絲于15 mL無菌離心管中，之后分別加入10 mL質(zhì)量濃度為100、200 mg/L的ε-PL溶液，28 ℃溫育，在0、30、60、90、120、150 min和180 min時(shí)用DDS-370型微型電導(dǎo)儀連續(xù)測定懸浮液的電導(dǎo)率。

1.3.5ε-PL處理后A.alternata線粒體形態(tài)的觀察

線粒體形態(tài)觀察參照Shi Xuequn等[25]的方法，并作修改。用二甲基亞砜溶解線粒體膜電位熒光探針JC-1，配成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的溶液，置于－20 ℃避光保存。取1.3.1節(jié)所述濃度為1×106個(gè)/mL的A.alternata孢子懸浮液1 mL于1.5 mL無菌離心管，在5 000×g條件下離心10 min，棄上清液，在孢子沉淀中加入1 mL質(zhì)量濃度分別為100、200 mg/L的ε-PL溶液，28 ℃溫育2、4 h后，5 000×g離心10 min，棄上清液，立即向孢子沉淀中加入1 mL PBS（pH 7.0）、0.1 μL 10 μg/mL JC-1，室溫下避光靜置30 min，5 000×g離心5 min，棄上清液，加入PBS（pH 7.0）1 mL進(jìn)行洗滌，5 000×g離心5 min，棄上清液，最后加入1 mL PBS（pH 7.0），立即置于熒光顯微鏡下觀察拍照。每處理設(shè)3 組平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。以無菌水作為對照。

1.3.6ε-PL處理后A.alternata生成黑色素的分析

1.3.6 .1 黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別配制質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 mg/L的黑色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在400 nm波長處測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 .2 黑色素提取

菌絲體收集如1.3.2.2節(jié)所述，在PDA培養(yǎng)基無菌玻璃紙上接種培養(yǎng)4 d的A.alternata菌絲體，準(zhǔn)確稱取0.25 g置于研缽中，加入液氮，研磨，置于裝有30 mL 1 mol/L NaOH溶液的錐形瓶中，沸水浴提取5 h，每30 min左右振蕩一次。－20 ℃冷卻20 min，雙層濾紙過濾，濾液用7 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 2.0，10 000×g離心15 min，得到沉淀即為黑色素粗提物。

1.3.6 .3 黑色素的純化與含量測定

向上述黑色素粗提物中加入5 mL 7 mol/L HCl溶液，充分混勻，沸水浴2 h，10 000×g離心15 min，沉淀用1 mol/L NaOH溶液溶解，再用7 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至2.0，10 000×g離心15 min，重復(fù)3 次。沉淀用1 mol/L NaOH溶液定容至1 mL。以1 mol/L NaOH溶液為空白，用紫外-可見分光光度計(jì)于400 nm波長處測定溶液的吸光度。A.alternata菌絲體中黑色素含量按下式計(jì)算。

式中：x為測定的吸光度；y為黑色素含量/（mg/g）。

1.3.7ε-PL處理后A.alternata毒素合成的分析

1.3.7 .1A.alternata毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備：用無水甲醇準(zhǔn)確定容1 mg標(biāo)準(zhǔn)品至1 mL，配成1 mg/mL質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封冷凍儲(chǔ)存于－20 ℃冰箱中。標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：分別配制10、20、50、100、200、1 000 μg/mL的鏈格孢酚單甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）、鏈格孢酚（alternariol，AOH）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，5、50、100、200、500、1 000 μg/mL的交鏈格烯（altenuene，ALT）和騰毒素（tentoxin，Ten）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封保存于－20 ℃冰箱中。

1.3.7.2 真菌毒素的提取與測定

真菌毒素的提取方法參照董玉鵬等[26]的方法。準(zhǔn)確稱取1.3.2.2節(jié)28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d的A.alternata菌絲體0.5 g（精確至0.01 g），冰浴研磨均勻，置于10 mL無菌離心管中，加入2.5 mL含體積分?jǐn)?shù)0.3%甲酸的乙腈-水（80∶20，V/V）提取液，漩渦混勻，150 r/min常溫提取30 min，再加入0.25 g無水MgSO4和0.04 g NaCl，劇烈振蕩1 min后，以10 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，準(zhǔn)確定容至1.2 mL，用于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

色譜條件：色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；流動(dòng)相A為去離子水，流動(dòng)相B為無水甲醇；梯度洗脫條件為70% A保持1 min，隨后2 min內(nèi)降至50%，隨后1 min內(nèi)繼續(xù)降至10%，保持2 min，之后在0.1 min內(nèi)升至90%，保持2 min；流速0.3 mL/min；總運(yùn)行時(shí)間7.1 min。

質(zhì)譜條件：離子源模式為正離子模式；質(zhì)譜掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測；鞘氣溫度為350 ℃；霧化器壓力為35 psi；鞘氣流速為11.0 L/min；毛細(xì)管電壓為4 000 V，其他參數(shù)通過儀器調(diào)至最優(yōu)。

4 種鏈格孢霉毒素的監(jiān)測離子、錐孔電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 4 種真菌毒素的串聯(lián)質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 Optimized tandem mass parameters for 4 mycotoxins

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013軟件統(tǒng)計(jì)計(jì)算，并用Origin 2017軟件作圖，用SPSS 25.0軟件對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan多重差異顯著分析進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PL處理對A.alternata生長的影響

2.1.1ε-PL處理對A.alternata菌落生長的影響

由圖1可知，ε-PL處理顯著抑制了A.alternata菌絲生長（P＜0.05），且其抑制效果隨處理質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。由圖1A可知，各處理組邊緣2～5 mm的白色菌絲擴(kuò)展未受到明顯的抑制，并且隨著ε-PL質(zhì)量濃度的增加，菌落整體顏色逐漸加深。猜測可能是ε-PL處理促進(jìn)了A.alternata黑色素的合成。50、100、150、200 mg/Lε-PL處理7 d后菌落直徑分別為對照組的62.72%、43.24%、32.43%和29.54%。

圖1 ε-PL處理對A.alternata菌絲形態(tài)（A）和菌落直徑（B）的影響Fig.1 Effect of ε-PL treatment on mycelial morphology (A) and colony diameter (B) of A.alternata

2.1.2ε-PL對A.alternata生物量的影響

ε-PL處理顯著降低了A.alternata的生物量（P＜0.05）（圖2），其抑制作用存在顯著的濃度依賴性，培養(yǎng)4 d后，50、100、150 mg/L和200 mg/Lε-PL處理的A.alternata生物量分別較對照降低了33.3%、47.8%、55.6%和72.2%。

圖2 ε-PL處理對A.alternata生物量的影響Fig.2 Effect of ε-PL treatment on biomass of A.alternata

2.2 ε-PL處理對早酥梨黑斑病的控制效果

由圖3可知，ε-PL對梨果實(shí)黑斑病的擴(kuò)展有明顯的抑制效果。但提高ε-PL處理質(zhì)量濃度，其控制效果并沒有明顯變化（圖3A），貯藏9 d時(shí)質(zhì)量濃度高于800 mg/L的ε-PL處理對早酥梨黑斑病擴(kuò)展的控制并沒有顯著的增效作用，400 mg/L的ε-PL處理已能達(dá)到較佳控制效果。貯藏12 d時(shí)，400 mg/Lε-PL處理組果實(shí)病斑直徑僅為對照組的59.28%（圖3B）。

圖3 ε-PL處理對早酥梨黑斑病擴(kuò)展（A）及病斑直徑（B）的影響Fig.3 Effect of ε-PL treatment on the development of black spot disease (A) and lesion diameter (B) of pears

2.3 ε-PL對A.alternata孢子細(xì)胞膜完整性的影響

2.3.1 PI染色檢測ε-PL對A.alternata孢子細(xì)胞膜完整性的影響

PI染液能夠穿透破損細(xì)胞膜，對細(xì)胞核染色，其熒光強(qiáng)度越高表明細(xì)胞膜受損越嚴(yán)重。由圖4A可知，對照組A.alternata孢子只有個(gè)別細(xì)胞膜可以觀察到較弱的紅色熒光，而ε-PL處理后A.alternata熒光強(qiáng)度隨處理質(zhì)量濃度的增加顯著增強(qiáng)，200 mg/L的ε-PL處理相比對照組染色率增加了59%（圖4B），表明ε-PL處理嚴(yán)重地破壞A.alternata孢子的細(xì)胞膜。

圖4 ε-PL處理后PI染色檢測A.alternata孢子細(xì)胞膜完整性（A）和PI染色率（B）Fig.4 Examination of cell membrane integrity after ε-PL treatment by propidium iodide (PI) staining (A) and PI staining percentage (B)

2.3.2ε-PL對A.alternata菌絲體電導(dǎo)率的影響

由圖5可知，ε-PL處理的A.alternata菌絲體電導(dǎo)率顯著高于對照組（P＜0.05），且隨處理時(shí)間延長和處理劑量的增加而逐漸增大。100、200 mg/Lε-PL處理的A.alternata菌絲體電導(dǎo)率在處理后的180 min時(shí)分別為對照組的1.25、1.39 倍。

圖5 ε-PL處理對A.alternata菌絲體電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of ε-PL treatment on conductivity of A.alternata

2.4 ε-PL對A.alternata線粒體膜電位的影響

由圖6可知，對照組中線粒體分布均勻且形態(tài)完整、熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。隨著處理時(shí)間延長，線粒體形態(tài)逐漸模糊，密度降低，熒光強(qiáng)度減弱。而ε-PL處理組中線粒體形態(tài)破壞嚴(yán)重，處理質(zhì)量濃度越高，熒光強(qiáng)度越弱，表明線粒體膜電位下降越快，菌體凋亡速度越快。

圖6 ε-PL處理對A.alternata線粒體形態(tài)的影響Fig.6 Effect of ε-PL treatment on mitochondrial morphology of A.alternata

2.5 ε-PL對A.alternata黑色素產(chǎn)生的影響

由圖7可知，ε-PL處理顯著刺激了A.alternata黑色素的產(chǎn)生，且黑色素含量與處理的ε-PL質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，100 mg/L和200 mg/Lε-PL處理組A.alternata黑色素含量分別為對照組的2.63 倍和3.52 倍。

圖7 ε-PL處理對A.alternata產(chǎn)生黑色素的影響Fig.7 Effect of ε-PL treatment on melanin production by A.alternata

2.6 ε-PL對A.alternata毒素合成的影響

對離體條件下A.alternata生長過程中常見的4 種毒素進(jìn)行分析比較。由圖8A可知，ε-PL處理顯著抑制了A.alternata菌絲體中Ten的產(chǎn)生（P＜0.05）。200 mg/L的ε-PL處理后Ten質(zhì)量濃度為對照組的66.11%。由圖8B～D可知，ε-PL對A.alternata產(chǎn)生ALT、AOH、AME 3 種毒素具有促進(jìn)作用。其中，200 mg/L的ε-PL處理后A.alternata中ALT、AOH、AME質(zhì)量濃度相比對照組分別增加了101.25%、852.96%和67.28%。

圖8 ε-PL處理對A.alternata毒素產(chǎn)生的影響Fig.8 Effect of ε-PL treatment on toxin production by A.alternata

3 討 論

研究表明，ε-PL對酵母菌屬中的尖銳假絲酵母、紅發(fā)夫酵母，革蘭氏陽性菌中的凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，革蘭氏陰性菌中的產(chǎn)氣節(jié)桿菌、大腸桿菌等引起食物腐敗的多數(shù)微生物均有一定的抑制作用[27]。本研究結(jié)果表明，ε-PL處理能顯著抑制A.alternata菌絲生長（圖1），且能夠有效控制梨果實(shí)黑斑病的擴(kuò)展（圖3）。這一結(jié)果與劉鶴[28]在煙草赤星病菌的研究中得到的結(jié)果相似，他發(fā)現(xiàn)ε-PL可引起病原真菌芽管皺縮畸形，降低分生孢子萌發(fā)率。質(zhì)量濃度高于10 μg/mL的ε-PL對煙草離體葉的病斑擴(kuò)展有明顯抑制作用。同時(shí)他還發(fā)現(xiàn)ε-PL對黃瓜褐斑病控制具有明顯的濃度效應(yīng)，而對水稻惡苗病菌抑制效果并不明顯。此外，劉洪霞[11]發(fā)現(xiàn)62.5～3.906 μg/mL的ε-PL對漢遜酵母、黑曲霉和擴(kuò)展青霉均有明顯的抑制作用，而ε-PL抑制曲霉菌、青霉菌和鐮刀菌等病原真菌的最低抑菌質(zhì)量濃度普遍偏高，大約為250 μg/mL。付萍[29]發(fā)現(xiàn)ε-PL對Escherichia coli的抑菌能力存在濃度依賴性?？梢姡?PL對某些植物常見真菌病害具有一定的抑制作用，但不同病原菌及寄主對ε-PL的敏感性存在差異。

細(xì)胞膜是常見的抗真菌劑的重要作用位點(diǎn)[30]，多數(shù)抑菌活性物質(zhì)通過影響細(xì)胞膜完整性而發(fā)揮作用。周祺等[31]發(fā)現(xiàn)450 mg/mL的ε-PL能破壞腸球菌細(xì)胞膜的完整性。藍(lán)蔚青等[32]研究發(fā)現(xiàn)1.0 mg/mL的ε-PL能夠破壞腐生葡萄球菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，改變膜通透性，使電導(dǎo)率增加。Shima等[33]研究發(fā)現(xiàn)陽離子多價(jià)態(tài)ε-PL結(jié)合細(xì)胞膜上陰離子分子后，致使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致能量供應(yīng)中斷，影響其正常的生理活動(dòng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)200 mg/L的ε-PL處理嚴(yán)重破壞了A.alternata細(xì)胞膜（圖4）、線粒體（圖6）的完整性，改變膜通透性，增大菌絲體電導(dǎo)率（圖5）。寧亞維等[34]發(fā)現(xiàn)ε-PL可以通過增加金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜滲透性，改變細(xì)胞膜跨膜質(zhì)子梯度，進(jìn)入胞內(nèi)降解或抑制蛋白質(zhì)合成，從而發(fā)揮抑菌作用。Ye Ruosong等[35]發(fā)現(xiàn)ε-PL可以通過活性氧氧化應(yīng)激以及基因調(diào)控等途徑發(fā)揮抑菌作用。

微生物在生長過程中會(huì)產(chǎn)生生物堿、類萜、酚類、抗菌物質(zhì)、色素等一系列次級代謝產(chǎn)物[36]。次級代謝產(chǎn)物雖然不是維持生命活動(dòng)的必需物質(zhì)，但其具有重要的生物學(xué)功能，有利于微生物在激烈的競爭環(huán)境中生存，并且可能會(huì)通過產(chǎn)生一些有毒的次級代謝產(chǎn)物來保證自身的安全[37]。本實(shí)驗(yàn)對A.alternata生長過程中產(chǎn)生的黑色素含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度的ε-PL處理均能顯著促進(jìn)A.alternata產(chǎn)生黑色素，與2.1.1節(jié)猜測一致。黑色素能提高微生物抗重金屬毒害、抗紫外線損害的能力[38]，還能結(jié)合和隔離非特異性肽和化合物[37]，產(chǎn)生物理屏障，保護(hù)真菌孢子，增強(qiáng)其抗氧化能力，從而提高其生存能力[39]。黑色素是目前唯一確定的可以保護(hù)生物體免受輻射傷害的天然聚合物，可以有效清除羥自由基、活性氧自由基[40]。對AOH、AME、ALT、Ten 4 種毒素質(zhì)量濃度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度的ε-PL處理對AOH、AME、ALT 3 種毒素的生成起促進(jìn)作用，而對Ten起抑制作用。作為非寄主選擇性毒素，AOH、AME、ALT屬于苯并吡喃酮衍生物[41-42]，該類化合物的形成途徑是1 個(gè)乙酰輔酶A和6 個(gè)丙二酰輔酶A通過頭尾醛醇縮合反應(yīng)，首先形成芳香環(huán)即AOH，AOH與S-腺苷甲氨硫酸反應(yīng)生成AME，AME在一定條件下發(fā)生蒽醌重排，降解產(chǎn)物就是其他二苯并吡喃酮衍生物[43]。而Ten具有環(huán)形四肽結(jié)構(gòu)，其合成機(jī)制仍不明確[44]，Solhaug等[45]研究發(fā)現(xiàn)AOH能造成細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡；閆璐等[46]研究發(fā)現(xiàn)AME可作用于細(xì)胞線粒體，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)AME導(dǎo)致細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔打開，使線粒體內(nèi)膜跨膜電位下降[47]。Ten能抑制光合磷酸化[48]，其中AOH和AME之間存在協(xié)同作用，能夠增加DNA斷裂的速率[44]。真菌產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物是為了適應(yīng)不同的環(huán)境[49]，提高自身的生存能力。真菌次級代謝產(chǎn)物也易受外界環(huán)境的影響，如溫度、水分含量、pH值、光照等[50]。Sonja等[51]研究發(fā)現(xiàn)A.alternata產(chǎn)生的AOH和鏈格孢菌毒素易受白光刺激。Brzonkalik等[52]研究發(fā)現(xiàn)A.alternata的產(chǎn)毒性能受氮源的調(diào)控，且有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更有利于AOH和AME的產(chǎn)生。寧華[53]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中高濃度的優(yōu)良氮源（蛋白胨）對發(fā)酵產(chǎn)生黑色素十分重要。其次，真菌次級代謝產(chǎn)物的合成還受到環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶通路的調(diào)控[54]。同時(shí)，不同非寄主選擇性毒素的合成還因菌株、培養(yǎng)基成分、光照條件等而存在差異，另外真菌生長過程中大部分毒素是分泌到周圍的環(huán)境中，姜冬梅等[55]研究發(fā)現(xiàn)番茄交鏈孢毒素能向病斑外延組織擴(kuò)散，蔣黎艷[56]發(fā)現(xiàn)柑橘感染產(chǎn)毒鏈格孢霉菌后產(chǎn)生的毒素會(huì)從病斑部位擴(kuò)散到周圍健康部位進(jìn)而積累，因此本實(shí)驗(yàn)僅通過測定菌絲中的毒素并不能完全說明ε-PL處理改變了毒素的合成能力，尚需在對毒素含量進(jìn)行系統(tǒng)準(zhǔn)確測定的基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明ε-PL處理對毒素合成的調(diào)控機(jī)制。

綜上，ε-PL能夠顯著抑制A.alternata菌絲生長，并有效控制梨果實(shí)黑斑病的擴(kuò)展，且其作用效果存在濃度依賴性。同時(shí)ε-PL處理嚴(yán)重破壞了A.alternata細(xì)胞膜完整性，增加了細(xì)胞膜透性，并破壞線粒體的完整性。ε-PL處理能顯著促進(jìn)A.alternata黑色素生成。ε-PL處理對A.alternata毒素產(chǎn)生的作用存在差異，其促進(jìn)了AME、AOH、ALT的合成，但對Ten的合成具有抑制作用。