王曉燕，王思怡，楊 婷，王建華

(東北大學(xué) 理學(xué)院化學(xué)系，遼寧 沈陽(yáng) 110819)

生物傳感分析在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全、臨床診斷以及生物反恐等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，其中，作為生物傳感探針的核心元件，目標(biāo)識(shí)別分子的選擇至關(guān)重要，直接決定了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。為此，人們不斷尋找各種與目標(biāo)物具有親和性和特異性的識(shí)別分子，如抗體、抗生素、多肽及適配體等[1]。噬菌體展示技術(shù)是一種強(qiáng)大的分子進(jìn)化手段，可在短時(shí)間內(nèi)高效獲取親和力媲美抗體的目標(biāo)識(shí)別多肽[2]。將表面展示有目標(biāo)識(shí)別多肽的噬菌體作為目標(biāo)識(shí)別元件構(gòu)建傳感分析體系，具有抗體、多肽和適配體不可比擬的優(yōu)勢(shì)[3-7]。M13噬菌體是噬菌體展示技術(shù)中應(yīng)用最廣泛和最成熟的噬菌體[8]。M13噬菌體展示技術(shù)的初期研究主要集中在抗原表位鑒定、抗體識(shí)別以及蛋白-蛋白間的相互作用等[9-10]。隨著研究深入，M13噬菌體精確的結(jié)構(gòu)特征、較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力以及低的生產(chǎn)成本等優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯，其應(yīng)用也越加廣泛。本文綜述了近年來(lái)M13噬菌體在光學(xué)傳感、電化學(xué)傳感、石英晶體微天平傳感以及成像分析等領(lǐng)域的應(yīng)用，并對(duì)其在分析傳感領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 M13噬菌體的結(jié)構(gòu)特征

M13噬菌體是一種專門(mén)感染細(xì)菌的柔性絲狀病毒，具有嚴(yán)格的宿主選擇性，對(duì)人體無(wú)害。M13噬菌體的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，整體呈圓柱形，長(zhǎng)880 nm，直徑6.6 nm[11](圖1)，其表面由多達(dá)2 700個(gè)拷貝的主要衣殼蛋白pⅧ通過(guò)螺旋形式包裹而成，內(nèi)部為單鏈環(huán)狀DNA[12]；野生型M13噬菌體pⅧ亞基的前8個(gè)氨基酸中有2個(gè)氨基和3個(gè)羧基暴露在外，因此可以對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾而不影響病毒粒子的完整性和感染性[13]。同時(shí)，M13噬菌體pⅧ蛋白中間部分的非極性氨基酸提高了噬菌體的化學(xué)穩(wěn)定性，使得M13噬菌體具有耐極端酸度和離子強(qiáng)度的能力。此外，在噬菌體的兩端分別還有管鞘狀的4種次要衣殼蛋白pⅦ、pⅨ、pⅢ和pⅥ[14]。M13噬菌體的5種衣殼蛋白均由其內(nèi)部的單鏈環(huán)狀DNA編碼而成，因此，通過(guò)基因工程手段可以將外源多肽或蛋白與衣殼蛋白融合表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)M13噬菌體的表面功能化[15]，噬菌體展示技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生。

圖1 M13噬菌體的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of M13 phage

2 噬菌體展示技術(shù)

1985年，Smith[16]發(fā)現(xiàn)將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ中時(shí)，該外源基因編碼的多肽會(huì)以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體衣殼蛋白pⅢ中，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)。簡(jiǎn)單來(lái)講，噬菌體展示技術(shù)是通過(guò)基因重組的方式，將外源蛋白或多肽的基因序列插入噬菌體衣殼蛋白的基因序列中，進(jìn)而在噬菌體衣殼蛋白的相應(yīng)位置表達(dá)出對(duì)應(yīng)的外源蛋白或多肽而不影響噬菌體正常生理功能的技術(shù)。該技術(shù)巧妙地實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)基因型與表型的統(tǒng)一。利用噬菌體展示技術(shù)可構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)，包括噬菌體肽庫(kù)、噬菌體蛋白庫(kù)以及噬菌體抗體庫(kù)等。結(jié)合生物淘選[4]，即可從噬菌體展示文庫(kù)中獲得對(duì)特定目標(biāo)如糖類(lèi)、毒素、蛋白、小分子或完整細(xì)胞等具有高特異性親和力的噬菌體單克隆[17]?；诖?，該技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi)將與靶標(biāo)結(jié)合的克隆進(jìn)行反復(fù)篩選和擴(kuò)增，最終實(shí)現(xiàn)多肽或蛋白的定向進(jìn)化。噬菌體展示技術(shù)因此被認(rèn)為是一種強(qiáng)大的分子選擇進(jìn)化技術(shù)[18]。目前，噬菌體展示技術(shù)已被應(yīng)用于抗原表位分析[19]、蛋白相互作用[20]、疫苗研制[21-22]、藥物研發(fā)[23-25]以及靶向多肽的篩選[26]等領(lǐng)域，利用該技術(shù)可進(jìn)化出抵抗自身免疫性疾病以及治愈轉(zhuǎn)移性癌癥的抗體，對(duì)保障人類(lèi)健康意義重大，噬菌體展示技術(shù)也因此獲得了2018年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[27]。此后，該技術(shù)在生物傳感[28]、生物醫(yī)學(xué)[29]以及功能材料制備[30]等領(lǐng)域中得到了進(jìn)一步應(yīng)用。隨著該技術(shù)在生物領(lǐng)域中應(yīng)用的日益深入，噬菌體制劑對(duì)人體的安全性也將逐漸引起人們的關(guān)注。目前，噬菌體展示技術(shù)依然需要更深層次的探索，例如，噬菌體展示技術(shù)多用于表達(dá)分子量較小的多肽或蛋白，而對(duì)于分子量較大的蛋白還存在著無(wú)法表達(dá)或表達(dá)數(shù)量極少的困境，這或許可以通過(guò)將多種噬菌體共同參與蛋白表達(dá)來(lái)加以改進(jìn)；同時(shí)，目前噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用多停留于功能性噬菌體的構(gòu)建或篩選而忽略了噬菌體和靶標(biāo)作用機(jī)理的深入研究，若能明確兩者之間的相互作用并適當(dāng)?shù)貙?duì)所表達(dá)的多肽進(jìn)行修飾，或可進(jìn)一步增強(qiáng)噬菌體對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合能力。

3 M13噬菌體的分析傳感應(yīng)用

對(duì)于分析傳感而言，能夠快速識(shí)別目標(biāo)物并能產(chǎn)生可讀信號(hào)的探針是其核心元件。檢測(cè)探針的選取往往取決于其特異性、選擇性、檢測(cè)性能、存儲(chǔ)條件、可操作性及環(huán)境穩(wěn)定性等[17]。M13噬菌體是噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用最廣泛和成熟的噬菌體，其本身具有良好的水溶性、化學(xué)穩(wěn)定性以及較強(qiáng)的環(huán)境耐受能力；而得益于噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展，M13噬菌體還可表達(dá)與目標(biāo)物有特異性結(jié)合能力的多肽或蛋白，因而在分析傳感領(lǐng)域表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)：與抗體和適配體相比，M13噬菌體性能更穩(wěn)定，在惡劣環(huán)境下不易失活且生產(chǎn)成本低[31]；與雜交瘤技術(shù)相比，M13噬菌體展示技術(shù)的可篩選范圍更廣，并且可通過(guò)基因和分子進(jìn)化方法調(diào)控探針的特異性和選擇性，以增強(qiáng)探針的親和力和穩(wěn)定性；同時(shí)M13噬菌體的存儲(chǔ)方便，在37 ℃下可至少保存6個(gè)月[32]。因此M13噬菌體是用于構(gòu)建傳感探針的良好選擇。

3.1 光學(xué)傳感

3.1.1免疫熒光法M13噬菌體用于傳感分析的最常用方法是將信號(hào)分子偶聯(lián)到篩選所得的噬菌體衣殼蛋白表面，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的識(shí)別與檢測(cè)。如從噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)中篩選得到與葡萄球菌毒素SEB有親和力的M13噬菌體，并將熒光染料Cy5標(biāo)記在該M13噬菌體上，可實(shí)現(xiàn)SEB的免疫熒光檢測(cè)，這也證明了噬菌體展示肽用于構(gòu)建生物傳感探針的可行性[33]。用Cy5標(biāo)記的M13噬菌體作為傳感探針還可檢測(cè)海水中的2,4,6-三硝基甲苯(TNT)，這也是首例在非生理環(huán)境下進(jìn)行噬菌體篩選并檢測(cè)小分子的報(bào)道[34]。此外，M13噬菌體pⅢ蛋白通常為3～5個(gè)拷貝，而體側(cè)的pⅧ蛋白高達(dá)2 700個(gè)拷貝，因此，通過(guò)利用3～5個(gè)拷貝的pⅢ蛋白表達(dá)目標(biāo)識(shí)別多肽，并在2 700個(gè)拷貝的pⅧ蛋白外偶聯(lián)報(bào)告分子，即可實(shí)現(xiàn)有效的信號(hào)放大。如Goldman等[35]在M13噬菌體的pⅢ蛋白上表達(dá)了蓖麻毒素的單域抗體(sdAb)，然后采用DyLight 549對(duì)M13噬菌體的pⅧ蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，和單獨(dú)使用sdAb進(jìn)行熒光免疫檢測(cè)相比，前者的檢測(cè)靈敏度提高了5～10倍，檢出限從1 ng/mL降低至64 pg/mL。

3.1.2表面等離子體共振分析20世紀(jì)90年代，人們發(fā)現(xiàn)了表面等離子體共振(Surface plasmon resonance，SPR)現(xiàn)象[36]，將SPR效應(yīng)與高特異性和高親和力的抗體相結(jié)合可直接用于分析檢測(cè)，無(wú)需進(jìn)行額外信號(hào)標(biāo)記或樣品預(yù)處理[37]。利用這一特性，人們發(fā)展了多種基于SPR效應(yīng)的免標(biāo)記光學(xué)檢測(cè)方法[38]。近年來(lái)，大量實(shí)驗(yàn)證明噬菌體可以有效替代抗體與SPR技術(shù)相結(jié)合，且噬菌體的生產(chǎn)成本低、耗時(shí)短。Karoonuthaisiri等[39]從商品化的Ph.D.-12噬菌體隨機(jī)展示多肽文庫(kù)中篩選得到與沙門(mén)氏菌有特異性結(jié)合能力的M13噬菌體MSal020417，并將該噬菌體固定到CM5 SPR芯片上，從而構(gòu)建了基于M13噬菌體的SPR檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法。Kim等[40]采用基因工程手段在M13噬菌體pⅧ蛋白上融合表達(dá)了鏈霉親和素結(jié)合短肽HPQ，并將噬菌體定向排列構(gòu)建SPR傳感器用于捕獲和檢測(cè)鏈霉親和素，噬菌體的各向異性有效提高了SPR的靈敏度，靈敏度可低至fmol(圖2A)。

3.1.3比色法貴金屬納米粒子獨(dú)特的SPR效應(yīng)使其在比色傳感中得到了廣泛應(yīng)用。M13噬菌體的納米尺寸與貴金屬納米粒子具有較好的兼容性，通過(guò)將貴金屬納米粒子偶聯(lián)到M13噬菌體的衣殼蛋白表面，可構(gòu)建基于M13噬菌體-貴金屬納米粒子的比色傳感體系。由于每個(gè)噬菌體表面可偶聯(lián)多個(gè)納米粒子，因此檢測(cè)信號(hào)明顯增強(qiáng)。如Cha課題組[41]首先從噬菌體文庫(kù)中篩選得到能識(shí)別抗原模型IgG的噬菌體，然后將pⅧ蛋白巰基化修飾用于結(jié)合納米金，最終通過(guò)測(cè)量納米金的吸光度值對(duì)IgG進(jìn)行定量，檢出限可達(dá)100 fmol。在此基礎(chǔ)上，該小組改進(jìn)了納米金的偶聯(lián)方法，首先在噬菌體pⅧ蛋白上修飾DNA，之后通過(guò)與互補(bǔ)鏈修飾的納米金雜交的方式有效提高了pⅧ蛋白上偶聯(lián)納米金的量，進(jìn)而提高了方法的靈敏度，檢出限低至25 fmol(圖2B)[42]。M13噬菌體表面衣殼蛋白含有還原性氨基酸殘基可同時(shí)作為還原劑和保護(hù)劑，從而實(shí)現(xiàn)納米金在其表面的原位生長(zhǎng)[43-45]。Wang等[46]從噬菌體肽庫(kù)中篩選出對(duì)Hg(Ⅱ)具有良好親和力的M13噬菌體，并在其表面原位生長(zhǎng)納米金，Hg(Ⅱ)經(jīng)親汞噬菌體表面汞結(jié)合肽捕獲后，被噬菌體表面還原性氨基酸殘基還原為汞單質(zhì)進(jìn)而沉積于納米金表面，由此產(chǎn)生納米金的SPR吸收光譜改變，從而建立了簡(jiǎn)便可靠的目視法Hg(Ⅱ)傳感體系。親汞噬菌體對(duì)汞離子的高選擇性捕獲和金汞天然高親和力共同賦予該方法強(qiáng)的抗干擾能力，使其對(duì)干擾離子的耐受倍數(shù)遠(yuǎn)高于其他基于納米金比色傳感Hg(Ⅱ)的方法。M13噬菌體對(duì)目標(biāo)物的識(shí)別能力除了可通過(guò)噬菌體文庫(kù)篩選技術(shù)獲取之外，還可通過(guò)融合表達(dá)目標(biāo)物結(jié)合肽來(lái)實(shí)現(xiàn)。M13噬菌體對(duì)含F(xiàn)性菌毛的大腸桿菌具有侵染性，是因?yàn)槠鋚Ⅲ蛋白具有對(duì)應(yīng)的宿主菌識(shí)別肽。Peng等[3]通過(guò)將原M13噬菌體宿主菌識(shí)別肽替換為可識(shí)別其他宿主菌的多肽，并通過(guò)偶聯(lián)納米金作為信號(hào)輸出，實(shí)現(xiàn)了嵌合M13噬菌體-納米金復(fù)合物對(duì)多種微生物的高選擇性檢測(cè)。

3.1.4熒光共振能量轉(zhuǎn)移法熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)的基本原理是激發(fā)能通過(guò)偶極-偶極耦合從供體轉(zhuǎn)移至受體同時(shí)引發(fā)受體產(chǎn)生熒光，其中，能量轉(zhuǎn)移過(guò)程是通過(guò)空間的相互作用完成，基本不受溶劑或大分子的影響，而對(duì)供體和受體間距離的要求十分苛刻，也是實(shí)現(xiàn)FRET的關(guān)鍵。有機(jī)染料、共軛聚合物、半導(dǎo)體納米晶、量子點(diǎn)等已被廣泛開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于FRET分析檢測(cè)[47]。雖然這些材料具有高量子效率和電子親和能，但分子接觸引起的猝滅過(guò)程使得其無(wú)法獲得最優(yōu)能量轉(zhuǎn)移效率，因此，對(duì)分子間距進(jìn)行可控設(shè)計(jì)可大大提高FRET效率[48]。M13噬菌體明確的結(jié)構(gòu)(pⅧ蛋白N末端的距離約為3.2 nm和2.4 nm)及特異性結(jié)合特性使得其在構(gòu)建FRET體系中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。Chen等[49]報(bào)道了一種基于M13噬菌體構(gòu)建的FRET熒光探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)胞內(nèi)pH的傳感檢測(cè)。該法首先通過(guò)化學(xué)方法將β-環(huán)糊精(β-CD)修飾在噬菌體pⅧ蛋白上，而后將對(duì)pH敏感的異硫氰酸熒光素(FITC)與不敏感的羅丹明B(RhB)通過(guò)金剛烷基與β-CD的主客體識(shí)別進(jìn)行連接，從而實(shí)現(xiàn)熒光能量從FITC(供體)到RhB(受體)的轉(zhuǎn)移(圖2C)。

圖2 M13噬菌體在表面等離子體共振(A)[40]、比色(B)[42]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(C)[49]以及表面增強(qiáng)拉曼散射(D)[54]中的應(yīng)用Fig.2 Application of M13 phage in optical analysis,including SPR(A)[40],colorimetric method(B)[42],FRET(C)[49] and SERS(D)[54]

3.1.5表面增強(qiáng)拉曼散射分析1974年，F(xiàn)leischmann等[50]在表面粗糙的銀電極上觀察到了吡啶的拉曼光譜，隨后，Jeanmaire和Duyne[51]在1977年通過(guò)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算闡述了其機(jī)理，并指出這是一種表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface enhanced Raman scattering，SERS)光譜效應(yīng)。從理論上講，附著在金屬納米材料表面的分子可顯著增強(qiáng)拉曼信號(hào)，其增強(qiáng)因子達(dá)1011～1012，SERS因此可以作為強(qiáng)大的高靈敏度檢測(cè)光譜技術(shù)，并已被廣泛應(yīng)用于各種生物或化學(xué)傳感中，如單分子檢測(cè)、生物標(biāo)記、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及法醫(yī)檢測(cè)等[52]。M13噬菌體由于具有獨(dú)特的特異性結(jié)合能力，因此被作為識(shí)別分子與SERS聯(lián)用進(jìn)行生物分析，而其高拷貝的pⅧ蛋白也可通過(guò)偶聯(lián)SERS信號(hào)分子進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。如Lee等[53]將DNA修飾Au@Ag核殼納米顆粒與互補(bǔ)鏈修飾的M13噬菌體相結(jié)合，建立了新型的生物傳感體系，得益于M13噬菌體的高比表面積，相比于DNA-抗體體系，DNA-M13噬菌體體系的檢測(cè)信號(hào)增大了75倍。此外，M13噬菌體-SERS體系還可用于農(nóng)藥殘留物的檢測(cè)(圖2D)[54]和疾病診斷，Ngugen等[55]將富含半胱氨酸的M13噬菌體與介孔SERS基底相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)膿毒癥標(biāo)志物的檢測(cè)；Lentini等[56]制備了噬菌體-納米銀體系用于淋巴瘤細(xì)胞U937的鑒別。

可以看出，M13噬菌體在高靈敏光學(xué)傳感應(yīng)用中具有顯著優(yōu)勢(shì)，但同樣會(huì)受到光學(xué)檢測(cè)固有屬性的限制，比如比色傳感無(wú)法檢測(cè)有顏色干擾的樣品；此外，相對(duì)抗體、適配體等配體，M13噬菌體保存更方便，非常適合用于構(gòu)建便攜式光學(xué)傳感器，但目前該領(lǐng)域的研究很少。

3.2 電化學(xué)傳感

噬菌體應(yīng)用于電化學(xué)傳感領(lǐng)域同樣具有較好的分析性能。2005年，Neufeld等[57]以M13噬菌體以及大腸桿菌TG-1為模型，建立了檢測(cè)細(xì)菌的電化學(xué)分析方法。將堿性磷酸酶基因pFLAG-ATS-BAP插入M13KO7噬菌體中，當(dāng)噬菌體進(jìn)入宿主菌TG-1后，便會(huì)產(chǎn)生大量堿性磷酸酶，酶與細(xì)菌內(nèi)的底物對(duì)氨基苯基磷酸鹽的反應(yīng)活性可轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號(hào)。該方法靈敏度好，檢出限低至1 cfu/mL。利用噬菌體構(gòu)建電極，不僅穩(wěn)定性強(qiáng)且靈敏度高[58-60]。M13噬菌體近2 700拷貝的pⅧI蛋白，每個(gè)蛋白均可連接酶或者報(bào)告分子，因此將表達(dá)有親和多肽的M13噬菌體用于檢測(cè)，其靈敏度會(huì)比僅使用抗體高出幾百倍[61](圖3)。Sedki團(tuán)隊(duì)[62]通過(guò)EDC/NHS法將M13噬菌體固定到表面沉積有納米金的玻碳電極上，利用M13噬菌體與含F(xiàn)性菌毛的大腸桿菌之間特有的親和性，首次建立了一種高靈敏的阻抗法(EIS)電化學(xué)傳感器用于大腸桿菌菌群的早期檢測(cè)，選擇性較高，檢出限僅為14 cfu/mL，并且該方法在實(shí)際樣品中具有優(yōu)越的抗干擾能力。雖然將噬菌體用于電化學(xué)檢測(cè)具有優(yōu)異的靈敏度和高選擇性，但直接用噬菌體修飾電極進(jìn)行檢測(cè)，其制備過(guò)程復(fù)雜，且電極在經(jīng)過(guò)反復(fù)數(shù)次使用后，檢測(cè)性能會(huì)不可避免地下降，因此有必要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和制備便捷且檢測(cè)性能穩(wěn)定的噬菌體修飾電極。

3.3 石英晶體微天平傳感

石英晶體微天平(Quartz crystal microbalance，QCM)用于免疫傳感時(shí)，主要依賴于抗體的選擇性和親和力。然而，使用抗體存在許多固有缺陷，比如成本高、可重復(fù)利用性差、固定困難以及易損壞等。相反，噬菌體展示多肽具有良好的耐久性、可重復(fù)使用性、穩(wěn)定性好以及成本生產(chǎn)低等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還具有與抗體同等的特異性和靈敏度。Petrenko和Olsen等[2,63]先后提出并用實(shí)驗(yàn)證明了噬菌體用于QCM的概念，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，噬菌體可以很容易地通過(guò)物理吸附固定在QCM的金電極上，這是優(yōu)于抗體的另一大優(yōu)勢(shì)。此外，由于噬菌體具有良好的耐受性，Yang等[64]將M13噬菌體固定在QCM的金電極上用于檢測(cè)抗體，并建立了可再生傳感電極表面，僅用0.5 mol/L的鹽酸溶液處理電極即可將與噬菌體結(jié)合的抗體去除而不影響噬菌體對(duì)抗體的再次結(jié)合能力。目前，基于噬菌體的QCM傳感主要利用噬菌體對(duì)宿主菌的天然選擇性進(jìn)行檢測(cè)，這使得其適用范圍有所局限；另外，雖然利用噬菌體修飾的電極重復(fù)使用率高于抗體，但使用次數(shù)依然有限，因此也限制了基于噬菌體QCM傳感的應(yīng)用。

3.4 成像分析

成像和無(wú)損檢測(cè)一直是醫(yī)學(xué)界不斷探索和發(fā)展的領(lǐng)域，對(duì)疾病的早期發(fā)現(xiàn)和治療具有十分重要的意義。通過(guò)基因工程或化學(xué)修飾，可在M13噬菌體的衣殼蛋白表面同時(shí)連接靶向配體和成像分子，從而將靶向性和成像功能巧妙地結(jié)合起來(lái)以實(shí)現(xiàn)靶向成像分析。例如通過(guò)生物素連接酶將不同的量子點(diǎn)分別修飾到篩選所得兩種靶向噬菌體表面，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞不同蛋白的雙色成像[65]。分別在M13噬菌體pⅢ和pⅧ蛋白上同時(shí)表達(dá)對(duì)腫瘤標(biāo)志物SPARC和磁性氧化鐵納米顆粒有親和力的多肽，可用于小鼠體內(nèi)癌細(xì)胞和腫瘤的靶向磁共振成像[66]；此外，與其他近紅外熒光染料相比，利用M13噬菌體制備近紅外熒光納米材料(SBP-M13-SWNT)用于體內(nèi)靶向彌散性腫瘤的信噪比更好，對(duì)腫瘤的檢測(cè)和指導(dǎo)切除能力也明顯提高[67](圖4)。除了能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞進(jìn)行成像分析，M13噬菌體還可用于構(gòu)建體內(nèi)感染性疾病的靶向成像。2013年，Belcher課題組[32]將M13噬菌體與熒光染料結(jié)合，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)有無(wú)F菌毛的細(xì)菌感染的成像區(qū)分，還可進(jìn)一步在M13噬菌體pⅢ蛋白上連接某種細(xì)菌抗體，從而對(duì)特定細(xì)菌感染進(jìn)行靶向成像。由于M13噬菌體pⅧ蛋白的高拷貝數(shù)，利用M13噬菌體構(gòu)建的體內(nèi)靶向成像探針的信噪比更高，且與近紅外材料相結(jié)合，穿透力更強(qiáng)，非常適合用于機(jī)體深層次的組織和細(xì)胞成像分析，但目前相關(guān)研究并不多，并且其在體內(nèi)的代謝機(jī)制和對(duì)人體的安全性也尚不明確。

圖4 SBP-M13-SWNT 指導(dǎo)手術(shù)切除腫瘤[67]Fig.4 Surgical removal of tumors with SBP-M13-SWNT guidance [67]

4 結(jié)論與展望

對(duì)于M13噬菌體，無(wú)論是其內(nèi)部基因還是外層衣殼蛋白結(jié)構(gòu)，都非常簡(jiǎn)單和易于修飾。同時(shí)，大量的研究報(bào)告證實(shí)，噬菌體用作識(shí)別探針或生物模板，不僅具有良好的特異性，還具有優(yōu)越的環(huán)境耐受性。通過(guò)噬菌體展示文庫(kù)可獲得大量靶向多肽，因此，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)噬菌體多功能化的修飾方法以及探索高親和性和特異性噬菌體的篩選方法，也將推動(dòng)基于噬菌體的多模式和多靶標(biāo)檢測(cè)的發(fā)展，M13噬菌體在分析傳感領(lǐng)域的應(yīng)用也將會(huì)更加廣泛；其次，深入研究噬菌體與靶標(biāo)分子間的相互作用，有助于更好地選擇信號(hào)分子和分析方法，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的高靈敏檢測(cè)；最后，基于噬菌體構(gòu)建的傳感探針，往往能適應(yīng)更寬的溫度及pH值變化范圍，穩(wěn)定性較好，因而可發(fā)展基于噬菌體的便攜式檢測(cè)試劑盒用于更為復(fù)雜的實(shí)際樣品分析。