曹愛(ài)霖，王學(xué)彬，王 卓*，徐 寧

(1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院新藥開(kāi)發(fā)研究所，杭州 310014；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

治療藥物監(jiān)測(cè)(therapeutic drug monitoring,TDM)是通過(guò)測(cè)定血藥濃度并觀察藥物臨床治療效果，根據(jù)藥動(dòng)學(xué)原理調(diào)整給藥方案，從而達(dá)到理想治療效果的一種方法。目前臨床主要針對(duì)具有治療指數(shù)窄、個(gè)體間血藥濃度差異大、非線性藥動(dòng)學(xué)特征等特點(diǎn)的藥物開(kāi)展TDM。

他克莫司(tacrolimus，又稱(chēng)FK506)是從鏈霉素屬分離提取的強(qiáng)效免疫抑制性二十三元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，口服吸收后，血漿中游離的他克莫司會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)至T細(xì)胞，最終形成他克莫司-他克莫司結(jié)合蛋白-Ca2+-鈣調(diào)蛋白-鈣調(diào)磷酸酶的五聚物發(fā)揮藥理作用[1]，產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫抑制作用，臨床主要用于預(yù)防腎臟、肝臟等器官移植術(shù)后的排異反應(yīng)。目前，國(guó)際最新指南均強(qiáng)烈推薦腎臟移植患者術(shù)后長(zhǎng)期使用包含鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor，CNI)的免疫抑制方案，其中首推他克莫司[2-3]。他克莫司在體內(nèi)分布廣泛、清除率低，口服后需要數(shù)天時(shí)間達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，并且治療窗窄，低濃度下易出現(xiàn)排異反應(yīng)，高濃度時(shí)腎毒性和神經(jīng)毒性增加[4]，即使血藥濃度在治療窗內(nèi)，患者也常發(fā)生腎毒性、消化系統(tǒng)不適等藥品不良反應(yīng)。他克莫司在不同器官移植患者的藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)有明顯個(gè)體差異，給臨床治療時(shí)的藥物劑量調(diào)整帶來(lái)難度，因此選擇合適的方法對(duì)他克莫司開(kāi)展TDM，獲得精準(zhǔn)的血藥濃度，顯得尤為重要。

1 他克莫司的體內(nèi)分布

他克莫司口服后經(jīng)胃腸道吸收，生物利用度為20%～25%，吸收后呈雙相分布，因其可與紅細(xì)胞廣泛結(jié)合，紅細(xì)胞中的他克莫司濃度平均可達(dá)血漿濃度的約15倍，比值受紅細(xì)胞比容、血漿蛋白和他克莫司濃度影響。血漿中98.8%的他克莫司與血漿蛋白結(jié)合，主要結(jié)合血清白蛋白和α-1-酸性糖蛋白；紅細(xì)胞內(nèi)的他克莫司并不與血紅蛋白結(jié)合，而是與他克莫司結(jié)合蛋白(FK506-binding proteins，F(xiàn)KBP)結(jié)合(主要是FKBP-12)，且紅細(xì)胞對(duì)他克莫司的攝入會(huì)因他克莫司濃度的升高而出現(xiàn)飽和。他克莫司在血漿中與血漿蛋白的結(jié)合同樣存在飽和現(xiàn)象[4]。

他克莫司的高血漿蛋白結(jié)合率使得其半衰期長(zhǎng)而清除率低，但不同的人群會(huì)出現(xiàn)藥物體內(nèi)分布的差異，如妊娠期婦女會(huì)因血漿蛋白和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)降低而出現(xiàn)游離的他克莫司比例升高及他克莫司清除率升高的情況[5]。

2 他克莫司的體內(nèi)代謝

他克莫司的代謝主要依賴(lài)肝臟及腸壁內(nèi)的CYP3A4和CYP3A5，代謝產(chǎn)生至少15種甲基化、羥基化或去甲基化的代謝產(chǎn)物，以13-O-去甲基他克莫司(M-Ⅰ)和15-O-去甲基他克莫司(M-Ⅲ)為主，其中M-Ⅰ的藥理活性為他克莫司的10%，而31-O-去甲基他克莫司(M-Ⅱ)雖然活性與他克莫司相似，但體內(nèi)含量幾乎難以檢測(cè)[5]。

3 他克莫司血樣的穩(wěn)定性

目前，臨床檢測(cè)他克莫司濃度的樣本主要是全血，血樣的穩(wěn)定性決定了后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的精確度和準(zhǔn)確性。他克莫司全血樣本在22 ℃或4 ℃可以保存14 d，在-20 ℃可以保存1個(gè)月，在-70 ℃可保存1年[6-7]；代謝產(chǎn)物M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅲ在室溫下可以保存3 d，-20 ℃可以保存1個(gè)月，-80 ℃可保存1年[6,8]。反復(fù)凍融3次并不會(huì)大幅度影響定量檢測(cè)結(jié)果，但-80 ℃保存6個(gè)月以上會(huì)使樣本中的游離他克莫司濃度增加30%[5]。因此，臨床檢驗(yàn)窗口在收到患者的血樣后應(yīng)及時(shí)處理和檢測(cè)，如需長(zhǎng)期保存，應(yīng)在冷藏30 min后再進(jìn)行冷凍保存。

4 他克莫司目前常用檢測(cè)方法

因?yàn)樗四驹谘獫{中和紅細(xì)胞中與血漿蛋白的結(jié)合是非線性的，單純測(cè)紅細(xì)胞中或者血漿中的他克莫司濃度并不能反映他克莫司的真實(shí)濃度，他克莫司的全血濃度更能反映臨床事件，因此必須要檢測(cè)其全血濃度[9]，且檢測(cè)過(guò)程中需要對(duì)血樣進(jìn)行破紅細(xì)胞處理。

他克莫司在全血中的治療濃度區(qū)間為5～20 μg/L，在全血的檢測(cè)限為0.5～1 μg/L[10]。研究者在近30年開(kāi)發(fā)出多種他克莫司的血藥濃度檢測(cè)方法(見(jiàn)表1)，主要分為三大類(lèi)：一是色譜法，主要是LC-MS/MS法；二是免疫法，包括化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法、酶放大免疫檢測(cè)法等；三是基于微采樣等新技術(shù)的檢測(cè)法，主要是體積吸收微采樣聯(lián)合液質(zhì)法等。

表1 不同他克莫司血藥濃度檢測(cè)方法比較Table 1 Comparison of different detection methods of tacrolimus in blood

4.1 LC-MS/MS法 LC-MS/MS法是檢測(cè)免疫抑制藥物血藥濃度的金標(biāo)準(zhǔn)[10]，此方法有更高的靈敏度和特異性、更低的檢測(cè)限和定量限，通過(guò)檢測(cè)質(zhì)荷比(m/z)進(jìn)行定量。與免疫法相比，LC-MS/MS法更易區(qū)分待測(cè)物與結(jié)構(gòu)相似的代謝物。DUBBELBOER等[6]成功建立并驗(yàn)證了他克莫司及其代謝物M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅲ的LC-MS/MS定量分析方法，待測(cè)血樣需要經(jīng)過(guò)蛋白沉淀劑和固相萃取(solid-phase-extraction，SPE)處理，因?yàn)榇朔椒ū苊饬舜x產(chǎn)物對(duì)他克莫司檢測(cè)的干擾，故檢測(cè)出來(lái)的血藥濃度略低于免疫化學(xué)法的檢測(cè)結(jié)果。Lee等[11]報(bào)道了一種UPLC-MS法，可以同時(shí)快速測(cè)量全血中的環(huán)孢素和他克莫司，適合治療濃度區(qū)間較大的免疫抑制劑。SALLUSTIO等[12]研究表明，在定量檢測(cè)全血中他克莫司濃度時(shí)，與免疫法和常規(guī)HPLC法相比，LC-MS/MS法在重復(fù)性和精確性方面有顯著優(yōu)勢(shì)。

然而，LC-MS/MS法的缺點(diǎn)也很明顯，主要包括檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、儀器昂貴、血樣需要經(jīng)過(guò)預(yù)處理、血樣需要集中到有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室(如中心實(shí)驗(yàn)室)進(jìn)行測(cè)定。

4.2 化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法 化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)(chemiluminesent microparticle immunoassay，CMIA)法是近十年發(fā)展起來(lái)的一種免疫分析技術(shù)，利用免疫反應(yīng)的特異性和化學(xué)發(fā)光的高敏感性，以測(cè)量吖啶酯標(biāo)記物在堿性介質(zhì)中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光子量為基礎(chǔ)，以類(lèi)磁顆粒作為包被載體[13]。類(lèi)磁顆粒的作用主要是增加反應(yīng)的表面積，提高反應(yīng)靈敏度，縮短反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)過(guò)程中采用磁力吸附分離，沖洗徹底，因而具有更高的特異性。CMIA法在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用廣泛，可實(shí)現(xiàn)多樣本、多品種同時(shí)檢測(cè)，目前主要利用雅培公司生產(chǎn)的Architect系列機(jī)型實(shí)現(xiàn)血樣檢測(cè)，全血樣品中他克莫司的濃度在1～15 ng/ml范圍內(nèi)，CMIA法和金標(biāo)準(zhǔn)LC-MS/MS法的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性較好[14]。金瑛等[15]收集了581份全血樣本，分別用LC-MS/MS法和CMIA法進(jìn)行他克莫司濃度檢測(cè)，結(jié)果顯示CMIA法檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.902 4，相關(guān)性良好，結(jié)果重復(fù)性好，但大量樣本的CMIA法檢測(cè)結(jié)果平均值略高于LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果[(9.21±3.65) ng/mlvs(6.30±2.69) ng/ml]。

4.3 酶放大免疫檢測(cè)法 酶放大免疫檢測(cè)(enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT)法，又稱(chēng)為酶增強(qiáng)免疫檢測(cè)技術(shù)，于1972年由RUBENSTEIN首先提出，1974年應(yīng)用于苯妥英鈉TDM項(xiàng)目，1990年開(kāi)始應(yīng)用于免疫抑制劑的檢測(cè)[16]。EMIT法的原理是受檢品中的藥物和試劑中用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)標(biāo)記的藥物競(jìng)爭(zhēng)定量的抗體結(jié)合位點(diǎn)，酶標(biāo)記的藥物與抗體結(jié)合后將喪失活性，存留下來(lái)的具有活性的酶將抗體試劑中的煙酰胺嘌呤二核苷酸(NAD)轉(zhuǎn)化為還原態(tài)(NADH)，從而導(dǎo)致吸光度的改變。酶濃度的變化反映了待測(cè)樣品中藥物的濃度[17]。

隨著EMIT法的廣泛應(yīng)用，其缺點(diǎn)也逐步顯現(xiàn)出來(lái)。研究顯示，在應(yīng)用EMIT法檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果會(huì)因樣本中存在某些與待測(cè)藥物有相似結(jié)構(gòu)的抗原而出現(xiàn)交叉反應(yīng)，從而使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差[18]。SAINT-MARCOUX等[19]分別采用EMIT、CMIA和LC-MS/MS法檢測(cè)45例腎移植術(shù)后患者的他克莫司血藥濃度和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示，EMIT法和CMIA法檢測(cè)的平均濃度分別比LC-MS/MS法檢測(cè)的平均濃度高15%和11%，且在3.0～5.0 ng/ml濃度范圍內(nèi)的樣本檢測(cè)結(jié)果并不可靠[5]。但是，EMIT法相對(duì)于微粒酶免疫分析法前處理時(shí)間更短，且可實(shí)現(xiàn)單樣本檢測(cè)，而檢測(cè)結(jié)果相似[20]。

4.4 微粒酶免疫分析法 微粒酶免疫分析(microparticles enzyme immunoassay,MEIA)法所用儀器為雅培公司的全自動(dòng)免疫分析儀(IMx)，操作方便，檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果可迅速反饋臨床，但專(zhuān)一性不強(qiáng)，易與代謝產(chǎn)物發(fā)生免疫反應(yīng)，從而使監(jiān)測(cè)結(jié)果發(fā)生偏差[13]，且不同批次試劑盒差異較大，更換試劑盒需重新制作質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)分布圖，以便校正測(cè)定結(jié)果[21]。李鵬飛等[22]利用IMx儀器和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)他克莫司全血樣品進(jìn)行了798例次的濃度測(cè)定，結(jié)果顯示，MEIA法測(cè)定心、肺、肝、腎移植患者的他克莫司濃度分別比LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果高9.9%、13.2%、13.1%和18.2%，并且由于他克莫司個(gè)體藥動(dòng)學(xué)差異大，這種偏差很難控制在一定范圍內(nèi)。目前MEIA的試劑盒已經(jīng)停產(chǎn)，雅培公司生產(chǎn)的Architect系列機(jī)型已全面取代IMx用于臨床檢測(cè)。

4.5 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)他克莫司的早期用法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠有效保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，ELISA法操作簡(jiǎn)便，所需設(shè)備少，能夠快速檢測(cè)全血中他克莫司的濃度。平行對(duì)照研究[23]顯示，ELISA法檢測(cè)的他克莫司血藥濃度與LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果存在一定的相關(guān)性，ELISA法的測(cè)定結(jié)果要普遍高于LC-MS/MS法的測(cè)定結(jié)果(AUC0～24 h高20.1%)。在較高質(zhì)量濃度組(≥10 ng/ml)，兩種檢測(cè)方法結(jié)果的偏差與ELISA法的試劑與他克莫司在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物發(fā)生交叉反應(yīng)，干擾檢測(cè)結(jié)果有關(guān)。此外，ELISA法檢測(cè)他克莫司還受患者肝功能的影響[24]，與肝功能正常的患者相比，肝功能損傷患者的檢測(cè)結(jié)果偏高。分析原因是損傷的肝功能影響了他克莫司在肝臟的代謝，蓄積的他克莫司代謝產(chǎn)物對(duì)ELISA法檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾，使結(jié)果偏高。

4.6 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法 電化學(xué)發(fā)光免疫分 析(electrochemiluminescent immunoassay,ECLIA)法由羅氏診斷產(chǎn)品有限公司研發(fā)，借助于電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀(cobase 411等)實(shí)現(xiàn)了他克莫司全血濃度檢測(cè)。其檢測(cè)原理為標(biāo)記在抗體上的化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+與電子供體三丙胺在陽(yáng)電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng),生成三價(jià)的吡啶釕[Ru(bpy)3]3+，后被還原形成激發(fā)態(tài)的二價(jià)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+*，激發(fā)態(tài)的二價(jià)吡啶釕衰減成基態(tài)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+時(shí),會(huì)發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)為620 nm的光子，周而復(fù)始，被信號(hào)接收器捕獲[25]。該方法于2014年被引入國(guó)內(nèi)，小范圍應(yīng)用于臨床環(huán)孢素和他克莫司的TDM，具有檢測(cè)范圍廣、精密度高、結(jié)果與LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性好、檢測(cè)速度快等優(yōu)勢(shì)，但是也有檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。SHIPKOVA等[26]針對(duì)ECLIA法測(cè)定他克莫司全血濃度與LC-MS/MS法作了頭對(duì)頭研究，結(jié)果顯示ECLIA法的測(cè)定結(jié)果與LC-MS/MS法存在11%的偏差，可能是標(biāo)記抗體與活性代謝物M-Ⅱ相互作用所致。2018-01-03羅氏診斷產(chǎn)品有限公司在國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)官網(wǎng)上發(fā)布了對(duì)電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀(cobas 8000)的主動(dòng)召回公告，原因是儀器在極少數(shù)情況下會(huì)出現(xiàn)核心模塊自動(dòng)將控制單元軟件的系統(tǒng)設(shè)置重置為默認(rèn)值，導(dǎo)致數(shù)據(jù)不匹配。

4.7 體積吸收微采樣聯(lián)合液質(zhì)法 體積吸收微采樣(volumetric absorptive microsampling,VAMS)技術(shù)[27]是Neoteryx公司研發(fā)的，可以克服血細(xì)胞比容對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響的微創(chuàng)采樣技術(shù)。患者在家中利用微型取樣器采集指尖血，儲(chǔ)存在VAMS裝置中，送到實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)用50%甲醇溶液、0.2和0.5 mol/L的硫酸鋅甲醇溶液進(jìn)行萃取，然后經(jīng)渦旋、聲波降解等步驟處理，最后使用LC-MS/MS法進(jìn)行定量檢測(cè)。VAMS技術(shù)可以讓患者在家中就實(shí)現(xiàn)血液采集，方便、微創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)，且儲(chǔ)存在VAMS裝置中的他克莫司全血樣品在43 h內(nèi)穩(wěn)定可靠[27]。目前，VAMS技術(shù)聯(lián)合LC-MS/MS法檢測(cè)他克莫司血藥濃度尚不成熟，檢測(cè)結(jié)果的可信度有待進(jìn)一步研究。

4.8 生物傳感器技術(shù) 生物傳感器技術(shù)(biosensors techniques)自首次報(bào)道至今已有近60年的歷史，目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境衛(wèi)生等領(lǐng)域，主要依靠換能器表面的生物分子受體與待測(cè)分析物的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)[28]。依據(jù)設(shè)計(jì)不同，傳感器可以分為光學(xué)傳感器技術(shù)(如表面等離子共振光譜、表面增強(qiáng)拉曼光譜等)、機(jī)械傳感器技術(shù)(如石英晶體微天平等)和電化學(xué)傳感器技術(shù)。在TDM領(lǐng)域，生物傳感器技術(shù)主要用于抗腫瘤藥甲氨蝶呤和氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的檢測(cè)，但鮮有關(guān)于免疫抑制劑的報(bào)道[29]。生物傳感技術(shù)雖然具有敏感度高、選擇性高的優(yōu)勢(shì)，但也存在標(biāo)準(zhǔn)化程度不夠、可控性差等劣勢(shì)[28]，這些劣勢(shì)限制了其在免疫抑制劑血藥濃度檢測(cè)中的應(yīng)用由實(shí)驗(yàn)室走向臨床的腳步，但隨著納米生物傳感技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用日趨成熟，在不久的將來(lái)，有望實(shí)現(xiàn)他克莫司的快速、精確檢測(cè)。

4.9 膠乳增強(qiáng)免疫比濁法 上海云澤生物科技有限公司于2018年申請(qǐng)了基于高靈敏度膠乳增強(qiáng)免疫比濁法(latex-enhanced immunoturbidimetry)測(cè)定全血樣品中他克莫司濃度的發(fā)明專(zhuān)利[30]，主要檢測(cè)原理是將他克莫司抗體交聯(lián)在聚苯乙烯乳膠微球表面，與他克莫司蛋白復(fù)合物反應(yīng)，帶動(dòng)聚苯乙烯微球聚集，產(chǎn)生一定濁度，而全血中的他克莫司競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合聚苯乙烯微球表面的單克隆抗體，此時(shí)的濁度與全血中的他克莫司濃度成反比，從而利用全自動(dòng)生化儀在400～800 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)他克莫司濃度。該方法于2020年1月授權(quán)公開(kāi)，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

5 小 結(jié)

他克莫司自20世紀(jì)90年代初研發(fā)問(wèn)世至今已有30年，目前有完全取代環(huán)孢素臨床地位的趨勢(shì)，但他克莫司和環(huán)孢素一樣，在臨床應(yīng)用時(shí)也需要定期監(jiān)測(cè)血藥濃度，依據(jù)血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果并結(jié)合臨床表現(xiàn)來(lái)調(diào)整用藥劑量。他克莫司的血藥濃度檢測(cè)方法經(jīng)歷了更新?lián)Q代，檢測(cè)方法的進(jìn)步為個(gè)體化醫(yī)療服務(wù)提供了技術(shù)保障，對(duì)促進(jìn)臨床合理用藥有重要意義。雖然LC-MS/MS法仍然是檢測(cè)他克莫司血藥濃度的金標(biāo)準(zhǔn)，但在精準(zhǔn)檢測(cè)血藥濃度的同時(shí)，如果可以兼顧快速、便捷，將有助于提高患者的依從性，為臨床安全用藥提供幫助。新一代的檢測(cè)技術(shù)如微流控芯片技術(shù)、拉曼光譜技術(shù)[33]等已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室取得了初步成果，如果能成功走向臨床，必將為患者提供更好的就診體驗(yàn)。