劉瑞娜,孫思佳,葛媛媛,劉吉泉,洪海軍,崔生輝,劉藝茹,翟磊,林雅芳,沈穎,陳怡文,劉驥,李婷,姚粟*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015) 2(Procter & Gamble International Operations,新加坡,138547) 3(聯(lián)合利華(中國)有限公司,上海,200335) 4(中國食品藥品檢定研究院,北京,100050) 5(北京寶潔技術(shù)有限公司,北京,101312) 6(查士利華微生物應(yīng)用技術(shù)(上海)有限公司,上海,201708)

隨著生物學(xué)技術(shù)及交叉學(xué)科的發(fā)展進(jìn)步,各類快速、靈敏、通量大的微生物新型檢驗(yàn)方法的開發(fā)驗(yàn)證逐漸成為關(guān)注熱點(diǎn)[1-5]。ATP生物熒光增幅法是本課題組基于ATP生物熒光技術(shù)建立的一套微生物快速檢驗(yàn)方法[6-8]。該方法利用微生物體內(nèi)的腺苷酸激酶AK催化外源添加的二磷酸腺苷ADP轉(zhuǎn)換為三磷酸腺苷ATP,短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)ATP增幅,通過檢測熒光信號的強(qiáng)度判斷測試樣品中是否含有微生物污染[9]。經(jīng)前期方法學(xué)驗(yàn)證,該方法與《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)[10](以下簡稱《規(guī)范》)中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法具有部分等效性[11]。

耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌是《規(guī)范》中要求每克或每毫升化妝品產(chǎn)品中不得檢出的三類污染菌[10]。其中,耐熱大腸菌群是指一群需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌,為化妝品糞便污染指標(biāo)菌；銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌則是具有潛在風(fēng)險的機(jī)會致病菌[12]。為證明ATP生物熒光增幅法可同步篩查化妝品中控制菌污染,本研究參照《中國藥典》(2020版)[13]藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中定性檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證要求,收集清潔類、護(hù)理類、美容修飾類等6種化妝品,從專屬性、檢測限、重現(xiàn)性和耐用性4個方面開展了ATP生物熒光增幅法與《規(guī)范》中上述3種控制菌標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的部分等效性驗(yàn)證研究,以期明確ATP生物熒光增幅法的使用范圍,并為將其推廣應(yīng)用于食品、水、環(huán)境等領(lǐng)域的微生物快速檢測提供借鑒。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)產(chǎn)品

依據(jù)GB/T 18670—2017《化妝品分類》的分類原則[14],從清潔類、護(hù)理類、美容修飾類中選取洗發(fā)水、沐浴液、護(hù)發(fā)素、定型水、面霜和面膜共6種市售產(chǎn)品,每個產(chǎn)品選擇3個不同批次。

1.2 試驗(yàn)菌株

研究表明《規(guī)范》中耐熱大腸菌群檢驗(yàn)方法的實(shí)際目標(biāo)菌為具耐熱性能的大腸埃希氏菌[15]。結(jié)合化妝品生產(chǎn)環(huán)境、原料和配方等特性,收集了環(huán)境和工業(yè)等不同來源的大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)各20株(共60株),用于測試改良TAT(MTAT)培養(yǎng)基的促生長能力,并以大腸埃希氏菌(E.coli)CICC 10389(=CMCC(B)44102)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)CICC 10419(=CMCC(B)10104)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)CICC 10384(= CMCC(B)26003)作為代表性控制菌株用于方法驗(yàn)證研究,以上菌株均由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)提供。

1.3 儀器與試劑

HG-50高壓滅菌器,日本平山制作所株式會社；Celsis?Advance II 光度計,Charles River Laboratories；BHG—8082型恒溫培養(yǎng)箱、THZ-98C恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；往復(fù)式搖床,Eberbach；AC2-4S1生物安全柜,新加坡藝思高科技有限公司。

雙倍乳糖膽鹽(含中和劑)培養(yǎng)基、大豆酪蛋白消化卵磷脂聚山梨酯肉湯(soya casein digest lecithin polysorbate broth，SCDLP)液體培養(yǎng)基、Baird-Parker瓊脂、十六烷三甲基溴化銨瓊脂,北京陸橋技術(shù)股份有限公司；改良TAT(MTAT)培養(yǎng)基 (g/L)：TAT肉湯 22.50、硫代硫酸鈉 0.50、組氨酸 0.10、蛋白胨 7.50、葡萄糖 15.00、氯化鈉 0.85、卵磷脂1.43和吐溫80 39.00,pH值調(diào)至7.0±0.1；ATP生物熒光增幅法試劑,Charles River Laboratories Celsis?AMPiScreenTM。

1.4 試驗(yàn)方法

依據(jù)《中國藥典》(2020版)微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中定性檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證要求,從專屬性、檢測限、重現(xiàn)性和耐用性4個方面,開展ATP生物熒光增幅法和《規(guī)范》中耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法的部分等效性驗(yàn)證。

1.4.1 專屬性

專屬性參數(shù)的驗(yàn)證包括ATP生物熒光增幅法是否能夠適用于3種控制菌的富集生長,且有產(chǎn)品存在時該方法是否能夠檢測出其中的控制菌。本研究通過測定MTAT富集培養(yǎng)基對3種控制菌的促生長能力和人工污染樣品來評價方法專屬性。

為全面考察方法所用培養(yǎng)基對3種控制菌的促生長能力,將收集的不同來源的60株控制菌株制備為10～100 CFU/10 mL的菌懸液,接種至90 mL MTAT富集培養(yǎng)基,于(30±2) ℃,200 r/min,振蕩培養(yǎng)48 h,吸取50 μL富集培養(yǎng)液進(jìn)行ATP生物熒光增幅法檢測,同時,觀察培養(yǎng)液濁度確認(rèn)是否有微生物生長,以此評價富集培養(yǎng)基MTAT的促生長能力。

人工污染樣品的測定以大腸埃希氏菌(E.coli) CICC 10389、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa) CICC 10419和金黃色葡萄球菌(S.aureus)CICC 10384作為代表菌株。參照Charles River公司提供儀器使用說明書對試驗(yàn)選擇的6種化妝品進(jìn)行樣品影響測試和接菌試驗(yàn)。樣品影響測試通過的標(biāo)準(zhǔn)為培養(yǎng)基空白的信號值低于1 000 RLU,產(chǎn)品樣品的信號值低于3倍培養(yǎng)基空白的信號值,ATP對照、微生物對照、ATP樣品和微生物樣品的信號值高于3倍培養(yǎng)基空白的信號值,且產(chǎn)品ATP回收率應(yīng)高于25%(推薦值),計算公式(1)為:

(1)

平板確認(rèn)陰性無可見菌落生長。接菌試驗(yàn)通過的標(biāo)準(zhǔn)為微生物樣品和微生物對照的檢測結(jié)果為陽性,未接菌的產(chǎn)品樣品檢測結(jié)果為陰性,且平板確認(rèn)無菌落生長。

1.4.2 檢測限

使用生理鹽水將大腸埃希氏菌(E.coli)CICC 10389、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa) CICC 10419和金黃色葡萄球菌(S.aureus)CICC 10384均制備為梯度是100、10和1 CFU/mL的接種液,并按照產(chǎn)品目標(biāo)污染濃度10、1和0.1 CFU/g進(jìn)行接種,分別使用ATP生物熒光增幅法和《規(guī)范》中標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測。利用Fisher exact test對2種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,評價2種方法的檢測限是否存在差異,并分別計算每種方法對3株控制菌株50%檢出時的檢出限(LOD50)。

ATP生物熒光增幅法檢測：取10 g產(chǎn)品加入90 mL MTAT富集培養(yǎng)基中制備為產(chǎn)品稀釋液,將3株控制菌株的3個梯度的接種液分別取1 mL接種于上述制備的產(chǎn)品稀釋液中,混勻,吸取10 mL于90 mL MTAT富集培養(yǎng)基,置于(30±2) ℃,200 r/min,振蕩培養(yǎng)48 h,取樣上機(jī)進(jìn)行ATP生物熒光增幅法檢測。每個產(chǎn)品重復(fù)5次。

標(biāo)準(zhǔn)方法檢測：取10 g產(chǎn)品加入90 mL生理鹽水中制備為產(chǎn)品稀釋液,將3株控制菌株的3個梯度的接種液分別取1 mL接種于上述制備的產(chǎn)品稀釋液中,混勻。分別按照《規(guī)范》中3種控制菌的檢測方法進(jìn)行檢測。大腸埃希氏菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)為雙倍乳糖膽鹽(含中和劑)培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h,產(chǎn)酸產(chǎn)氣報告陽性,不產(chǎn)酸產(chǎn)氣,繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,如仍既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣,報告陰性,否則報告陽性。銅綠假單胞菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)為十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)48 h,無銅綠假單胞菌典型菌落生長[10],報告陰性,有則報告陽性。金黃色葡萄球菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)為Baird-Parker培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,無金黃色葡萄球菌典型菌落生長[10],報告陰性,有則報告陽性。每個產(chǎn)品重復(fù)5次。

1.4.3 重現(xiàn)性

以金黃色葡萄球菌(S.aureus)CICC 10384為代表進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn),將菌株CICC 10384按照目標(biāo)污染濃度10～30 CFU/g接種于同批次的護(hù)發(fā)素產(chǎn)品中,選擇3家不同實(shí)驗(yàn)室分別使用ATP生物熒光增幅法和標(biāo)準(zhǔn)方法對同一人工污染樣品進(jìn)行檢測,并通過Fisher exact test統(tǒng)計方法對檢測結(jié)果進(jìn)行分析,評價3家不同實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異。

1.4.4 耐用性

MTAT富集培養(yǎng)基的促生長能力是ATP生物熒光增幅法檢測的關(guān)鍵,為保證其中和效果和增菌能力,團(tuán)隊前期進(jìn)行了大量試驗(yàn)研究優(yōu)化培養(yǎng)基成分。因此,本研究通過考察不同品牌的TAT肉湯配制的MTAT富集培養(yǎng)基的促生長能力來進(jìn)行耐用性評價。選取3種不同品牌的TAT肉湯,配制MTAT富集培養(yǎng)基,以金黃色葡萄球菌(S.aureus)CICC 10384為代表菌株開展耐用性試驗(yàn),將菌株按照目標(biāo)污染濃度10～30 CFU/g接種于不同MTAT富集培養(yǎng)基稀釋的護(hù)發(fā)素產(chǎn)品中,使用ATP生物熒光增幅法進(jìn)行檢測。比較不同TAT基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制的MTAT是否會對ATP生物熒光增幅法檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性

促生長試驗(yàn)結(jié)果顯示(表1),在無產(chǎn)品干擾情況下,60株控制菌株經(jīng)MTAT培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)48 h后菌液均渾濁,且ATP生物熒光增幅法檢測結(jié)果均為陽性,表明ATP生物熒光增幅法使用的MTAT富集培養(yǎng)基對3種控制菌的富集能力良好。

表1 MTAT富集培養(yǎng)基促生長試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Growth promotion test results of MTAT broth

續(xù)表1

樣品影響測試結(jié)果顯示,培養(yǎng)基空白的熒光信號值在167～285 RLU,遠(yuǎn)低于檢測方法要求的1 000 RLU,產(chǎn)品樣品的熒光信號值在87～199 RLU,符合低于3倍培養(yǎng)基空白信號值的要求,且經(jīng)涂布平板培養(yǎng)后確認(rèn)化妝品樣品中未見微生物污染；同時,ATP對照、微生物對照、ATP樣品和微生物樣品的熒光信號值均大于3倍培養(yǎng)基空白的信號值,且測試產(chǎn)品的ATP回收率區(qū)間為73.8%～106.8%,均高于25%的推薦值,表明6種產(chǎn)品均通過了樣品影響測試。此外,接種控制菌株的微生物樣品ATP生物熒光增幅法檢測結(jié)果均為陽性,未接菌產(chǎn)品樣品的檢測結(jié)果均為陰性,表明6種產(chǎn)品均通過了接菌試驗(yàn)。綜合分析培養(yǎng)基促生長測試、樣品影響測試和接菌試驗(yàn)的結(jié)果,表明ATP生物熒光增幅法具有良好專屬性。

2.2 檢測限

ATP生物熒光增幅法和《規(guī)范》中標(biāo)準(zhǔn)方法對3株控制菌株的檢測結(jié)果見表2和表3。對于大腸埃希氏菌(E.coli)CICC 10389,當(dāng)污染濃度為10 CFU/g時,標(biāo)準(zhǔn)方法與ATP生物熒光增幅法對6種產(chǎn)品均有5次陽性檢出,檢出率均為100%；當(dāng)污染濃度為1 CFU/g時,標(biāo)準(zhǔn)方法對部分產(chǎn)品存在陽性檢出,整體檢出率為26.7%,ATP生物熒光增幅法對6種產(chǎn)品均有5次陽性檢出,檢出率為100%；當(dāng)污染濃度為0.1 CFU/g時,標(biāo)準(zhǔn)方法對6種產(chǎn)品均無陽性檢出,ATP生物熒光增幅法對沐浴液、護(hù)發(fā)素和面霜有陽性檢出,檢出率為10%。綜合比較2種方法對3個濃度6種人工污染產(chǎn)品的大腸埃希氏菌檢測結(jié)果,標(biāo)準(zhǔn)方法在90次檢測中得到38次陽性檢出,檢出率為42.2%,LOD50為1.05 CFU/g,ATP生物熒光增幅法在90次檢測中得到63次陽性檢出,檢出率為70%,LOD50為0.20 CFU/g；經(jīng)Fisher exact test統(tǒng)計分析,ATP生物熒光增幅法顯著優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方法(P=0.000 3)。

表2 檢測限檢測結(jié)果Table 2 Limit of detection(LOD)test results

表3 檢測限檢測結(jié)果統(tǒng)計分析Table 3 Statistical analysis of LOD test results

對于銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)CICC 10419,當(dāng)污染濃度為10 CFU/g時,標(biāo)準(zhǔn)方法與ATP生物熒光增幅法對6種產(chǎn)品均有5次陽性檢出,檢出率均為100%；當(dāng)污染濃度為1 CFU/g時,30次檢測中,標(biāo)準(zhǔn)方法得到25次陽性檢出,檢出率為83.3%,ATP生物熒光增幅法得到28次陽性檢出,檢出率為93.3%；當(dāng)污染濃度為0.1 CFU/g時,標(biāo)準(zhǔn)方法對洗發(fā)水、護(hù)發(fā)素和面膜3種產(chǎn)品各有1次陽性檢出,檢出率為10%,ATP生物熒光增幅法僅對沐浴液無陽性檢出,6種產(chǎn)品檢出率為26.7%。綜合比較2種方法對3個濃度6種人工污染產(chǎn)品的銅綠假單胞菌檢測結(jié)果,標(biāo)準(zhǔn)方法在90次檢測中得到58次陽性檢出,檢出率為64.4%,LOD50為0.62 CFU/g,ATP生物熒光增幅法在90次檢測中得到66次陽性檢出,檢出率為73.3%,LOD50為0.35 CFU/g；經(jīng)Fisher exact test統(tǒng)計分析,ATP生物熒光增幅法顯著優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方法(P=0.017 6)。

對于金黃色葡萄球菌(S.aureus)CICC 10384,當(dāng)污染濃度為10 CFU/g時,30次檢測中,標(biāo)準(zhǔn)方法得到23次陽性檢出,檢出率均為76.7%；ATP生物熒光增幅法全部陽性檢出,檢出率為100%；當(dāng)污染濃度為1 CFU/g時,標(biāo)準(zhǔn)方法對部分產(chǎn)品存在陽性檢出,檢出率為53.3%,ATP生物熒光增幅法對6種產(chǎn)品均有5次陽性檢出,檢出率為100%；當(dāng)污染濃度為0.1 CFU/g時,標(biāo)準(zhǔn)方法僅對面霜和面膜存在陽性檢出,檢出率為13.3%,ATP生物熒光增幅法對4種產(chǎn)品有9次陽性檢出,檢出率為30%。綜合比較2種方法對3個濃度6種人工污染產(chǎn)品的金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果,標(biāo)準(zhǔn)方法在90次檢測中得到43次陽性檢出,檢出率為47.8%,LOD50為3.98 CFU/g,ATP生物熒光增幅法在90次檢測中得到69次陽性檢出,檢出率為76.7%,LOD50為0.14 CFU/g；經(jīng)Fisher exact test統(tǒng)計分析,ATP生物熒光增幅法顯著優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方法(P=0.017 6)。

統(tǒng)計結(jié)果顯示,ATP生物熒光增幅法對大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果相比均存在顯著性差異(P<0.05),表明ATP生物熒光增幅法在進(jìn)行耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)時的檢測限均優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方法。同時,進(jìn)一步分析2種方法在低濃度污染下的檢測結(jié)果,當(dāng)污染濃度為1 CFU/g時,ATP生物熒光增幅法對大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢出率分別為100%、93.3%和100%,等于或大于標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出率；且該方法LOD50分別為0.20、0.35和0.14 CFU/g,均遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)方法的LOD50,表明ATP生物熒光增幅法靈敏度高,在低濃度污染下檢出效果更好。ATP生物熒光增幅法的高靈敏度與方法所用培養(yǎng)基的中和體系密不可分?；瘖y品中一般富含適宜于微生物生長和繁殖的營養(yǎng)成分,為預(yù)防生產(chǎn)和使用過程中發(fā)生微生物污染,化妝品生產(chǎn)過程中通常會額外添加限定劑量的防腐劑或其他抑菌物質(zhì)[16-18]。

本方法建立過程中,對方法的中和效果進(jìn)行了重點(diǎn)關(guān)注,結(jié)合現(xiàn)有化妝品防腐體系特點(diǎn),在MTAT富集培養(yǎng)基中使用含量為4.5%的卵磷脂和吐溫80[19-20]等中和劑,可有效消除所選化妝品產(chǎn)品的抑菌作用,更加真實(shí)反映產(chǎn)品中微生物的污染情況,保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

2.3 重現(xiàn)性

重現(xiàn)性檢測結(jié)果顯示(表4),3家不同實(shí)驗(yàn)室使用2種方法對同一護(hù)發(fā)素污染樣品的金黃色葡萄球菌陽性檢出結(jié)果均相同,經(jīng)Fisher exact test統(tǒng)計分析,檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),表明ATP生物熒光增幅法具有良好的重現(xiàn)性。

表4 ATP生物熒光增幅法重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Reproducibility test results of amplification ATP biofluorescence method

2.4 耐用性

課題組在前期方法建立過程中已證明上樣量、培養(yǎng)溫度等參數(shù)有小的刻意變化時,ATP生物熒光增幅法檢測結(jié)果不受影響。本研究以對該方法檢測結(jié)果同樣具有重要影響的MTAT培養(yǎng)基為耐用性試驗(yàn)對象,結(jié)果顯示(表5),3種不同品牌TAT肉湯配制的MTAT富集培養(yǎng)基空白熒光信號值均遠(yuǎn)小于1 000 RLU,滿足ATP生物熒光增幅法檢測的要求；3種MTAT培養(yǎng)基接種金黃色葡萄球菌(S.aureus)CICC 10384富集培養(yǎng),ATP生物熒光增幅法檢測結(jié)果均為陽性。表明該方法具有良好的耐用性。

表5 ATP生物熒光增幅法耐用性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Durability test results of amplification ATP biofluorescence method

ATP生物熒光增幅法專屬性、重現(xiàn)性和耐用性良好,靈敏度更高,檢出效果顯著優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方法,團(tuán)隊前期研究結(jié)果表明該方法可用于化妝品中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌的檢驗(yàn)；本研究結(jié)果進(jìn)一步證明該方法在化妝品控制菌檢驗(yàn)方面與標(biāo)準(zhǔn)方法具有部分等效性；這對于實(shí)現(xiàn)使用一種快速篩選方法同時進(jìn)行《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)中要求的多種微生物檢驗(yàn),提高檢測效率,縮短檢測周期,加快產(chǎn)品放行,節(jié)省企業(yè)庫存成本,滿足新形勢下化妝品電商快速流通需求具有重要理論指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

本研究從專屬性、檢測限、重現(xiàn)性和耐用性4個參數(shù)上證明ATP生物熒光增幅法與《規(guī)范》中耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法具有部分等效性,結(jié)合本課題組前期研究成果,該方法可實(shí)現(xiàn)《規(guī)范》中各類微生物指標(biāo)48 h同步篩查。