陳 忱

北大荒完達山乳業(yè)股份有限公司質(zhì)檢中心，黑龍江哈爾濱 150000

0 引言

維生素A又名視黃醇，化學式C20H30O。維生素A是一種必需營養(yǎng)元素[1]，具有廣泛的生理功能，包括參與視覺過程、細胞增殖和分化、細胞間信息交流、器官與組織的生長、生殖以及免疫系統(tǒng)功能[2，3]。目前，維生素A缺乏仍然是許多發(fā)展中國家所面臨的一項重要的公共衛(wèi)生問題，嚴重威脅著嬰幼兒的生長發(fā)育[4]。

目前，關(guān)于母乳和牛乳中維生素A含量測定的方法最常用的是高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。相對于傳統(tǒng)的比色法和苯并芘內(nèi)標定量法，這兩種方法都能更好的規(guī)避掉原有方法中分析法儀器配置復(fù)雜、靈活性差、分析時間太長，易造成維生素A回收率低的弊端。又由于超高效液相色譜-串聯(lián)色譜法（HPLC-MS/MS）對于樣品的前處理復(fù)雜，檢測成本高，不利于廣泛推廣。因此，本文采用高效液相色譜法測定，此方法前處理簡單、靈敏度高、易改進分離條件。

采用《GB 5009.82—2016食品安全國家標準食品中維生素A、D、E的測定》（第一法食品中維生素A和維生素E的測定反向高效液相色譜法）進行牛乳及母乳在初乳期、過渡期和成熟期3個不同時期中維生素A的含量變化，并對數(shù)據(jù)進行比較分析，為嬰幼兒配方乳粉母乳化提供相關(guān)技術(shù)參考。試樣在前處理過程中先經(jīng)皂化（含淀粉先用淀粉酶酶解）、提取、凈化、濃縮后，再通過C18色譜柱反相液相色譜柱分離，紫外檢測器檢測，外標法定量。

1 材料與方法

1.1 儀器與標準品

1.1.1 儀器

高效液相色譜：賽默飛UltiMate 3000；水浴磁力恒溫攪拌器：METTLER TOLEDO生產(chǎn)MP220；分液漏斗萃取凈化振蕩器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；氮吹儀；渦旋混合器：IKA VORTEX生產(chǎn)，型號GENIUS 3。

1.1.2 維生素A標準品

維生素A（C20H30O，CAS號：68-26-8）：純度≥95%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準物質(zhì)；維生素A儲備液：濃度1.0mg/mL；維生素A工作液：濃度分別為2.5000μg/mL、5.0000μg/mL、10.0000μg/mL、15.0000μg/mL、20.0000μg/mL、25.0000μg/mL。

1.2 試劑

超純水：Millipore純水機制備；甲醇：SK生產(chǎn)，色譜純；石油醚：科密歐生產(chǎn)，優(yōu)級純；2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）：科密歐生產(chǎn)，優(yōu)級純。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 母乳采集

《食品營養(yǎng)和檢測》一書提到，維生素A含量在母乳中隨著哺乳期時間變化而變化，根據(jù)人泌乳期分為初乳期（產(chǎn)后0～9天內(nèi)）、過渡期（產(chǎn)后9～30天）、成熟期（2～5月）。母乳采樣分為3組，每組進行10個不同樣本測定[5]。

母乳的采集對象為產(chǎn)后0～12月健康產(chǎn)婦。以“知情自愿”為原則，乳母飲食均衡，奶水充足，無重大急慢性遺傳傳染病，無任何哺乳禁忌癥[6]。

1.3.2 牛乳采集

選擇來自北大荒完達山乳業(yè)股份有限公司天然有機牧場的10頭處于初乳期（產(chǎn)后0～14天）的奶牛進行牛乳采集。

1.4 樣品前處理與測定

1.4.1 樣品處理

處理過程應(yīng)避免紫外光照，盡可能避光操作，提取過程應(yīng)在通風柜中操作。

（1）皂化

稱取50.00g（精確至0.01g）液體試樣于150mL平底燒瓶中，固體試樣需加入約20mL溫水，混勻，再加入1.00g抗壞血酸和0.10gBHT，混勻，加入40mL無水乙醇，加入10mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，混勻后于60℃恒溫水浴震蕩皂化45.000min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。

（2）提取

將皂化液用30mL水轉(zhuǎn)入250mL的分液漏斗中，加入50mL石油醚，振蕩萃取5.000min，將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一250mL的分液漏斗中，加入50mL的石油醚再次萃取，合并醚層。

（3）洗滌

用約100mL水洗滌醚層，約需重復(fù)3次，直至將醚層洗至中性（可用pH試紙檢測下層溶液pH值），去除下層水相。

（4）濃縮

將洗滌后的醚層經(jīng)無水硫酸鈉（約3.00g）濾入250mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，用約15mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，并將其接在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于40℃水浴中減壓蒸餾濃縮，待瓶中醚液剩下約2mL時，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮氣吹至近干。用甲醇分次將蒸發(fā)瓶中殘留物溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，定容至刻度。溶液過0.22μm有機系濾膜后供高效液相色譜測定維生素A。

1.4.2 分離條件（反相液相色譜條件）

色譜柱：C18柱（柱長250.0mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm）；柱溫：25℃；流動相：甲醇；流速：1mL/min；紫外檢測波長：維生素A為325nm；進樣量：10μL。

2 結(jié)果分析

2.1 維生素A目標峰的確定

通過采用上述方法對樣品和標準品進行處理，圖譜見圖1、2?？梢钥闯鼍S生素A標準品和樣品出峰時間均為3.297min。通過對不同時期樣品的譜圖進行分析，發(fā)現(xiàn)維生素A在該保留時間與其他峰都得到較好的分離，該保留時間內(nèi)沒有檢測到干擾峰，并驗證了此方法的有效性。因此，可以確定母乳中維生素A目標峰的保留時間為3.297min。

圖1 維生素A標準品圖譜

圖2 含維生素A母乳圖譜

2.2 標準曲線、檢出限及母乳定量重復(fù)性

根據(jù)實驗檢測濃度的要求，測量范圍應(yīng)覆蓋方法的最低濃度水平（定量限）和關(guān)注濃度水平，確定維生素A標準曲線濃度范圍為0.0958μg/mL，0.1915μg/mL，0.3831μg/mL，0.7661μg/mL，1.5323μg/mL，1.9153μg/mL（濃度均經(jīng)過分光光度計校正）測定標準曲線（規(guī)定曲線包含0點但不強制過0點），每一點濃度測定3次，使用3次數(shù)據(jù)擬合得到以下線性參數(shù)，各濃度點對應(yīng)的濃度和峰面積見表1。

表1 維生素A標準溶液濃度與對應(yīng)峰面積

最終得出維生素A的擬合標準曲線的線性方程為Y=1.4090X-0.00247，此時R2=0.9995（圖3）。標準曲線線性回歸方程相關(guān)系數(shù)大于0.9900，濃度范圍覆蓋關(guān)注濃度的0%～150%，符合《GB/T27417—2017合格評定化學分析方法確認和驗證指南》的要求。

圖3 維生素A標準溶曲線

采用標準偏差法，選擇陰性樣品（即試樣中本身不含有維生素A）試樣，稱取10份，每份稱取5.00g左右，按標準方法進行檢測按檢出限的表示方法為3倍標準偏差（結(jié)果見表2），定量限為LOD的3倍。稱完陰性樣品后每個樣品中加入390μL，濃度為1.9153μg/mL的維生素A標準工作液。按照標準方法進行后續(xù)處理，并計算出標準偏差，以及LOD和LOQ。

從表2及圖4的結(jié)果可見，液體乳試樣稱樣量為5.00g，定容體積為10 mL時，維生素A方法檢出限為3.98μg/100g，方法定量限為11.90μg/100g。低于該方法規(guī)定的檢出限和定量限（稱樣量為5.00g，定容體積為10 mL時，維生素A的紫外檢出限為10.00μg/100g，定量限為30.00μg/100g）。

表2 維生素A方法檢出限與定量限結(jié)果

圖4 10次加標試驗數(shù)據(jù)疊加

2.3 各階段的母乳和牛乳中維生素A含量

母乳和牛乳中不同時期實驗分組測定維生素A含量見表3。

通過表3數(shù)據(jù)對比，母乳初乳期中維生素A含量略高于牛乳中維生素A的含量，但母乳維生素A的含量會隨著哺乳時間的增長和飲食習慣的變化顯著減小。

表3 牛乳和母乳不同時期分組維生素A含量

3 討論

液相色譜法測定維生素A含量檢出靈敏度一般，因此，本文在設(shè)計實驗時，對《GB 5009.82—2016食品安全國家標準食品中維生素A、D、E的測定》方法中維生素A的檢出限和定量限進行了論證，通過采用更新型儀器設(shè)備，增加樣本量來提高靈敏度的方法。對于成分復(fù)雜的母乳通用性更強，測定數(shù)據(jù)更準確。反向高效液相紫外檢測器測定牛乳和母乳中維生素A，前處理簡便，儀器基線穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，檢測靈敏度高，可以滿足分析要求，為以后母乳和牛乳中維生素A測定方法提供參考。

本文在進行實驗設(shè)計時，較其他同類文章針對母乳在初乳期，過渡期和成熟期3個時期維生素A含量進行采樣分析，發(fā)現(xiàn)母乳中的維生素A會隨著哺乳期的深入而逐漸減小，為以后研發(fā)嬰幼兒配方奶粉、細化嬰幼兒喂養(yǎng)需求提供了更為細致的數(shù)據(jù)支撐[7]。相對于母乳來說，在哺乳后期應(yīng)該更佳注重富含維生素A營養(yǎng)物質(zhì)的食物的攝入，例如芒果、木瓜以及多種綠葉蔬菜，來提高自身母乳中維生素A的含量。對于缺乏維生素A的嬰幼兒，應(yīng)食用添加維生素A營養(yǎng)強化劑的嬰幼兒配方奶粉[8]。通過對母乳和牛乳維生素A含量測定進行了分析比較，牛乳作為最廣泛的奶制品，為牛乳液態(tài)配方奶中維生素A含量添加提供了一定的理論基礎(chǔ)。