付 強，王 琪，周巧麗，金 岳，胡夢琪，趙豐麗，2

（1.廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541006；2.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541006）

羅漢果是中國廣西特色經(jīng)濟作物，為葫蘆科多年生宿根性藤本植物羅漢果的果實，含有三萜、黃酮、木脂素、呋喃、糖類、脂肪酸、甾體等，具有降糖、降脂、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等功效[1-3]。目前，我國對中藥降解乙醇作用的利用研究日益增多，如利用葛花、葛根和枳椇子為原料，得到降解乙醇效果較好的產(chǎn)品，可有效的降低酒精對人體帶來的傷害[4-9]。目前我國市場上的解酒產(chǎn)品，多以對中草藥的開發(fā)為主[10-14]，利用羅漢果內(nèi)生菌進行降解乙醇的研究較少。

植物內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[15-16]，在長期協(xié)同進化過程中，與植物形成和諧共生，互惠互利的關系[17-18]。從羅漢果內(nèi)生菌中，張昌志等[19]篩選出了高效產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶的菌株；范彩琴等[20]篩選出多株具有良好抗氧化活性的菌株；龍楚媚[21]分離得到了一株具有高效降糖活性的菌株，表明羅漢果內(nèi)生菌所產(chǎn)代謝產(chǎn)物具有多重功效。在內(nèi)生菌降解乙醇能力研究方面，高慧[22]從韓國泡菜制品中篩選出一株具有良好降解乙醇能力的厭氧菌；孫志一等[23]從12種中草藥中分離純化得到5株降解乙醇能力較強的芽孢桿菌，展現(xiàn)出內(nèi)生菌降解乙醇的潛力。

因此，本研究通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法從羅漢果中分離內(nèi)生菌，采用測定乙醇耐受性和重鉻酸鉀-硫酸法從中篩選具有降解乙醇能力的菌株，通過形態(tài)觀察及分子生物學技術對其進行鑒定，并以乙醇降解率為評價指標，通過單因素試驗及正交試驗對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化。以期為具有降解乙醇功能的產(chǎn)品提供一個新的途徑，為工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

羅漢果：植株采自廣西桂林市龍勝縣。

1.1.2 主要試劑

重鉻酸鉀（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；葡萄糖、濃硫酸、無水乙醇（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基[20]：土豆200 g，切塊，煮沸30 min，過濾，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L。

發(fā)酵培養(yǎng)基[20]：PDA培養(yǎng)基去除瓊脂。

初篩培養(yǎng)基[21]：硫酸鎂0.3 g、磷酸二氫鉀1.0 g、氯化鈉0.1 g、硫酸銨5 g、氯化鐵0.01 g、瓊脂22 g，蒸餾水定容至1 L，pH=7.0。滅菌完成后，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃，加入8%無水乙醇。

沙氏葡萄糖液體（Sabouraud dextrose broth，SDB）培養(yǎng)基[20]：葡萄糖40 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，麥芽糖5 g，蒸餾水定容至1 L。

沙氏培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose medium with yeast extract，SDY）[20]：葡萄糖40 g，胰蛋白胨10 g，酵母浸膏2 g，氯化鈉0.5g，磷酸二氫鉀0.5g，七水硫酸鎂0.5g，蒸餾水定容至1L。

胨酵母浸膏葡萄糖（peptone yeast extract glucose，PYG）培養(yǎng)基[20]：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L。

以上培養(yǎng)基的滅菌條件均為121℃高壓蒸汽滅菌30min。

1.2 儀器與設備

BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HZ200LB型恒溫搖床、HP400S型生化培養(yǎng)箱：武漢瑞華儀器設備有限責任公司；Infinite M200Pro酶標儀：帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；KQ-500VDE型雙頻數(shù)控聲波清洗器：昆山市超聲器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅漢果內(nèi)生菌分離純化

按參考文獻[24]中的方法對羅漢果組織進行消毒，將處理后的材料剪碎接種到PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長成后，進行分離純化，得到羅漢果內(nèi)生菌株。

1.3.2 乙醇降解菌的初篩

在無菌條件下，用劃線法將菌株接種于初篩培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察菌落生長情況。挑選生長情況良好（即耐受乙醇）的菌株即為初篩菌株。

1.3.3 乙醇降解菌的復篩

將初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量100 mL/250 mL，30 ℃、130 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)5 d，獲得菌株的發(fā)酵液用于復篩。

快速降解乙醇能力的測定：將待測菌株的發(fā)酵液500μL加入含8%乙醇的5mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后37℃水浴反應1h。

緩速降解乙醇能力的測定：將待測菌株的發(fā)酵液500μL分別加入到體積分數(shù)分別為10%和20%乙醇的5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后37 ℃水浴反應24 h。

兩組試驗的對照均為水代替發(fā)酵液，利用重鉻酸鉀-硫酸法[25]測定乙醇的殘留量，計算乙醇降解率，其計算公式如下：

式中：A空白組為空白組的吸光度值，A實驗組為實驗組的吸光度值。

1.3.4 乙醇降解菌的鑒定

形態(tài)學鑒定：采用點植法將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，觀察菌株的菌落大小、顏色及表面形態(tài)。并在光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，對菌株進行初步鑒定。

分子生物學鑒定：菌株送武漢華大基因科技有限公司完成18S rDNA測序，并將該菌株的18S rDNA序列提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用局部序列比對基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源搜索，選取同源性較高的模式菌株的18S rDNA基因序列，應用MEGA軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 乙醇降解菌培養(yǎng)基篩選

種子液的制備：將復篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量250 mL/500 mL，30 ℃、130 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)3 d。

按3%（V/V）的接種量將種子液分別接種于PDA、SDB、SDY、PYG四種液體培養(yǎng)基中，30 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)5 d，測定發(fā)酵液對乙醇的降解率。選取乙醇降解率最佳的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)基優(yōu)化試驗。

1.3.6 菌株降解乙醇發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

將復篩菌株的種子液按3%的接種量接種于最優(yōu)培養(yǎng)基中，裝液量250 mL/500 mL，初始pH值7.0，30 ℃、130 r/min條件下發(fā)酵5 d，測定發(fā)酵液對乙醇的降解率。在此基礎上，依次分別考察接種量（3%、4%、5%、6%、7%）、裝液量（100 mL/500mL、150mL/500mL、200 mL/500 mL、250mL/500 mL、300 mL/500 mL）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、發(fā)酵時間（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）、初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）對乙醇降解率的影響，從而確定最佳發(fā)酵條件。

1.3.7 菌株降解乙醇發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

在單因素研究的基礎上，選擇對試驗結果影響大的因素接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）、裝液量（D），以乙醇降解率作為評價指標進行4因素3水平的正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 菌株G-1降解乙醇發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of ethanol degradation of strain G-1

2 結果與分析

2.1 羅漢內(nèi)生菌分離結果

通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法從羅漢果根、莖和果實等組織中共分離純化得到68株內(nèi)生菌。

2.2 乙醇降解菌株的初篩結果

通過初篩從羅漢果內(nèi)生菌中篩選得到17株對乙醇具有耐受性的菌株，根據(jù)菌株的生長情況從中選取14株菌株進行復篩。

2.3 乙醇降解菌株的復篩結果

由圖1可知，復篩的14株菌株，都具有一定的降解乙醇的能力，綜合比較菌株G-1對乙醇降解效果最好，對體積分數(shù)8%乙醇作用1 h時，乙醇降解率為9.1%；對體積分數(shù)10%乙醇作用24 h時，乙醇降解率為16.7%，對體積分數(shù)20%乙醇作用24 h時，乙醇降解率為13.2%。因此，選擇菌株G-1進行進一步的研究。

圖1 基于重鉻酸鉀-硫酸法乙醇降解菌株的篩選結果Fig.1 Screening results of ethanol-degrading strains by potassium dichromate-sulfuric acid method

2.4 菌株G-1的鑒定

2.4.1 形態(tài)學鑒定

菌株G-1的菌落及細胞形態(tài)見圖2。由圖2可知，在PDA培養(yǎng)基上，菌株G-1菌落表面突起，菌落高3～5 mm，呈絮狀，菌絲呈白色，較為質密；背面為粉白色，略帶有紫色。分生孢子著生于菌絲上，在頂端聚成卵形。

圖2 菌株G-1的菌落（a）及細胞（b）形態(tài)Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphology of strain G-1

2.4.2 分子生物學鑒定

由武漢華大基因科技有限公司測得菌株G-1的18SrDNA基因序列堿基長度為534 bp，經(jīng)過同源性序列檢索，結果顯示菌株G-1與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的18S rDNA序列同源性＞99%。在搜索比對結果中選擇與菌株G-1同源性較高的菌株，建立菌株G-1的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株G-1與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）聚于一支，相似度最高，親緣關系最近。結合菌株G-1的形態(tài)觀察結果和分子生物學鑒定結果，最終確定菌株G-1為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

圖3 基于18S rDNA基因序列菌株G-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain G-1 based on 18S rDNA gene sequences

2.5 菌株G-1降解乙醇培養(yǎng)基的篩選結果

由圖4可知，采用PDA培養(yǎng)基對菌株G-1進行發(fā)酵得到的發(fā)酵液乙醇降解率最高，為21.3%，因此，選擇PDA作為最優(yōu)培養(yǎng)基。

圖4 不同培養(yǎng)基對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.4 Effect of different media on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6 菌株G-1降解乙醇發(fā)酵條件優(yōu)化

2.6.1 接種量對菌株G-1乙醇降解率的影響

由圖5可知，隨著接種量的增大，乙醇降解率呈先升高后降低的趨勢。當接種量為6%時，菌株G-1的乙醇降解率最高，達24.8%。這是因為接種量對菌株的生長和活性物質積累起著重要作用，當接種量＜6%之前，菌株生長和活性物質積累時間過長，效率低下；當接種量＞6%之后，會引起溶氧不足，影響活性物質的產(chǎn)量和產(chǎn)生過多代謝廢物[26]。故確定最佳接種量為6%。

圖5 不同接種量對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.5 Effect of different inoculum on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6.2 裝液量對菌株G-1乙醇降解率的影響

由圖6可知，隨著裝液量的增大，菌株G-1的乙醇降解率呈先升高后下降的趨勢。當裝液量為250 mL/500 mL時，菌株乙醇降解率最高，達25.78%。裝液量通過影響營養(yǎng)物質的含量和菌株需氧量來對菌株的活性進行影響，當裝液量＜250 mL/500 mL之前，可能其菌株積累活性物質所需的營養(yǎng)不足，導致乙醇降解率低；當裝液量＞250 mL/500 mL之后，可能其需氧量不足，菌株生長緩慢，活性物質積累不足[27]。故確定最佳裝液量為250 mL/500 mL。

圖6 不同裝液量對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.6 Effect of different loaded liquid on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6.3 發(fā)酵溫度對菌株G-1乙醇降解率的影響

由圖7可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，菌株G-1的乙醇降解率呈先升高后下降的趨勢。當發(fā)酵溫度為32 ℃時，乙醇降解率最高，可達26.8%。溫度對微生物的影響體現(xiàn)在影響細胞膜的流動性與細胞內(nèi)生物大分子的活性，進而影響細胞的生長代謝。當發(fā)酵溫度＜32 ℃之前，可能達不到菌株生長的最佳溫度，菌株生長效率低；當發(fā)酵溫度＞32 ℃之后，可能過高的溫度對菌株的活性產(chǎn)生了影響，致使其活性物質積累較慢[28]。故確定最佳發(fā)酵溫度為32 ℃。

圖7 不同發(fā)酵溫度對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.7 Effect of different fermentation temperature on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6.4 發(fā)酵時間對菌株G-1乙醇降解率的影響

由圖8可知，隨著發(fā)酵時間的延長，菌株G-1的乙醇降解率呈先升高后降低的趨勢。當發(fā)酵時間為4 d時，菌株G-1的乙醇降解率最高，達24.08%。分析原因可能是隨著發(fā)酵時間的延長，微生物的種群密度和代謝產(chǎn)物也會增加，但隨著營養(yǎng)物質的減少，微生物的種群密度和代謝產(chǎn)物會慢慢減低[28]。故確定最佳發(fā)酵時間為4 d。

圖8 不同發(fā)酵時間對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.8 Effect of different fermentation time on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6.5 初始pH值對菌株G-1乙醇降解率的影響

由圖9可知，隨著初始pH值的增大，菌株G-1的乙醇降解率呈先升高后降低的趨勢。當初始pH值為6.0時，菌株G-1的乙醇降解率最高，達24.34%。分析原因可能是pH值對微生物生命活動的影響較大，當pH值＜6.0之前，環(huán)境對菌株細胞膜通透性產(chǎn)生了較大影響，不利于菌株發(fā)酵；當pH值＞6.0之后，環(huán)境對菌株影響漸漸變大，菌株發(fā)酵等受到了影響，使活性物質積累速率降低[28]。故確定最佳初始pH值為6.0。

圖9 不同初始pH值對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.9 Effect of different initial pH value on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6.6 菌株G-1降解乙醇發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果

采用PDA培養(yǎng)基，在單因素試驗的基礎上，確定初始pH值為6.0，選擇接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）、裝液量（D）為影響因素，以乙醇降解率為評價指標，采用L9（34）正交設計研究不同因素對乙醇降解率的影響，正交試驗結果與分析見表2。

表2 菌株G-1降解乙醇發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Design and results of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of ethanol degradation of strain G-1

由表2可知，根據(jù)極差分析，各因素影響菌株G-1乙醇降解能力的強弱順序為A＞C＞B＞D，說明接種量對試驗結果的影響最大，其次是發(fā)酵時間。各因素最優(yōu)水平為A3B3C1D1，即接種量7%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間3 d、裝液量200 mL/500 mL。

2.6.7 驗證試驗結果采取優(yōu)化后的培養(yǎng)條件對菌株G-1進行發(fā)酵，重復試驗3次，測得乙醇降解率為29.77%，是優(yōu)化前的2.2倍。

3 結論

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法從羅漢果中分離得到68株內(nèi)生菌，通過測定乙醇耐受性和重鉻酸鉀-硫酸法篩選得到了一株具有降解乙醇能力的菌株G-1，經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。通過單因素試驗和正交試驗得出菌株G-1降解乙醇的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基，初始pH值6.0，接種量7%，裝液量200 mL/500 mL，發(fā)酵溫度32 ℃，130 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d。在此優(yōu)化條件下，菌株G-1的乙醇降解率為29.77%，是優(yōu)化前的2.2倍。