劉英麗，楊梓妍，萬 真，于青林，曹雅婷，蔣逸萱，李洪巖，劉 潔，王 靜

（北京工商大學食品與健康學院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國-加拿大食品營養(yǎng)與健康聯(lián)合實驗室（北京），北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

發(fā)酵香腸是指將攪碎的豬肉（或牛、羊肉等）、動物脂肪、鹽、糖、發(fā)酵劑和香辛料等混合后灌進腸衣，經(jīng)過微生物發(fā)酵而成的香腸制品[1]。由于原料肉、香辛料的種類和比例的變化以及發(fā)酵和干燥條件不同，發(fā)酵香腸產(chǎn)品呈現(xiàn)出感官多樣性，幾乎每個國家都有自己的傳統(tǒng)特色發(fā)酵香腸，如意大利的薩拉米香腸、德國的耐貯香腸、西班牙的肉干香腸、葡萄牙的阿薩多香腸、我國的臘腸等。發(fā)酵香腸品種多樣，至今仍無正式且統(tǒng)一的分類標準和方法，常見按照脫水程度和發(fā)酵程度進行分類[2]。按照脫水程度進行分類可分為半干發(fā)酵香腸、干發(fā)酵香腸。半干發(fā)酵香腸又稱快速發(fā)酵香腸，水分質(zhì)量分數(shù)在40%以上。干發(fā)酵香腸水分質(zhì)量分數(shù)小于40%，由于干發(fā)酵香腸的水分活度低，因此不用冷藏也可長久保存。按發(fā)酵程度（以pH值表示）可分為低酸發(fā)酵香腸（pH≥5.5）和高酸發(fā)酵香腸（pH＜5.4）。發(fā)酵香腸的穩(wěn)定性主要是由發(fā)酵和干燥過程中乳酸菌酸化和水分活度的降低綜合作用決定的。在微生物發(fā)酵過程中主要的理化性質(zhì)的變化為：pH值降低、脫水、硝酸鹽及亞硝酸鹽被還原、亞硝基肌紅蛋白的形成、蛋白質(zhì)的水解及膠凝化、脂肪水解和氧化現(xiàn)象[3]。

發(fā)酵香腸獨特的風味與乳酸菌、革蘭氏陽性過氧化氫酶陽性球菌（Gram-positive catalase-positive cocci，GCC+）及酵母菌等微生物的發(fā)酵作用密切相關(guān)。乳酸菌的主要功能是通過糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸降低香腸的pH值以保證其微生物安全性，同時使纖維蛋白膠凝化，從而提高最終產(chǎn)品的硬度和內(nèi)聚性。GCC+有助于發(fā)酵香腸風味和色澤等典型特征的形成，其普遍具有較強的蛋白酶和酯酶活性，能促進肽、氨基酸、醛、游離脂肪酸的釋放，從而有效促進發(fā)酵香腸特殊風味的形成。過氧化氫酶可以除去部分乳酸菌產(chǎn)生的H2O2，防止產(chǎn)品中形成高鐵血紅素和膽綠素，從而穩(wěn)定產(chǎn)品的色澤并能夠防止脂肪的過度氧化[4]。酵母菌主要生長在香腸表面或者肉餡靠外部分，可以保護香腸不受濕度波動的干擾，促進香腸的干燥過程并防止過度氧化[5]。此外，酵母菌能夠促進蛋白水解和脂肪分解，從而影響香腸風味物質(zhì)的形成。傳統(tǒng)或自然干燥發(fā)酵香腸的生產(chǎn)不使用發(fā)酵劑，產(chǎn)品品質(zhì)高度依賴自然環(huán)境，為了提高最終產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性，并使生產(chǎn)過程標準化，常以外源微生物作為發(fā)酵劑投入生產(chǎn)。肉類發(fā)酵劑是一類含有活性或休眠微生物的制劑，能在肉類中發(fā)揮理想的代謝活動[6]。大多數(shù)商業(yè)肉用發(fā)酵劑為乳酸菌和GCC+（葡萄球菌（Staphylococcus）和微球菌）的混合物。

風味是發(fā)酵香腸最重要的品質(zhì)屬性之一。與熱加工產(chǎn)生的風味不同，發(fā)酵香腸的風味是由發(fā)酵和成熟過程中的化學反應和微生物代謝反應形成的[7]。發(fā)酵香腸的主要成分（蛋白質(zhì)和脂類）經(jīng)酶水解產(chǎn)生芳香化合物的前體物質(zhì)——游離脂肪酸和氨基酸。這些前體物質(zhì)作為化學反應和微生物反應的底物，產(chǎn)生揮發(fā)性風味物質(zhì)[8]。近20 年來，許多研究報道了發(fā)酵菌株對于發(fā)酵香腸風味的貢獻。Hugas等[9]指出接種GCC+菌株對于提升發(fā)酵香腸感官品質(zhì)是十分必要的。此外，Stahnke[10]、Beck[11]和Olesen[12]等描述了木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）通過氨基酸和游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性風味化合物來調(diào)節(jié)香氣的能力。本文根據(jù)現(xiàn)有研究對發(fā)酵香腸發(fā)酵、成熟過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的形成和發(fā)展以及與微生物代謝相關(guān)的反應進行概述，并總結(jié)了幾種主要微生物對發(fā)酵香腸揮發(fā)性的風味物質(zhì)的作用及影響機制，以期為發(fā)酵香腸風味的研究提供一定的參考。

1 發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味的形成

1.1 揮發(fā)性風味化合物前體物質(zhì)的生成

脂肪和蛋白質(zhì)分解是發(fā)酵香腸風味形成的基本生化反應[13]，為芳香化合物的產(chǎn)生提供前體物質(zhì)（游離脂肪酸和氨基酸）[14-15]。脂肪分解是指存在于肌肉和皮下組織中的脂質(zhì)部分（主要是甘油三酯和磷脂）的酶解。脂肪經(jīng)原料肉中內(nèi)源酶和微生物酶水解產(chǎn)生游離脂肪酸。與磷脂相比，甘油三酯水解產(chǎn)生更多的脂肪酸，酶解過程結(jié)束時檢測到的大部分游離脂肪酸來自甘油三酯部分[16]。中鏈（碳數(shù)為6～12）、長鏈（碳數(shù)為14～18）游離脂肪酸的濃度通常低于其感知閾值，因此對發(fā)酵香腸風味的貢獻很小，而短鏈脂肪酸（碳數(shù)小于6）會產(chǎn)生強烈的奶酪味或刺激性氣味[17]。蛋白質(zhì)水解包括內(nèi)源酶和微生物蛋白酶（外蛋白酶和內(nèi)蛋白酶）酶解肌漿和肌原纖維蛋白。由于酸性條件對微生物酶的抑制作用，僅有約40%的蛋白水解活性是由微生物酶產(chǎn)生[18]。內(nèi)肽酶酶解作用下產(chǎn)生多肽，多肽通過外肽酶的活性進一步降解為多肽和游離氨基酸[19]，這些多肽和游離氨基酸可產(chǎn)生苦味、甜味和鮮味。

1.2 揮發(fā)性風味化合物的生成

如圖1所示，發(fā)酵香腸中產(chǎn)生揮發(fā)性化合物的反應可以分為化學反應和微生物代謝反應兩類。化學反應包括脂肪酸自動氧化反應和美拉德反應等。微生物代謝反應可進一步分為碳水化合物發(fā)酵反應、氨基酸降解反應、β-氧化反應和葡萄球菌酯酶酶解[20]。每種反應對香味的貢獻取決于發(fā)酵香腸實際的加工參數(shù)。

圖1 發(fā)酵香腸中揮發(fā)性風味化合物的生成途徑Fig.1 Chemical and microbial reactions involved in volatile compound generation in fermented sausages

1.2.1 產(chǎn)生揮發(fā)性風味化合物的化學反應

發(fā)酵香腸中最重要的化學反應是脂肪的自動氧化反應，特別是多不飽和脂肪酸的氧化反應[20]。脂肪的自動氧化與脂肪酸的不飽和程度密切相關(guān)，這個過程產(chǎn)生氫過氧化物，氫過氧化物進一步分解為揮發(fā)性化合物（烷烴、醛、醇、酯和羧酸）[21]。由于醇的氣味閾值與其他羰基化合物相比較高，通常不被認為是發(fā)酵香腸風味的主要貢獻者。很多醛是由不飽和脂肪酸氧化形成的，多于6 個碳原子的醛來自游離脂肪酸的氧化。由于醛的氣味閾值低且在脂質(zhì)氧化中生成率很快，因此是產(chǎn)生特有香氣的成分之一[22]。雖然過度的脂肪自動氧化是發(fā)酵香腸品質(zhì)劣變的主要原因之一，但適度的脂肪氧化對發(fā)酵香腸的風味形成也是必不可少的[20]。發(fā)酵香腸中的美拉德反應是由還原糖和氨基化合物反應引發(fā)的。在肌肉轉(zhuǎn)化過程中，核糖核苷酸降解產(chǎn)生的核糖可作為參與美拉德反應的還原糖[23]，肽和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的游離氨基酸作為參與美拉德反應的氨基化合物。美拉德反應開始時產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物包括呋喃酮、糠醛、二羰基化合物等，進一步與胺、氨基酸、硫化氫、硫醇、氨等化合物反應產(chǎn)生不同的雜環(huán)化合物（吡啶、吡嗪、惡唑、噻吩、噻唑）[7]，其特點是氣味閾值低且有強烈的刺激性氣味。Strecker降解反應[10]與美拉德反應有關(guān)，美拉德反應中碳水化合物的降解產(chǎn)生的二羰基化合物存在下氨基酸的氧化脫氨基和進一步脫羧，最后生成醛類化合物[24]，與美拉德反應相比，氨基酸更易通過Stecker降解發(fā)生脫氨脫羧反應，這可能是許多羰基化合物，如分支醛2-甲基丁醛、3-甲基丁醛等的來源途徑。

1.2.2 產(chǎn)生揮發(fā)性化合物的微生物代謝反應

發(fā)酵香腸中的碳水化合物發(fā)酵主要由乳酸菌完成。乳酸菌經(jīng)代謝將發(fā)酵香腸中的碳水化合物（葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖糊精）轉(zhuǎn)化為乳酸和醋酸等有機酸，使發(fā)酵香腸pH值下降，肉蛋白發(fā)生膠凝化，從而提高香腸的硬度。乳酸菌通過丙酮酸代謝產(chǎn)生了乙酸、甲酸、乙醇、乙醛、2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二醇等化合物[25]，這些化合物與特定的風味有關(guān)。由氨基酸降解產(chǎn)生的揮發(fā)性風味物質(zhì)對干香腸的風味特性起著重要作用：一個主要的氨基酸降解反應是支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）的轉(zhuǎn)胺和脫羧，產(chǎn)生各自的支化醛、醇和酸[20]，如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等分別生成3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、2-甲基丙醛、苯甲醛及其醇、酸等衍生物，這些產(chǎn)物是發(fā)酵香腸典型風味成分的主要組成之一。酪氨酸和色氨酸的氨基酸側(cè)鏈降解產(chǎn)生酚類和吲哚，其他氨基酸也可經(jīng)微生物代謝轉(zhuǎn)化為各自對應的醛類化合物。微生物對氨基酸的降解可以由發(fā)酵過程中存在的不同微生物種群來完成，葡萄球菌屬和酵母菌均可降解氨基酸并產(chǎn)生具有重要香氣貢獻的揮發(fā)性化合物[18]。胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的降解產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物，甲硫氨酸產(chǎn)生甲硫醇、甲硫和氧化產(chǎn)物，如二甲基二硫和二甲基三硫。這些化合物的特征是氣味閾值很低，具有類似熟肉、硫磺、卷心菜和洋蔥氣味。此外，微生物發(fā)酵過程中氨基酸分解代謝產(chǎn)生的酸和醇類化合物在葡萄球菌酯酶催化作用下生成酯類化合物[25]。游離脂肪酸通過微生物酶作用經(jīng)β-氧化反應被降解，從而產(chǎn)生短鏈脂肪酸和β-酮酸，β-酮酸通過微生物（主要是葡萄球菌屬）脫羧反應降解為甲基酮，然后進一步降解為仲醇[18,25]。仲醇通常呈青草、木材、脂肪、花香和蘑菇味，但其閾值高，因此對整體香氣的貢獻較?。欢谆臍馕堕撝档?，具有果味和脂肪氣味，對發(fā)酵香腸的典型風味的形成有重要影響。此外，葡萄球菌酯酶還能夠水解酯類化合物生成醇和酸[24]。

1.3 揮發(fā)性風味化合物的提取與分離

對發(fā)酵香腸中揮發(fā)性化合物的定性、定量分析是揭示發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質(zhì)組成和含量的必要手段。提取技術(shù)的使用是必不可少的，但是實驗分析得到的樣品揮發(fā)性化合物組成高度依賴于所使用的提取技術(shù)，對同一樣品使用不同的提取技術(shù)會產(chǎn)生不同的結(jié)果。表1共整理了6 種發(fā)酵香腸風味物質(zhì)的提取技術(shù)。固相微萃取技術(shù)自20世紀90年代首次出現(xiàn)以來[26]，在香氣分析領(lǐng)域得到了廣泛的應用。這種技術(shù)包括將揮發(fā)性化合物吸附到涂有不同選擇性材料的二氧化硅纖維中，而后揮發(fā)性化合物由纖維被解吸到氣相色譜儀的進樣口。使用固相微萃取提取的香氣成分組成取決于揮發(fā)性化合物在頂空與基質(zhì)之間以及頂空與吸附纖維之間的分布系數(shù)。然而，纖維在平衡狀態(tài)下吸附的化合物的數(shù)量與樣品中總揮發(fā)性成分濃度直接相關(guān)，但只要知道每種揮發(fā)性成分的分布系數(shù)，就可以計算出其濃度。固相微萃取技術(shù)在發(fā)酵香腸風味提取中應用十分廣泛，曹辰辰等[27]應用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)提取并檢測發(fā)酵香腸中的揮發(fā)性化合物，共分析出134 種揮發(fā)性化合物，其中包括醛類18 種、醇類24 種、酸類10 種、酯類25 種、酮類10 種、碳氫化合物41 種、其他6 種。

表1 發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質(zhì)提取技術(shù)Table 1 Extraction techniques used for analysis of flavor substances in fermented sausages

1.4 揮發(fā)性風味化合物的定性與定量分析

風味物質(zhì)的分離，一般采用氣相色譜柱法，可分離的組分多達百種，而對于單一組分的定性分析常采用質(zhì)譜法、紅外光譜、紫外光譜法、核磁共振波譜法。色譜分析也可與上述儀器聯(lián)用，快速鑒定分離成分。目前常用的檢測方法有GC-MS法、氣相色譜與嗅覺檢測聯(lián)用（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法和電子鼻檢測法。GC-MS儀是一種將質(zhì)譜和氣相色譜組合使用的方法，它是目前最廣泛使用的風味檢測方法之一，其利用氣相色譜分離混合物的組分，并且可以使用來自標準光譜的數(shù)據(jù)來比較質(zhì)譜對香氣化合物定性分析。Olivares等[29]采用頂空固相微萃取-GC-MS聯(lián)用技術(shù)對干發(fā)酵香腸發(fā)酵、成熟過程產(chǎn)生的香氣化合物進行了分析。近年來，風味研究的方向是闡明對食品風味貢獻度較大的化合物，香氣化合物貢獻一般通過氣味濃度與其氣味閾值的比值計算氣味活性值（odor activity value，OAV）得到。在含脂肪肉類中，高脂肪比例對氣味閾值計算有很大影響。然而，OAV沒有考慮揮發(fā)性化合物之間產(chǎn)生的協(xié)同效應。GC-O等方法可用于從復雜混合物中選擇芳香活性成分，這是通過使用人的鼻子作為檢測器的嗅探端口對從氣相色譜儀洗脫的化合物進行篩選來完成的。該方法結(jié)合不同的分析技術(shù)（閾值稀釋分析法、檢測頻率法、強度法）鑒定出食品中大量揮發(fā)性成分中真正具有氣味活性的成分，以及各氣味成分在不同濃度下對整體氣味的貢獻大小，這些都是用其他儀器檢測難以做到的。在GC-O分析中，氣相色譜柱的流出物由一名描述洗脫化合物氣味的專家進行分析。根據(jù)嗅覺測定技術(shù)的不同，所得到的香氣圖將包括香氣描述、強度、持續(xù)時間等。感官分析中人的鼻子一直是評價氣味的重要手段，但是準確性及靈敏度卻受到多種因素的影響，一方面此方法的主觀性強、重復性差；另一方面，鼻子對氣味具有適應性，容易出現(xiàn)疲勞而影響評判結(jié)果。隨著計算機科學和仿生的發(fā)展，電子鼻彌補了這一不足。電子鼻是模擬人的嗅覺形成過程，由傳感器陣列、信號預處理單元和模式識別系統(tǒng)3 個系統(tǒng)組成。與其他常規(guī)儀器分析方法相比，電子鼻分析具有樣品無需前處理、不受人主觀因素影響、響應時間短、檢測速度快、重復性好等優(yōu)點，能夠很好地應用于在線檢測。孫學穎等[30]利用固相微萃取-GC-MS聯(lián)用結(jié)合電子鼻、電子舌技術(shù)對不同處理組羊肉發(fā)酵香腸樣品的風味進行測定，4 組香腸樣品中共鑒定出49 種揮發(fā)性風味物質(zhì)，且結(jié)果表明基于電子鼻技術(shù)可實現(xiàn)對發(fā)酵香腸樣品快速區(qū)分。對風味物質(zhì)的定量分析，常用方法有歸一法、內(nèi)標法、外標法。內(nèi)標法實驗誤差小，結(jié)果對比性強，將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標物，再根據(jù)相應峰面積或峰高比求出待測組分的含量，是發(fā)酵香腸風味分析中常用的定量方法。

1.5 發(fā)酵香腸中的揮發(fā)性化合物

發(fā)酵香腸中揮發(fā)性化合物主要包括醛類、醇類、酯類、酮類、酸類、氮類和硫類化合物、呋喃類、萜烯類和內(nèi)酯。醛類物質(zhì)的閾值較低，主要來源于油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸的氧化以及氨基酸降解，是發(fā)酵香腸中最重要的風味化合物[31]。其中己醛是發(fā)酵香腸中含量最高、最主要的醛類，被描述為青草味，其含量能夠反映脂肪的氧化程度[32]，戊醛、庚醛、辛醛和癸醛分別具有脂香、奶香、鮮草香和甜香味。酮類化合物有助于奶香味的產(chǎn)生，3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二酮是與發(fā)酵香腸風味相關(guān)的酮類化合物，具有黃油味、蘑菇和香草等氣味。醇類化合物通常對發(fā)酵香腸的香氣貢獻很小。Gianelli等[33]報道稱這可能是由于醇類化合物具有較高的檢測閾值。發(fā)酵香腸中最強烈的酸類風味化合物是乙酸、丁酸和3-甲基丁酸[31,34-36]。許多酯類化合物被認為是發(fā)酵香腸中水果味和焦糖味的來源，其中，丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和戊酸乙酯對發(fā)酵香腸的貢獻較大[35]。硫化合物的特征是具有低閾值和特有的香味，這種特有的香味通常被描述為大蒜、洋蔥、煮土豆、煮肉味。發(fā)酵香腸中氣味最強烈的硫化物是二烯丙基硫化物、二烯丙基二硫化物、二甲基二硫化物、3-甲基硫代丙醇和甲硫醇[35-37]。3-甲基丁醛與含硫化合物反應，可產(chǎn)生類似培根的香氣，且3-甲基丁醛的閾值很低，其濃度對發(fā)酵香腸的典型風味有重要影響，可作為量化菌株產(chǎn)香能力的指標。發(fā)酵香腸中的萜烯類化合物能具有植物芳香，如樹脂、松樹和檸檬味，其主要來源于香辛料，通常在含有辣椒等香辛料的發(fā)酵香腸中被檢測出來。芳樟醇也被認為是一種氣味較強的揮發(fā)性風味物質(zhì)[38]。呋喃化合物有助于產(chǎn)生熟肉的香氣，其中，2-戊基呋喃具有的香氣最強烈，賦予香腸洋蔥味、腐臭的氣味。Olivares等[39]發(fā)現(xiàn)消費者偏好的高脂肪含量干發(fā)酵香腸香氣與香味化合物己醛、2-壬烯醛、2,4-壬烯醛、丁酸乙酯和1-辛烯-3-醇有關(guān)，這幾種化合物有助于青草味、脂肪味、水果味和蘑菇味的形成。表2整理了發(fā)酵香腸中的揮發(fā)性風味物質(zhì)及其可能的形成機制。

表2 發(fā)酵香腸中檢測出的揮發(fā)性化合物Table 2 Aroma volatile compounds detected in fermented sausages

續(xù)表2

以上通過對風味化合物前體物質(zhì)的生成、風味化合物生成途徑以及定性和定量分析，對發(fā)酵香腸風味研究進行了深入的探討。然而，為了選擇合適的原料、發(fā)酵劑和其他條件以提升發(fā)酵香腸的風味，還需要了解關(guān)于揮發(fā)性風味化合物的形成途徑。

2 發(fā)酵菌株對發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味的影響

2.1 乳酸菌對發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味的影響

乳酸菌在香腸發(fā)酵過程中起主導作用。乳酸菌可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸、乙酸等，從而降低產(chǎn)品的pH值以提高產(chǎn)品的微生物安全性，同時可以使蛋白質(zhì)發(fā)生凝膠化以加快香腸的干燥速度，終產(chǎn)物的切片性、硬度和內(nèi)聚性都有所提高[46]。常用作肉品發(fā)酵劑的乳酸菌有清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）等。乳酸菌對發(fā)酵香腸的安全性有重大意義，不僅可以通過產(chǎn)生有機酸降低肉品基質(zhì)的pH值，也可產(chǎn)生細菌素抑制病原微生物的生長。Hebert等[47]公布了從手工發(fā)酵香腸中分離出的細菌素生產(chǎn)菌株L.curvatusCRL705的基因組序列（1.83 Mb），該菌株可產(chǎn)生雙組分乳桿菌素705細菌素和AL705，AL705是一種具有抗菌活性的細菌素[48]。乳酸菌在發(fā)酵香腸中具有強的定植能力，占有絕對的數(shù)量優(yōu)勢。Sanz等[49]報道了一種存在于清酒乳桿菌中精氨酸特異性的氨基肽酶，該酶對游離氨基酸的釋放起著重要作用，可以進一步進入精氨酸脫亞胺酶途徑。L.sakei中精氨酸分解代謝所需的編碼蛋白的基因聚集成簇，由精氨酸誘導，轉(zhuǎn)錄時受到葡萄糖抑制。Chaillou等[50]在L.sakei基因組中發(fā)現(xiàn)了第2種可能的精氨酸脫氨酶途徑，該途徑涉及兩種精氨酸脫氨酶，可促進精氨酸的代謝，從而提高清酒乳桿菌在肉類環(huán)境中的競爭力。相較于GCC+，乳酸菌對發(fā)酵香腸風味的主要貢獻似乎僅限于碳水化合物的分解代謝。近些年來，幾種肽酶在乳酸菌中純化和鑒定[49,51]，這些內(nèi)、外肽酶的作用有助于增加影響風味發(fā)展的游離氨基酸的濃度，使得乳酸菌潛在的產(chǎn)良好風味物質(zhì)的能力逐漸引起關(guān)注。Sinz等[51]研究發(fā)現(xiàn)清酒乳桿菌TMW 1.1322、TMW 1.1383、TMW 1.1393具有不同程度代謝某些氨基酸、多肽的能力。Demeyer等[52]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌中的外肽酶與肌肉中的氨肽酶共同促進了游離氨基酸的產(chǎn)生，具有潛在的促進風味物質(zhì)形成的能力。Hu Yingying等[53]研究了分離自哈爾濱風干腸的戊糖片球菌、短乳桿菌、彎曲乳桿菌及發(fā)酵乳桿菌在豬肌漿蛋白提取物中分解肌漿蛋白形成風味物質(zhì)的潛力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些乳酸菌能夠分解肌漿蛋白形成風味物質(zhì)及其前體，其中戊糖乳桿菌的分解能力最強，能夠產(chǎn)生更多可溶肽和游離氨基酸。Papamanoli等[54]從希臘香腸中分離出的L.sakei、L.curvatus和L.plantarum均顯示出高的亮氨酸和纈氨酸氨基肽酶活性。然而，對于乳酸菌利用風味前體物質(zhì)（如支鏈氨基酸等）進一步分解代謝生成揮發(fā)性風味化合物的研究鮮有報道。Larrouture等[55]研究發(fā)現(xiàn)清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌以及戊糖片球菌對亮氨酸的分解代謝率很低，對于3-甲基丁醇等典型香腸香氣化合物的形成中幾乎不發(fā)揮作用。Díaz等[56]稱游離氨基酸含量的增加不足以顯著增加香氣化合物含量，因為還需要存在氨基酸降解機制以產(chǎn)生更多的風味化合物。綜合而言，部分乳酸菌可利用肉類蛋白質(zhì)產(chǎn)生更多的寡肽和游離氨基酸，為風味化合物的生成提供前體物質(zhì)。Chen Qian等[57]以乳酸菌水解肌漿蛋白為例解釋了風味化合物合成的可能途徑，具體如圖2所示。首先，肌漿蛋白被乳酸菌分泌的蛋白酶和肽酶降解為寡肽和氨基酸，一旦跨細胞膜轉(zhuǎn)運，寡肽和氨基酸將被細胞內(nèi)酶進一步降解。隨后，氨基酸經(jīng)氨基轉(zhuǎn)移酶[58]或脫氨酶作用代謝成α-酮酸。作為中心中間體，α-酮酸可直接或間接脫羧形成相應的醛。直接方法是通過α-酮酸脫羧酶的非氧化脫羧，間接方法是α-酮酸脫氫酶和?；っ傅难趸擊茸饔?，導致形成羧酸，再于醛脫氫酶的作用下生成醛。醇脫氫酶可催化醛轉(zhuǎn)化為相應的醇，醇再通過酰基轉(zhuǎn)移酶或酯酶的作用與羧酸反應生成酯。在整個代謝過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性的醛、醇、羧酸以及酯類化合物將影響發(fā)酵香腸整體的風味輪廓。表3整理了各類發(fā)酵香腸中不同細菌發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味的主要影響。

圖2 乳酸菌分解肌漿蛋白產(chǎn)生揮發(fā)性風味物質(zhì)的可能代謝途徑Fig.2 Possible metabolic pathways of lactic acid bacteria decomposing sarcoplasmic proteins to produce volatile flavor compounds

表3 細菌發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味的影響Table 3 Effect of lactic acid bacteria on volatile flavor of fermented sausages

續(xù)表3

2.2 葡萄球菌對發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味的影響

肉品發(fā)酵過程中的GCC+主要包括葡萄球菌和微球菌，其主要作用為提高色澤穩(wěn)定性，縮短加工時間以及促進風味的形成。從發(fā)酵香腸中分離的GCG+主要是非致病性凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci，CNS），如木糖葡萄球菌、馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、肉葡萄球菌以及腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticu）[72-74]。木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌是常被用作發(fā)酵劑的GCC+，它們在肉類發(fā)酵過程中具有很強的競爭力，能夠在高鹽、低溫等環(huán)境脅迫下生存。葡萄球菌主要通過其硝酸鹽還原酶活性使發(fā)酵香腸呈現(xiàn)穩(wěn)定的紅色[75]。此外，葡萄球菌還有助于其他感官品質(zhì)的形成，如質(zhì)地和風味[76]是在蛋白質(zhì)和脂類代謝相關(guān)酶的作用下形成的。之前的研究已經(jīng)證明，發(fā)酵香腸的香味可由不同的葡萄球菌調(diào)節(jié)[18,77]。

Hugas等[9]強調(diào)了選用GCC+菌株作為肉用發(fā)酵劑以確保產(chǎn)品感官質(zhì)量的必要性。其對風味的貢獻主要源于以下幾種反應類型：碳水化合物發(fā)酵、氨基酸代謝、脂質(zhì)氧化及酯酶催化反應。碳水化合物經(jīng)細菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸等有機酸，降低pH值從而使得肉蛋白凝固。這一過程中的主要角色由乳酸菌承擔，而葡萄球菌也可緩慢地利用碳水化合物（圖3），并將其轉(zhuǎn)換為有機酸以及揮發(fā)性香氣化合物，如2,3-丁二酮、乙醛、乙偶姻可以為發(fā)酵香腸帶來黃油味、奶酪味等風味。

圖3 葡萄球菌的葡萄糖代謝途徑[78-80]Fig.3 Glucose metabolism in Staphylococcus[78-80]

Stahnke[10]、Beck[11]和Olesen[12]等描述了木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌菌株通過將氨基酸和游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性風味化合物調(diào)節(jié)香氣的能力。與碳水化合物代謝相比，氨基酸代謝在發(fā)酵香腸芳香化合物的產(chǎn)生中起著更為重要作用，其產(chǎn)物被認為與干發(fā)酵香腸的獨特風味形成有關(guān)[62]。木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌通過將氨基酸（特別是支鏈氨基酸：亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性風味化合物來調(diào)節(jié)香氣，在此過程中支鏈氨基酸降解為甲基支化醛、醇和酸[11]，圖4是亮氨酸經(jīng)微生物代謝向芳香化合物的轉(zhuǎn)化途徑，所產(chǎn)生的3-甲基丁醇、3-甲基丁醛和3-甲基丁酸被分別描述為果香、奶酪味、腳臭味，通常與發(fā)酵香腸的香氣有關(guān)。Ravyts等[63,81]報道了3-甲基-1-丁醇對香腸風味復雜性的重要貢獻，該化合物同樣來源于葡萄球菌的亮氨酸分解代謝，如木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌。此外，以S.carnosus833作為發(fā)酵劑的發(fā)酵香腸已經(jīng)被證明可以產(chǎn)生更多的甲基酮、支鏈醛及醇類[10]，可將意大利干發(fā)酵香腸的成熟時間縮短兩周以上。

圖4 亮氨酸轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性化合物的途徑[62,82]Fig.4 Pathway for the conversion of leucine into aroma compounds[62,82]

發(fā)酵過程中脂肪分解主要由內(nèi)源性脂肪酶負責[83]，但葡萄球菌也被認為起到了重要作用。脂肪經(jīng)酶解產(chǎn)生游離脂肪酸，而后游離脂肪酸通過不完全的β-氧化作用被葡萄球菌酶降解。游離脂肪酸首先被氧化為烯酰-輔酶A（coenzyme A，CoA），烯酰-CoA經(jīng)水合作用生成羥?；?CoA，再進一步氧化為酮酰-CoA。酮?；?CoA酯通過硫酯酶作用被脫酰基為β-酮酸、短鏈游離脂肪酸和CoA[66]。β-酮酸由葡萄球菌通過氨基酸脫羧反應產(chǎn)生甲基酮，例如2-戊酮、2-己酮和2-庚酮，這有助于發(fā)酵香腸風味的形成[84]。甲基酮可以進一步轉(zhuǎn)化為仲醇。S?ndergaard等[77]報道添加木糖鏈球菌產(chǎn)生3-甲基-1-丁醇、二乙?；?、2-丁酮、乙酰丁酮、苯甲醛、苯乙酮和甲基酮（2-戊酮和2-庚酮）等重要風味化合物，可以為發(fā)酵香腸帶來更“圓潤”的風味，在南歐常被用于生產(chǎn)芳香型香腸。

2.3 酵母菌對發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味的影響

在發(fā)酵香腸成熟期間，酵母是主要的微生物群之一。其中，假絲酵母屬（Candida）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）和耶氏酵母屬（Yarrowia）是最常見的屬[85]。酵母主要定植在發(fā)酵香腸表面或者肉餡靠外部分，可以在香腸外殼表面形成一層膜，防止產(chǎn)品過度脫水，并有利于最終風味的形成。真菌的生長使香腸表面形成有于發(fā)酵成熟的微環(huán)境，減少香腸表面黏連和脂質(zhì)氧化[86]。酵母菌具有較強的脂肪和蛋白質(zhì)水解活性，具有賦予發(fā)酵香腸獨特風味的潛力。其中，無論是單獨接種還是作為混合發(fā)酵劑的一部分進行混合接種發(fā)酵，德巴利氏酵母屬均可廣泛參與肌原纖維蛋白的水解[87]。Santos等[88]研究了分離自豬肉中的漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）水解肌漿蛋白的活性，結(jié)果表明漢遜德巴利酵母具有水解肌漿蛋白的活性，可以增加豬肉中極性和非極性肽以及游離氨基酸的生成量，其中Tyr、Val、Met、Leu、Ile、Phe和Lys含量增幅均超過50%。Patrignani等[89]報道，耶氏酵母屬具有較強的脂質(zhì)和蛋白水解活性，對于游離脂肪酸釋放有積極作用，可進一步轉(zhuǎn)化為理想的風味化合物。

Olesen等[90]研究了產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）對發(fā)酵香腸香味形成的影響，觀察到其具有較高代謝活性，增加了香腸中揮發(fā)性化合物，特別是酯類化合物的含量；此外，C.utilis代謝支鏈氨基酸纈氨酸后產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物（2-甲基丙酸和2-甲基丙醇等）對香腸香氣形成有重要影響。支鏈氨基酸作為許多揮發(fā)性風味化合物的前體物質(zhì)，其代謝產(chǎn)物是發(fā)酵香腸典型風味的主要組成之一。Durá等[91]發(fā)現(xiàn)漢遜德巴利酵母可以通過利用支鏈氨基酸生成揮發(fā)性化合物這一途徑影響發(fā)酵香腸的香氣輪廓，但食用鹽含量會對其產(chǎn)生負面影響。Flores等[92]通過接種漢遜德巴利酵母和混合細菌發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵香腸，他們觀察到2-甲基-丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯等化合物的含量顯著增加，這3 種物質(zhì)都與香腸的香味有關(guān)，此外發(fā)酵香腸中由脂質(zhì)氧化生成的揮發(fā)性化合物（如己醛）含量顯著減少，同時乙酯生成量顯著上升。這一結(jié)果表明漢遜德巴利酵母能抑制脂質(zhì)氧化，并促進酯類化合物的產(chǎn)生。Cano-García等[93]對酵母菌提升風味的潛力進行了深入探討。他們的研究表明，酵母菌特別是漢遜德巴利酵母具有較好的提升風味潛力，在改善、提升香腸風味亦或使香腸風味多樣化上具有較好的應用前景，且主要通過抑制脂質(zhì)氧化、延緩酸敗和產(chǎn)生醇類、酮類、酯類等風味物質(zhì)而賦予香腸良好風味。表4整理了不同發(fā)酵香腸中酵母菌對發(fā)酵香腸風味形成的影響。

表4 酵母對發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味形成的影響Table 4 Effect of yeast on volatile flavor of fermented sausages

3 基于高通量測序技術(shù)對揮發(fā)性特征風味與菌群相關(guān)性的分析

發(fā)酵香腸的發(fā)酵過程屬于開放式多菌種混合發(fā)酵體系，微生物是發(fā)酵的主體，也是風味物質(zhì)的主要生產(chǎn)者。長期以來，研究者主要采用基于純培養(yǎng)方法對微生物進行分析，依靠形態(tài)學、培養(yǎng)特征、生理生化特性的比較對香腸發(fā)酵過程中微生物進行研究，然而這種方法只適用于可培養(yǎng)的微生物且效率低下。20世紀90年代初，以聚合酶鏈式反應為基礎(chǔ)的分子生態(tài)學的發(fā)展帶來了描述細菌群落的新方法，例如隨機擴增多態(tài)性DNA-聚合酶鏈式反應、實時聚合酶鏈式反應、溫度梯度凝膠電泳、變性梯度凝膠電泳）[100-101]。這些基于聚合酶鏈式反應的分子生態(tài)學方法比傳統(tǒng)依賴于培養(yǎng)的方法對發(fā)酵香腸生物群落的認識更加全面。Fonseca[100]和Cocolin[102]等使用變性梯度凝膠電泳在發(fā)酵香腸中鑒定乳酸菌，包括乳桿菌清酒、彎曲乳桿菌、植物乳桿菌，以及腸球菌、片球菌和金黃色葡萄球菌幾個物種。但是這些方法也存在其自身的局限性，方法本身需要進行凝膠電泳，圖譜的復雜性造成了有限的分辨率和靈敏性且工作量較大費時費力；自2005年以來，以羅氏公司454測序技術(shù)、Illumina公司的Solexa測序技術(shù)和ABI公司的Solid測序技術(shù)為代表的高通量測序技術(shù)相繼誕生，并迅速廣泛應用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物群落的宏基因組研究中。迄今為止已有部分研究者使用高通量測序技術(shù)對發(fā)酵香腸的微生物多樣性進行分析。Po?ka等[103]通過高通量測序揭示了典型意大利香腸中不同成熟階段的細菌多樣性。Wang Taojun等[104]通過高通量測序技術(shù)對意大利薩拉米香腸、中式臘腸等發(fā)酵香腸的細菌群落進行了分析，結(jié)果表明中式臘腸比意大利薩拉米香腸的細菌種類更為豐富。臘腸的主要細菌為葡萄球菌和乳酸菌，乳酸菌包括乳酸菌、乳桿菌、片球菌和乳球菌。葡萄球菌屬的操作分類單元在意大利臘腸中最多，高達97.45%。

利用高通量測序技術(shù)能詳細、系統(tǒng)地分析發(fā)酵香腸中微生物群落的結(jié)構(gòu)以及群落功能，在此基礎(chǔ)上多元統(tǒng)計學的應用，如偏最小二乘法回歸分析、偏最小二乘判別分析和正交偏最小二乘法回歸分析等，可進一步挖掘數(shù)據(jù)背后的生物學意義，建立起發(fā)酵香腸中微生物菌群與特征風味物質(zhì)的相關(guān)性聯(lián)系。米瑞芳等[105]對4 種傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸肉中細菌16S rDNA V3～V4區(qū)進行高通量測序，并結(jié)合電子鼻和固相微萃取-GC-MS分析等手段，檢測出揮發(fā)性物質(zhì)包括酸類、醇類、醛類、酯類、酮類、萜烯類等化合物共126 種，結(jié)果表明4 種酸肉樣品之間的菌屬種類和相對豐度均存在一定的差異性，同時酸肉樣品中的風味物質(zhì)在種類和含量上也存在較大差異性；且乳桿菌、魏斯氏菌等微生物可能影響酸肉中醇類、酯類和酸類揮發(fā)性風味物質(zhì)，從而影響酸肉的風味品質(zhì)。郭壯等[58]采用電子鼻對不同發(fā)酵時間臘腸風味品質(zhì)進行評價，并采用MiSeq高通量測序技術(shù)對細菌的多樣性進行解析，主坐標分析和腸型分析的結(jié)果顯示不同發(fā)酵時間臘腸樣品在空間排布上和基于臘腸風味指標的聚類結(jié)果相近。由此說明臘腸樣品中的細菌影響臘腸風味品質(zhì)的形成。此外，通過將優(yōu)勢細菌屬相對豐度和風味指標進行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬相對豐度與電子鼻傳感器W1S、W2S（對乙醇靈敏）和W3S（對烷烴靈敏）的響應強度呈顯著正相關(guān)，葡萄球菌屬相對豐度與W1S響應強度之間呈顯著負相關(guān)，而魏斯氏菌屬和環(huán)絲菌屬相對豐度與電子鼻傳感器W2W（對含硫化合物靈敏）響應強度之間存在顯著負相關(guān)關(guān)系。Hu Yingying等[106]發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)干發(fā)酵香腸中的主要揮發(fā)性化合物與核心細菌（乳酸乳球菌、植物乳桿菌、消化乳桿菌、清酒乳桿菌、魏斯氏菌屬）之間存在顯著相關(guān)性，這些核心菌群促進了主要揮發(fā)性化合物的形成。Hu Yingying等[107]采用高通量測序技術(shù)分析了東北地區(qū)5 種發(fā)酵香腸的細菌菌落組成和多樣性，并采用頂空固相微萃取-GC-MS法檢測出包括醇、酸、醛、酮、酯和萜烯類共120 種揮發(fā)性化合物。此外，基于Spearman相關(guān)分析，探索了核心細菌與主要揮發(fā)性化合物之間的潛在相關(guān)性，結(jié)果表明：干香腸中的主要揮發(fā)性化合物與核心細菌（乳酸乳球菌、植物乳桿菌、消化乳桿菌、清酒乳桿菌、希臘魏斯氏菌）之間存在顯著相關(guān)性，這些核心菌群促進了主要揮發(fā)性化合物的形成。

4 結(jié) 語

隨著我國改革開放的深入，我國的肉類工業(yè)得到了飛速發(fā)展，國民對于高檔發(fā)酵肉制品需求量不斷提升是國內(nèi)發(fā)酵香腸發(fā)展的機遇。自20世紀80年代起，眾多國內(nèi)肉品企業(yè)開始引入西式發(fā)酵香腸，如切片薩拉米、即食發(fā)酵香腸等，以滿足我國消費者對中高檔發(fā)酵肉制品的需求。但我國消費者和歐美消費者對風味的需求存在較大差異使得發(fā)酵香腸未得到我國消費者的充分認可。因此，在引進西式發(fā)酵香腸先進技術(shù)的同時，開發(fā)“中國化”的風味是目前我國肉品企業(yè)面對的挑戰(zhàn)。發(fā)酵香腸風味的形成與發(fā)展與發(fā)酵過程中微生物群落的代謝活動密切相關(guān)，在繼續(xù)開展優(yōu)良肉用發(fā)酵劑篩選工作的同時還應明確：主要微生物在整個發(fā)酵過程中的動態(tài)變化以及與風味物質(zhì)變化之間是否有關(guān)聯(lián)性；主要的風味物質(zhì)是由哪些微生物產(chǎn)生，通過何種代謝途徑產(chǎn)生。只有明確了上述核心問題，對微生物群落結(jié)構(gòu)、微生物與風味物質(zhì)的相關(guān)性進行深度分析與挖掘，搭建起菌群與風味物質(zhì)的應答關(guān)系，才能有針對性地對發(fā)酵香腸的風味品質(zhì)進行調(diào)控，保證發(fā)酵香腸的產(chǎn)量和質(zhì)量。